邱旻+陳清+柯雪梅

[摘要]擬釘螺亞科內(nèi)物種是多種并殖吸蟲及亞洲組血吸蟲的中間宿主，對其進行準確的分類鑒定對防控相關寄生蟲病有重要作用。然而受限于個體小、形態(tài)特征不明顯等問題，傳統(tǒng)方法難以對擬釘螺亞科內(nèi)物種作出準確的鑒定。隨著近年分子生物學及生物信息學相關技術的高速發(fā)展，基因鑒定法變得日趨成熟，這使得快速、準確的鑒定擬釘螺亞科物種成為了可能。本文回顧了近年來基因鑒定法中常用的基因片段及其在擬釘螺亞科分類鑒定方面的應用情況，討論了目前應用中存在的問題并提出了未來進一步的研究方向。

[關鍵詞]擬釘螺亞科；物種鑒定；基因鑒定；寄生蟲病

[中圖分類號] R383.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（a）-0011-04

Application progress of gene identification technology in species identification of Triculinae

QIU Min1 CHEN Qing1 KE Xue-mei2

1.Department of Public Health，Southern Medical University in Guangdong Province，Guangzhou 510515，China；2.Xiamen Center for Disease Control and Prevention in Fujian Province，Xiamen 361021，China

[Abstract]Triculinae is known to be the intermediate host of Paragonimus and Asian Schistosomes，and the accuracy of identification result of Triculinae is essential for the control of parasitic diseases caused by Paragonimus and Asian Schistosomes.Due to its small size and lack of significant appearance feature，it′s hard to identify Triculinae accurately.With the development of molecular biology and bioinformatics，it is possible to identify Triculinae species using genetic method now.This paper reviews gene segements frequenctly used in species identification and their application to Triculinae identification，and discusses the obstacle for further use.

[Key words]Triculinae；Species identification；Genetic method；Parasitic diseases

擬釘螺亞科（Triculinae）隸屬于腹足綱（Gastropoda）前鰓亞綱（Prosobranch）圓口螺科（Pomatiopsidae），主要分布于東南亞和中國南部[1]。目前該亞科內(nèi)的物種已達120種[2]，我國目前發(fā)現(xiàn)的擬釘螺亞科物種已有近50種之多，其中絕大多數(shù)屬于擬釘螺屬，主要分布在長江流域地區(qū)及其以南的地區(qū)。在所有擬釘螺物種中，擬釘螺屬（Tricula）、γ擬釘螺屬（Gammatricula）以及新擬釘螺屬（Neotricula）因可做為多種并殖吸蟲[3-7]和（或）亞洲組血吸蟲[8-10]的中間宿主而備受研究者關注。然而，擬釘螺作為一種個體微小的淡水螺，很難依據(jù)其外殼及唇舌等形態(tài)學特征對其作出較為準確的分類，為傳染病防控工作者對相關的寄生蟲病的宿主監(jiān)測及防控工作帶來了巨大的困難。

近20年來，分子生物學技術和生物信息學技術得到了長足的發(fā)展，獲得生物體的遺傳物質(zhì)并測定基因序列，進而對序列進行比較分析變得越來越簡便易行，這為從分子水平研究物種的分類提供了充分的技術可能[11]。因此，結合了兩者的分子系統(tǒng)發(fā)生學得到了高速的發(fā)展，越來越多的學者開始使用系統(tǒng)發(fā)生學的研究方法檢驗分類學假說并獲得更可靠的分類結果[12-15]。而由此誕生的龐大生物遺傳信息數(shù)據(jù)庫，又為物種的快速鑒定提供了可能。本文擬對相關技術在擬釘螺亞科物種鑒定上的應用情況作一綜述，希望通過總結目前相關技術的應用情況發(fā)現(xiàn)目前存在的問題以理清當前的工作要點，更好地將技術應用于實踐。

1常見的鑒定用基因

1.1 COⅠ基因

COⅠ基因全稱Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ gene，其位于生物線粒體基因組上，是編碼細胞色素C氧化酶亞單位1的基因。與核基因組比較，其具有高拷貝，進化速率較快、群體內(nèi)變異大、無組織特異性等特點[16]。COⅠ基因并不是最早被應用于分子鑒定的基因，但其在各種動物鑒定中應用己相當廣泛。加拿大奎爾夫大學的Hebert等[17]最早于2003年提出了DNA條碼（DNA Barcode）的概念，其認為在數(shù)據(jù)庫完備的情況下，基于COI基因的比對分析可快速準確地鑒定出DNA來源的物種，因此COI可以作為理想的動物DNA條碼應用于實際的動物物種鑒定工作中。在其后的幾年中，各國學者對COI基因鑒定動物物種的可能性進行了進一步的研究[18-20]，并成立了國際生物條碼計劃（the internnational barcode of life project，iBOL）、生物條碼協(xié)會（the consortium for barcode of life，CBOL）以及生物條碼數(shù)據(jù)庫（barcode of life database，BOLD）。目前，BOLD中已經(jīng)收集了包括動物、植物、真菌以及單細胞生物中共計260 135個物種的DNA條碼[21]，其收錄內(nèi)容已不限于初創(chuàng)時的COI基因，亦涵蓋其他常見的鑒定用基因，適應不同種類物種的鑒定需求。同時，該數(shù)據(jù)庫還同時收錄標準的PCR擴增引物，以供研究者參考選用。

1.2 CytB基因

與COI基因類似，CytB基因亦為位于生物線粒體基因組上的基因，其全稱為Cytochrome B gene，編碼有氧呼吸環(huán)中不可缺少的細胞色素B。同樣，CytB基因也被廣泛應用于各種各樣的動物分類鑒定中，并且時常被用來與COI基因鑒定的結果作出比較或者同時使用兩種基因進行聯(lián)合鑒定[22-25]。目前，可在BOLD及GenBank上查詢到各種物種的CytB信息。

1.3 rRNA基因

rRNA基因又稱rDNA，是一系列種普遍存在于各種細胞內(nèi)的基因，功能為編碼rRNA。rRNA是核糖體的重要構成成分，其根據(jù)核糖體大小亞基的分別及真核、原核的差異可分為很多種，也就對應有多種rRNA基因。其中最常被用作鑒定是構成核糖體小亞基的18s rRNA基因（位于核基因組）及16s rRNA基因（位于線粒體基因組及細菌基因組）。構成大亞基的28s及23s雖也有使用，但并不如小亞基（18s/16s）多。rRNA基因具有多個高變及保守的區(qū)域，保守區(qū)在不同的物種間高度保守，而高變區(qū)在不同的物種間則存在顯著差異，因此rRNA基因可為分類鑒定提供豐富的信息[26-27]。這些基因除被廣泛用于動物植物的分類鑒定外，還常用于各種微生物的研究。數(shù)據(jù)庫方面，除可在Genbank及BLOD上獲取相關數(shù)據(jù)外，還有專門收集微生物數(shù)據(jù)庫rRNA基因的數(shù)據(jù)庫可供查詢。如專門收錄細菌rRNA基因數(shù)據(jù)的Greengenes[28]數(shù)據(jù)庫與RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫[29]。這些數(shù)據(jù)庫不僅可以提供相關的數(shù)據(jù)的比對結果，還可直接在線進行rRNA序列的系統(tǒng)進化分析。

1.4 ITS序列

ITS全稱Internal Transcribed Spacer，即內(nèi)轉錄間隔區(qū)。該區(qū)域位于rRNA基因內(nèi)編碼大小亞基的區(qū)域之間，是rRNA前體轉變?yōu)閞RNA時被剪切掉的部分，故ITS實際上是完整rRNA基因的一部分[30]。在真核生物中，ITS被5.8s rRNA基因分割為ITS1及ITS2兩段，而在原核生物鐘ITS僅有一段。該區(qū)域的特點是拷貝數(shù)高，變異較大，在實際的使用過程中可與前述的18s/16s rRNA基因一同使用，即先分析18s/16s rRNA基因進行初步判定，再通過分析ITS細分到種或者亞種。與rRNA基因類似，除GenBank及BOLD這種通用數(shù)據(jù)庫外，還有一些專門收錄ITS序列的數(shù)據(jù)庫，如UNITE[31]這種專門收錄真菌ITS序列的數(shù)據(jù)庫。

1.5其他基因

除上述使用簡便且廣泛、通用性較高的幾種DNA鑒定標記外，亦存在其他的鑒定標記。如在進行細菌分類鑒定時使用的管家基因序列[32]；對植物進行分類時可能會使用的位于葉綠體上的RbCL基因（RuBisCO large subunit gene，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基基因）[33]等。這些基因數(shù)據(jù)均可從Genbank或相關的專門數(shù)據(jù)庫獲取。

2國內(nèi)外基因鑒定在法擬釘螺亞科內(nèi)的應用現(xiàn)狀

早在DNA條碼提出之前的1994年，Davis等[34]就開始采用COI基因作為標記，嘗試結合解剖學及DNA信息以對圓口螺科內(nèi)幾種重要物種進行更精確的分類。其采集選取了圓口螺科中釘螺亞科和擬釘螺亞科下的部分屬的物種（包釘螺、新擬釘螺及γ擬釘螺），觀察標本的形態(tài)學及解剖學特征，比使用PCR的手法從螺體DNA中擴增出長度為598 bp的片段用于系統(tǒng)進化分析。這項結果顯示，圓口螺科下的不同亞科內(nèi)的物種在解剖學特征上有明顯的差異，并且對COI基因進行的系統(tǒng)進化分析結果支持差異的存在，故認為圓口螺科下的亞科分類是可靠的。

Attwood等[35]在2004年使用16s rRNA及28s rRNA基因序列對圓口螺科內(nèi)的9個物種（多數(shù)為擬釘螺屬下物種）進行了比較與研究。結果顯示，使用不同的系統(tǒng)進化分析方法分別對16s rRNA基因數(shù)據(jù)及18s rRNA基因數(shù)據(jù)進行分析可得到一致的結果，但16s rRNA基因與18s rRNA基因的結果間存在明顯的差異，研究者認為這可能是湄公河流域周圍的環(huán)境不太穩(wěn)定，地區(qū)內(nèi)存在長期且快速的種群交換，使同一種群內(nèi)不同個體間存在著較大的差異。

關飛等[36]于2007～2009年從我國各地采集了12株不同的擬釘螺亞科樣本，在經(jīng)過初步的形態(tài)學鑒定后，從樣本中提取總DNA，進而擴增樣本的COI基因、16s rRNA基因、28s rRNA基因以及ITS1區(qū)域并進行測序與分析。其研究結果顯示，COI、16s、28s中，COI變異性最大而28s最保守，三種基因分別適用于低階、中階以及高階的遺傳多樣性分析。同時，研究還驗證了引入其二級結構特征可以使ITS1序列分析結果更為可靠的觀點。另外，在結合形態(tài)學信息以及基因分析的結果進行綜合分析后，研究還發(fā)現(xiàn)采自湖北沈家堡的齒擬釘螺與小口擬釘螺應分別為秉氏和向氏擬釘螺，而這兩種擬釘螺在基因序列上高度相似（達99%），應考慮為同一物種下的不同地域株。

Liu等[2]在2014年開展了一項基于COI及rrnL兩個基因片段的研究，研究中參照圓口螺科分布的生態(tài)地理特點，盡可能地獲取了各種圓口螺科內(nèi)物種的基因序列以進行系統(tǒng)進化分析。分析結果顯示擬釘螺屬與新擬釘螺屬不為并系進化，同時推測越南背部的擬釘螺亞科物種很可能來源于我國云南或福建的γ擬釘螺。

3目前存在的問題和未來展望

與傳染血吸蟲的釘螺類似，擬釘螺亞科的分類鑒定的研究經(jīng)歷了一個相當漫長的過程，從最初的形態(tài)學到種群遺傳學再到今天的分子生物學及生物信息學，在新的研究方法的幫助下，擬釘螺亞科內(nèi)物種間的關系有望變得越來越清晰。但是從目前的情況來看，仍有許多問題亟待解決。

作為一種相對成熟的物種分類鑒定研究手段，基因鑒定技術已被廣泛的應用于各個學科的多種方面，然而在擬釘螺亞科的研究中，相關的報道還明顯非常少。即使與同樣研究不算充分的釘螺相比較，擬釘螺亞科的相關研究明顯更不充分，僅處于剛剛起步的階段。其次，目前已見諸報道的研究較為簡單，多數(shù)僅選擇了1～2個基因進行研究，樣本的來源范圍以及樣本的代表性都有待進一步提升。目前，被報道過的擬釘螺亞科物種雖多達120種，但在NCBI Taxonomy數(shù)據(jù)庫中記錄在案的僅有47種，這些物種中，大多數(shù)僅收錄了10條以內(nèi)的參考序列，可用數(shù)據(jù)可謂相當匱乏。而基于測序的基因鑒定方法的準確性又在很大程度上依賴于參考數(shù)據(jù)庫的準確以及完備[37]。因此，相關數(shù)據(jù)庫仍亟待完善。

基于基因測序的基因鑒定法已在許多研究領域成為了重要的分類鑒定研究方法，可以預見，隨著擬釘螺亞科相關研究的進一步開展以及相關資料的逐漸完善，這種方法必將在擬釘螺的研究及防控工作中發(fā)揮更加重要的作用。

[參考文獻]

[1]關飛，牛安歐.擬釘螺及其傳播的血吸蟲的種系發(fā)生[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志，2009，36（6）：412-416.

[2]Liu L，Huo G，He H，et al.A phylogeny for the pomatiopsidae （Gastropoda：Rissooidea）：a resource for taxonomic，parasitological and biodiversity studies[J].BMC Evol Biol，2014， 14（1）：29.

[3]胡文慶，周世祜，龍祖培.異盤并殖吸蟲第一中間宿主的發(fā)現(xiàn)[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，1994，12（1）：36-38.

[4]楊照青，夏代光.豐宮并殖吸蟲毛蚴感染兩種擬釘螺的實驗研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，1992，10（1）：75-76.

[5]何剛，韋美璧，李樹林，等.以巨睪并殖吸蟲毛蚴感染擬釘螺的實驗觀察[J].廣西預防醫(yī)學，1995，1（6）：348-349.

[6]郭源華，陳溥林，顧金榮.云南省擬釘螺作為貍殖吸蟲與血吸蟲中間宿主的研究[J].武夷科學，1992，9（1）：277-282.

[7]程由注，吳小平，李莉莎，等.斯氏并殖吸蟲第一中間宿主擬釘螺屬一新種記述（中腹足目，蓋螺科）[J].海洋科學，2009，33（10）：97-99.

[8]郭源華，顧金榮，陳溥林，等.擬釘螺及其有關血吸蟲的研究[J].中國血吸蟲病防治雜志，1989，1（1）：22-27.

[9]Madsen H，Hung NM.An overview of freshwater snails in Asia with main focus on Vietnam[J].Acta Tropica，2015，1（140）：372-384.

[10]Attwood SW，Upatham ES.A population growth trend analysis for Neotricula aperta，the snail intermediate host of Schistosoma mekongi，after construction of the Pak-Mun dam[J].PLoS Negl Trop Dis，2013，7（11）：e2539.

[11]Das S，Dash HR，Mangwani N，et al.Understanding molecular identification and polyphasic taxonomic approaches for genetic relatedness and phylogenetic relationships of microorganisms[J].J Microbiol Method，2014，8（103）：80-100.

[12]Attwood SW，Ibaraki M，Saitoh Y，et al.Comparative phylogenetic studies on schistosoma japonicum and its snail intermediate host oncomelania hupensis：origins，dispersal and coevolution[J].PLoS Negl Trop Dis，2015，9（7）：e3935.

[13]Arquez M，Colgan D，Castro LR.Sequence and comparison of mitochondrial genomes in the genus Nerita （Gastropoda：Neritimorpha：Neritidae） and phylogenetic considerations among gastropods[J].Mar Genomics，2014，6（15）：45-54.

[14]林睿，黎學銘，胡纓，等.廣西、湖南、云南三地釘螺Cytb基因序列變異和系統(tǒng)進化研究[J].中國病原生物學雜志，2008，3（2）：110-113.

[15]胡纓，黎學銘，林睿，等.三地釘螺線粒體DNA兩個分子的遺傳變異研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2007， 25（6）：474-477.

[16]關飛，牛安歐，李友松.中國不同種擬釘螺CO1基因序列差異分析及其系統(tǒng)學初探[J].中國人獸共患病學報，2007， 23（1）：44-47.

[17]Hebert PD，Cywinska A，Ball SL，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci，2003，270（1512）：313-321.

[18]Cywinska A，Hunter FF，Hebert PD.Identifying Canadian mosquito species through DNA barcodes[J].Med Vet Entomol，2006，20（4）：413-424.

[19]Rubinoff D.Utility of mitochondrial DNA barcodes in species conservation[J].Conserv Biol，2006，20（4）：1026-1033.

[20]Hebert PD，Stoeckle MY，Zemlak TS，et al.Identification of birds through DNA barcodes[J].PLoS Biol，2004，2（10）：e312.

[21]Ratnasingham S，Hebert PD.bold：The Barcode of Life Data System （http：//www.barcodinglife.org）[J].Mol Ecol Notes，2007，7（3）：355-364.

[22]Areta JI，Piacentini VQ，Haring E，et al.Tiny Bird，Huge Mystery-The Possibly Extinct Hooded Seedeater （Sporophila melanops）Is a Capuchino with a Melanistic Cap[J].PLoS One，2016，11（5）：e154231.

[23]Gutierrez GD，de Lucia M.Freshwater gastropods diversity hotspots：three new species from the Uruguay River （South America）[J].Peer J，2016，8（4）：e2138.

[24]吳文珊，陳友鈴，孫伶俐，等.基于28S，COI和Cytb基因序列的薜荔和愛玉子傳粉小蜂分子遺傳關系研究[J].生態(tài)學報，2013，33（19）：6049-6057.

[25]劉連為，許強華，陳新軍.基于線粒體COI和Cytb基因序列的北太平洋柔魚種群遺傳結構研究[J].水產(chǎn)學報，2012，38（11）：1675-1684.

[26]Garrity GM.A new genomics-driven taxonomy of bacteria and archaea：are we there yet？[J].J Clin Microbiol，2016， 54（8）：1956-1963.

[27]Fuerst PA，Booton GC，Crary M.Phylogenetic analysis and the evolution of the 18S rRNA gene typing system of Acanthamoeba[J].J Eukaryot Microbiol，2015，62（1）：69-84.

[28]Desantis TZ，Hugenholtz P，Larsen N，et al.Greengenes，a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J].Appl Environ Microbiol，2006，72（7）：5069-5072.

[29]Cole JR，Chai B，Marsh TL，et al.The Ribosomal Database Project （RDP-Ⅱ）：previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy[J].Nucleic Acids Res，2003，31（1）：442-443.

[30]Coleman AW.Nuclear rRNA transcript processing versus internal transcribed spacer secondary structure[J].Trends Genet，2015，31（3）：157-163.

[31]Abarenkov K，Henrik Nilsson R，Larsson K，et al.The UNITE database for molecular identification of fungi - recent updates and future perspectives[J].New Phytol，2010，186（2）：281-285.

[32]鄧在春，馬紅映，王翎，等.克雷伯菌屬基于管家基因及水平轉移基因的菌株親緣性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2013，23（23）：5647-5649.

[33]Deng T，Zhang XS，Kim C，et al.Mazus sunhangii （Mazaceae），a New Species Discovered in Central China Appears to be highly endangered[J].PLoS One，2016，11（10）：e163581.

[34]Davis GM，Li L.Molecular genetic and anatomical relationships among Pomatiopsid （Gastropoda：Prosobranchia） genera from Southern China[J].Proc Acad Natur Phila，1994， 145（1）：191-207.

[35]Attwood SW，Upatham ES，Zhang YP，et al.A DNA-sequence based phylogeny for triculine snails （Gastropoda：Pomatiopsidae：Triculinae），intermediate hosts for Schistosoma （Trem-atoda：Digenea）：phylogeography and the origin of Neotricula[J].J Zool，2004，262（1）：47-56.

[36]關飛.擬釘螺亞科部分種類分子系統(tǒng)發(fā)育研究[D].武漢：華中科技大學，2009.

[37]Hajibabaei M，Singer GAC，Hebert PDN，et al.DNA barcoding：how it complements taxonomy，molecular phylogenetics and population genetics？[J].Trends Genet，2007，23（4）：167-172.