陳清嬋，孫愛紅，簡清梅，王勁松

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

適用于橘子酒發(fā)酵的野生酵母初步篩選

陳清嬋，孫愛紅，簡清梅，王勁松

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

從橘子果肉中分離篩選出酵母菌4株，分別命名為JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4。4株酵母均具有典型圓形酵母屬特征。經(jīng)過對(duì)4株酵母的發(fā)酵力及所釀橘子酒的香氣、色澤、風(fēng)味等感官指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)、比較。結(jié)果表明，菌株JZ-1發(fā)酵速度快，降糖徹底，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，釀造的橘子酒具有較好的橘子果酒的典型性，酒體色度好，為澄清透亮的黃色，酒液酒精度達(dá)到9.2%vol，殘?zhí)橇繛?0.4 g/L。關(guān)鍵詞：橘子酒；果酒酵母；篩選

CHEN Qingchan,SUN Aihong,JIAN Qingmei,WANG Jinsong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

橘子是一種較常見的水果，也是一種極佳的釀酒原料。它富含維生素C和檸檬酸，具有美容和消除疲勞的作用。以橘子為原料釀造的酒，酒精度低、營養(yǎng)價(jià)值高，也滿足人們?nèi)找嬖鲩L的養(yǎng)生需求[1]。因此，研制開發(fā)發(fā)酵型柑橘果酒不僅可大大提高柑橘的附加值，而且將成為極受歡迎的新型食品[2]。

由于葡萄酒的生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，好多果酒的研發(fā)都是參照葡萄酒，這使得研發(fā)的其他果酒口感不好、風(fēng)味欠佳、果香不典型。所以沒有商品化的橘子釀酒專用的酵母，是橘子酒生產(chǎn)和發(fā)展的一大阻礙。沒有適宜的菌種，就釀制不出優(yōu)質(zhì)的果酒[3]。生產(chǎn)實(shí)踐證明，菌種是果酒釀造的必要條件[4]，橘子酒的釀造也不例外。目前柑橘果酒的酵母多為延用葡萄酒酵母或果酒干酵母[5]。

目前有研究者從自然環(huán)境中分離柑橘釀酒酵母并對(duì)其進(jìn)行鑒定[6]和特性研究[7-8]，也對(duì)非發(fā)酵酵母[9]和生香酵母進(jìn)行了篩選[10]，比較不同酵母對(duì)柑橘果酒香氣的影響[11]。本研究以荊門本地橘子為試材，從橘子果肉中分離酵母菌，通過對(duì)其發(fā)酵能力、產(chǎn)酒色度、產(chǎn)酒品質(zhì)等性能的研究篩選出具有良好發(fā)酵性能的天然野生酵母，用于橘子酒的發(fā)酵。目的是為橘子酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘子：荊門當(dāng)?shù)厥惺?；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：青島高科因海博生物技術(shù)有限公司；亞硫酸（分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；蔗糖（分析純）：鄭州盛源化工產(chǎn)品有限公司；葡萄糖（分析純）：吳江市恒達(dá)精細(xì)化工有限公司；2,6-二氯酚靛酚（分析純）：杭州長青化工有限公司；抗壞血酸（分析純）：武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：湖北興眾誠科技有限公司；硫酸銅（分析純）：廣州市意強(qiáng)化工有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：廣州市南福化工有限公司；氫氧化鈉（分析純）：安慶安通化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DH-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1901型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州金凈科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘子酒工藝流程

橘子→去皮→壓榨→制漿→調(diào)糖→發(fā)酵→澄清、過濾

橘子成熟后（無須過熟）去皮，榨汁，將果渣與果汁混合。于果漿中加亞硫酸調(diào)整二氧化硫質(zhì)量濃度為60 mg/L，用蔗糖調(diào)整可溶性固形物含量為20.0%，分別將各菌株的培養(yǎng)液按5%的體積比例接入到200mL橘子汁中，搖勻后放入25℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為7 d。發(fā)酵結(jié)束后過濾，棄濾渣，于濾汁中加入硅藻土0.7 g/L，低溫澄清24 h，虹吸上清液，獲得澄清橘子酒。

1.3.2 橘子酒酵母的分離、純化及篩選

（1）橘子酒酵母的分離、純化

分別從放置2 d的橘子果肉中取得菌懸液，在30℃、PDA培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)3 d，觀察菌落情況，然后對(duì)菌體進(jìn)行鏡檢，分離出單個(gè)菌落，逐步進(jìn)行分離、純化[12]。取合適的菌體反復(fù)進(jìn)行平板培養(yǎng)、分離、觀察、鏡檢，將適宜菌株轉(zhuǎn)移至試管斜面PDA培養(yǎng)基于30℃進(jìn)行增殖培養(yǎng)，3 d后轉(zhuǎn)移到4℃冰箱保藏備用[13]。

（2）菌落形態(tài)學(xué)鑒定

參照《真菌鑒定手冊(cè)》[14]和《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[15]，對(duì)酵母進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

（3）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

從斜面培養(yǎng)基上取一環(huán)活化菌種接入50 mL經(jīng)滅菌處理的橘子清汁中，28℃搖床培養(yǎng)24h，振蕩速度120 r/min[13]。

（4）酵母發(fā)酵力的測(cè)定

CO2失重法：取320 mL可溶性固形物含量為20.0%橘子汁于121℃高壓滅菌30 min后，分別裝到4個(gè)經(jīng)滅菌處理的100 mL三角瓶中，每瓶80 mL，再分別接入2 mL各菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液，25℃培養(yǎng)7 d，測(cè)定其發(fā)酵液質(zhì)量損失，并對(duì)各菌種發(fā)酵能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（5）菌株發(fā)酵速度的測(cè)定

分別向200 mL橘子汁發(fā)酵醪中添加2 mL[16]的各菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液，25℃恒溫發(fā)酵7 d，通過定期測(cè)定發(fā)酵醪的含糖量變化，繪圖比較各篩選菌株發(fā)酵速度的高低[17]。

（6）酵母對(duì)發(fā)酵酒液色度的影響

比色法：用TU-1910型紫外分光光度計(jì)，在波長520nm條件下用1 cm比色杯測(cè)各菌種發(fā)酵酒液的吸光度值，蒸餾水作為空白，比較各菌種對(duì)酒液色度的影響。

（7）酵母對(duì)釀造酒液感官評(píng)定的影響

表1 不同酵母釀造的橘子酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of orange wine fermented by different yeasts

將發(fā)酵好的橘子酒給10位師生進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]，制定感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，滿分100分。取10位成員評(píng)分的平均值為最終得分。

1.3.3 測(cè)試指標(biāo)與方法

可溶性固形物含量：手持糖度計(jì)法。

殘?zhí)呛浚ㄒ云咸烟怯?jì)）：斐林試劑法[19]，10 mL斐林試劑液相當(dāng)于葡萄糖51.33 mg。

維生素C（vitaminC，VC）含量：2,6-二氯酚靛酚滴定法[19]。

澄清度：比色法。用可見分光光度計(jì)，在波長680 nm條件下，用1 cm比色杯測(cè)定透光度（T%），蒸餾水做空白。

色度：比色法。用可見分光光度計(jì)，在波長520 nm條件下，用1 cm比色杯測(cè)定吸光度值（A），蒸餾水作為空白。

酒精度：蒸餾法。用容量瓶取100 mL酒樣于500 mL蒸餾瓶中，50 mL水洗容量瓶并并入蒸餾瓶中，收集餾出液100 mL，冷卻后用酒精計(jì)測(cè)量并按20℃校正。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定3次，取平均值；試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘子酒酵母的分離、純化及形態(tài)鑒定

反復(fù)進(jìn)行多次分離、純化，得到了符合酵母特征的初篩酵母菌4株，分別命名為JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4。4株菌株在PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3 d后，觀察其菌落形態(tài)，酵母的菌落及個(gè)體形態(tài)結(jié)果如表2所示。

表2 酵母的菌落及個(gè)體形態(tài)Table 2 Colonies and individual morphology of yeast strains

由表2可知，從橘子中分離出天然野生酵母，且其菌落特征和菌體特征都差不多相似，同屬于圓形酵母屬。

2.2 橘子酒酵母的初步篩選

2.2.1 酵母發(fā)酵力的確定

將篩選出的酵母菌株，分別接入橘子汁培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)7 d測(cè)發(fā)酵液質(zhì)量損失，至相鄰兩次質(zhì)量之差小于0.2 g為發(fā)酵終點(diǎn)，終止發(fā)酵。判斷酵母發(fā)酵力，具體情況如表3所示。

由表3可知，各菌株在25℃條件下恒溫發(fā)酵7 d后，發(fā)酵液質(zhì)量損失分別為：菌株JZ-1 11.83 g、JZ-2 9.78 g、JZ-3 10.84 g、JZ-4 10.13 g。由發(fā)酵液質(zhì)量損失大小即CO2釋放量可知，不同菌株利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力各不相同，即各菌株的發(fā)酵力不同。由表3可以看出，各發(fā)酵液質(zhì)量損失率大小如下：JZ-1酵母＞JZ-3酵母＞JZ-2酵母＞JZ-4酵母。所以菌株JZ-1的發(fā)酵力最強(qiáng)。

表3 不同菌株發(fā)酵液質(zhì)量變化Table 3 Mass changes of fermentation must by different yeasts

分別將各菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液按5%的體積比接入到200 mL橘子汁中，搖勻后放入25℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵7 d。測(cè)定發(fā)酵酒液糖含量，其含量變化結(jié)果見圖1。

圖1 各菌株發(fā)酵期間發(fā)酵液的降糖速度比較Fig.1 Sucrose-decreasing speed comparison in fermentation must by different yeasts

由圖1酒液殘?zhí)呛孔兓€可以看出，菌株JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4在蔗糖含量為20%的橘子汁發(fā)酵醪中迅速發(fā)酵，起酵時(shí)間基本一致，均為1 d。酵母菌JZ-1發(fā)酵速度快，降糖徹底（第7天糖含量已降至7.2%），發(fā)酵能力強(qiáng)，最終釀造酒精度高；JZ-4酵母菌發(fā)酵速度較慢，至第5天后降糖速度趨于平緩，殘?zhí)呛扛撸ǖ?天糖含量仍為8.3%），酒精度較低；而酵母菌JZ-2發(fā)酵速度接近酵母菌JZ-4（第7天糖含量為8.0%），發(fā)酵速度較緩慢，酒精度較低；JZ-3酵母介于JZ-1酵母和JZ-2酵母之間（第7天糖含量為7.5%），發(fā)酵能力較強(qiáng)，最終釀造酒精度較高。

相對(duì)而言，菌種發(fā)酵力越大，它的發(fā)酵速度越快而且越徹底，而酒中殘?zhí)呛烤驮缴?，發(fā)酵性能越優(yōu)良。菌株JZ-1的發(fā)酵性能最好。

2.2.2 產(chǎn)酒色度測(cè)定

將發(fā)酵好的橘子酒進(jìn)行澄清，用紫外分光光度計(jì)在波長520 nm下測(cè)定各菌種發(fā)酵酒液的吸光度值，結(jié)果如表4所示。

表4 各酵母發(fā)酵酒的色度Table 4 The color density of orange wine fermented by different yeasts

橘子酒透明，色澤為黃色或金黃色為佳，酒的吸光度值越大，酒體色澤相對(duì)越差。如表4可知，各菌釀造的橘子酒吸光度值大小為JZ-4＞JZ-3＞JZ-1＞JZ-2。酵母菌JZ-2釀造橘子原酒，色澤為淡黃色，酒體透明；酵母菌JZ-1釀造橘子原酒，色澤黃色，酒體透明度較好；酵母菌JZ-3和JZ-4釀造的橘子原酒呈深黃色，酒體略渾濁。就色澤來說，酵母菌JZ-1和JZ-2酵母所釀原酒的酒色最好。

2.2.3 綜合評(píng)定

根據(jù)各篩選酵母菌釀酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)篩選出的4株酵母菌所釀原酒進(jìn)行感官評(píng)定，具體評(píng)定結(jié)果見表5。

表5 各酵母菌釀造的橘子酒感官評(píng)價(jià)Table 5 Sensory evaluation of orange wine fermented by different yeasts

由表5看出，各初篩菌種發(fā)酵原酒感官評(píng)分由大到小順序：JZ-1＞JZ-3＞JZ-4＞JZ-2。根據(jù)感官評(píng)價(jià)得知，酵母JZ-1為最好菌株。

綜合以上的結(jié)果可以看出，酵母菌JZ-1發(fā)酵速度快，發(fā)酵力強(qiáng)，產(chǎn)酒精的能力高，色度不錯(cuò)，具有良好的橘子酒典型性，釀酒效果佳。酵母菌JZ-3發(fā)酵力不錯(cuò)，風(fēng)味和色度方面較好；酵母菌JZ-2、JZ-4發(fā)酵力不強(qiáng)，酵母菌JZ-2風(fēng)味、釀酒色度等綜合性都較差，但酵母菌JZ-4釀酒橘子香味濃，典型性好。綜合分析，在從橘子果實(shí)中篩選的天然野生酵母中，酵母菌JZ-1性能最佳。

2.2.4 優(yōu)選菌所釀橘子酒的理化指標(biāo)

對(duì)酵母菌JZ-1發(fā)酵所得橘子酒進(jìn)行澄清，對(duì)其VC含量、酒精度、殘?zhí)呛?、透光率等理化指?biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6JZ-1酵母所釀造的橘子酒的理化指標(biāo)Table 6 Physicochemical indexes of orange wine fermented by yeast JZ-1

由表6可知，酵母JZ-1釀造的橘子酒VC含量較高（含量15.4 mg/100 mL），營養(yǎng)價(jià)值很好；酒精度適宜（酒精度9.2%vol），降糖較徹底；酒體透明度高（透光率88.9%），色澤較好；糖量較少屬于半干型，符合果酒標(biāo)準(zhǔn)[20]，是低酒精度營養(yǎng)型果酒。

3 結(jié)論

從橘子果肉中分離出的4種酵母菌株其菌落特征、菌體形態(tài)較為相近，內(nèi)部有菌核，出芽生殖；菌落均呈白色，圓形，有一定凸起度，易挑起。4株酵母中，菌株JZ-1和JZ-3的發(fā)酵力、產(chǎn)酒精率性能均較強(qiáng)，尤以菌株JZ-1綜合性能最好。酵母菌JZ-1釀造的橘子酒VC含量較高，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，降糖較徹底，酒體透明度高，色澤較好。綜合分析認(rèn)為，在從橘子果實(shí)中篩選的天然野生酵母中，菌株JZ-1的性能最佳。后期需要對(duì)菌株JZ-1進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)行特性研究，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化橘子酒發(fā)酵工藝，提高橘子酒發(fā)酵品質(zhì)。

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0254-5071（2017）05-0128-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.027

2016-11-17

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（Q20154304）

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向?yàn)轱L(fēng)味食品。