安曉剛， 杜 捷,*， 盧小泉

(1. 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省生物電化學(xué)與環(huán)境分析重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

基于貴金屬納米簇的電化學(xué)發(fā)光傳感器在生命分析中的應(yīng)用

安曉剛1， 杜 捷1,2*， 盧小泉2

(1. 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省生物電化學(xué)與環(huán)境分析重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

為了更好地研究貴金屬納米簇的合成機理、擴展貴金屬納米簇-電化學(xué)傳感器的應(yīng)用，闡述和比較了貴金屬納米簇的制備方法、電化學(xué)發(fā)光原理及特點,重點介紹了貴金屬納米簇-電化學(xué)傳感器在生命分析領(lǐng)域的應(yīng)用進展及本課題組相關(guān)研究,并展望了其發(fā)展和應(yīng)用前景，以期為貴金屬納米簇電化學(xué)傳感器在生命分析中的研究提供一定的參考。

貴金屬納米簇； 電致化學(xué)發(fā)光； 電化學(xué)生物傳感器； 生命分析

1 引 言

電致化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated chemilumines-cence,ECL)是指一些中間體，主要是自由基離子在電的激發(fā)下產(chǎn)生于電極表面，繼而進行高能電子遷移反應(yīng)，形成激發(fā)態(tài)而產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象[1-3]。ECL由于具有快速、高靈敏度以及簡化的光學(xué)裝置等優(yōu)點，作為一種新型的分析工具，被廣泛應(yīng)用于臨床、環(huán)境和工業(yè)等領(lǐng)域，主要涉及免疫分析[4-6]、食品和水質(zhì)的分析檢測[7-9]、藥物分析[10]等。

貴金屬納米簇(Noble metal clusters,MNCs)，如Au和Ag納米簇等，是近年來新興的一類低毒性的“綠色”熒光標(biāo)記材料，具有低毒、光學(xué)穩(wěn)定、水溶性好、生物相容性好及優(yōu)良的電致化學(xué)發(fā)光性質(zhì)，可以彌補量子點成像時閃爍的不足。另外，由于MNCs特有的物理尺寸小、熒光可調(diào)及生物相容性等優(yōu)異的性能，使得其在生物成像及檢測領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景[11]。如Ag NCs，由于其具有良好的物理、電學(xué)和光學(xué)特性，已經(jīng)應(yīng)用于表面增強拉曼散射[12]、化學(xué)傳感[13]、光學(xué)器件[14]、生物成像[15]、催化[16]等領(lǐng)域。Liu[16]等用牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑和還原劑，用“一鍋法”制備了高水溶性的Au NCs，并將其與ECL有效結(jié)合，用于ECL 靈敏、高效地檢測多巴胺。

基于貴金屬納米簇的優(yōu)越性和 ECL 技術(shù)的高靈敏性構(gòu)建的 ECL 生物傳感器被廣泛應(yīng)用于生命分析領(lǐng)域，取得了一些可喜的研究成果。一些成果研究應(yīng)用到了我們的實際生活中，為人類健康服務(wù)，如羅氏血糖儀及羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀等是最好的應(yīng)用實例。

2 MNCs合成及電化學(xué)發(fā)光特性

2.1 貴金屬團簇的合成

貴金屬團簇的制備方法主要包括物理法和化學(xué)法兩大類，及近年來出現(xiàn)的物理化學(xué)綜合合成方法。光誘導(dǎo)還原法、惰性氣體蒸發(fā)冷凝制備法及輻射誘導(dǎo)合成法是物理類中最主要的3種方法。制備金屬團簇需要合適的穩(wěn)定劑作為團簇保護劑與穩(wěn)定劑，但因為物理法獲得的團簇沒有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑作為保護，所以極易發(fā)生聚集，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)發(fā)生改變。另外，物理方法合成時，合成產(chǎn)物一般顆粒較大，粒徑分布不均一且穩(wěn)定性差。因此，化學(xué)合成方法在研究中較為常用，主要包括單分子層保護(MPCs)和模板法。

模板法主要基于微乳液[18]、高分子聚合物[19]、聚合電解質(zhì)[20]以及功能性生物分子如 DNA、多肽和蛋白質(zhì)等分子[19]的特殊空間結(jié)構(gòu)或功能，在強還原劑(NaBH4)存在條件下獲得穩(wěn)定、熒光可調(diào)的貴金屬團簇。然而，當(dāng)運用模板法制備MNCs時，必須選用一些物質(zhì)制備模板和起到穩(wěn)定合成的作用，通常選用巰基化合物、蛋白質(zhì)等作為模板，用于穩(wěn)定或還原金屬離子，否則容易形成聚集現(xiàn)象[19]。

此外，物理化學(xué)綜合方法是近些年出現(xiàn)且研究比較熱的新合成方法，主要包括超聲化學(xué)合成法和微波輔助化學(xué)合成方法。相比物理合成法及化學(xué)合成法，超聲化學(xué)合成法更顯優(yōu)越性，如反應(yīng)速率快、條件可控、產(chǎn)物純度高、粒徑大小可控等，因此該方法被很多研究者所采用，如Liu等[16]用超聲化學(xué)合成法制備得到了Ag NCs，大大縮短了反應(yīng)時間。

微波輔助化學(xué)合成具有操作簡單、低能耗、反應(yīng)快速高效、粒徑大小可控、環(huán)境友好等優(yōu)越性能，從而被稱作“綠色”合成技術(shù)。Liu等[21]采用微波輔助合成法以 L 型谷胱甘肽作為合成反應(yīng)過程中的穩(wěn)定劑及還原劑，利用微波法在幾分鐘內(nèi)快速高效地合成了 GSH/Ag NCs，大大縮短了反應(yīng)時間。Shang等[22]也采用微波法成功制備了二氫硫辛酸包裹的Au NCs，將反應(yīng)時間從傳統(tǒng)合成方法的幾個小時縮減到幾分鐘，進一步顯示出微波法的優(yōu)越性。

2.2 貴金屬團簇的電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)

貴金屬團簇的物理尺寸較小(< 2 nm)，當(dāng)其尺寸接近或小于電子的費米波長時，金屬連續(xù)的能級會變?yōu)闇?zhǔn)連續(xù)甚至是離散能級，從而使團簇產(chǎn)生光致發(fā)光現(xiàn)象。熒光是團簇最為重要的性質(zhì)，當(dāng)構(gòu)成團簇的原子數(shù)目不同即團簇大小不同時，能級之間能量差值也不同，因此其熒光性質(zhì)也隨之變化。通常具有熒光性質(zhì)的金屬納米簇都具有電化學(xué)發(fā)光特性，但是電化學(xué)發(fā)光原理與一般化學(xué)發(fā)光不同，主要是自由基離子在外加電的激發(fā)下產(chǎn)生于電極表面，繼而形成激發(fā)態(tài)，隨后當(dāng)激發(fā)態(tài)向基態(tài)能級躍遷時伴隨光子產(chǎn)生。

ECL 技術(shù)由于具有快速、高選擇性、高靈敏性、高穩(wěn)定性、便于操作和控制等特點，已經(jīng)發(fā)展成為一種非常強大的分析工具被應(yīng)用于各個領(lǐng)域。近年來，基于貴金屬納米簇-ECL生物傳感器的研究進一步促進了其在醫(yī)學(xué)檢測、食品安全檢測等領(lǐng)域的發(fā)展。

3 納米簇的ECL的原理及特點

納米簇的電化學(xué)發(fā)光是電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的結(jié)合，主要涉及兩個反應(yīng)過程：電化學(xué)過程和化學(xué)發(fā)光過程。在電化學(xué)反應(yīng)過程中，在外加電壓作用下生成發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的自由基離子；在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程中，自由基離子之間或自由基離子與反應(yīng)體系中其他組分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子，當(dāng)這些激發(fā)態(tài)分子向基態(tài)能級躍遷時伴隨光子產(chǎn)生。

ECL 技術(shù)是融合化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)的技術(shù)，不需要使用任何外部光。作為一種新的分析方法，主要有以下幾個特點：(1)靈敏度高，線性范圍寬；(2)反應(yīng)可控性強；(3)分析速度較快，實驗裝置簡單；(4)試劑用量少，耗費低；(5)獲得信息的途徑較多；(6)多種技術(shù)聯(lián)用，可以實現(xiàn)對復(fù)雜樣品的同時分離與檢測。

4 在生命分析中的應(yīng)用

4.1 電化學(xué)免疫分析應(yīng)用

電化學(xué)免疫分析是基于免疫學(xué)基礎(chǔ)，結(jié)合電化學(xué)技術(shù)發(fā)展起來的一種有效分析技術(shù)。該技術(shù)與單純的免疫反應(yīng)相比，其最大特點是將抗體 (或抗原) 作為分子識別元件，構(gòu)建到電極表面，從而將免疫反應(yīng)的特異性與電化學(xué)的高靈敏性相結(jié)合，進而實現(xiàn)對目標(biāo)物的特異性與超靈敏檢測。

圖1 三重放大ECL免疫生物傳感器檢測假狂犬病病毒抗體示意圖[5]

Zhang等[16]基于貴金屬納米簇的夾心免疫反應(yīng)原理，將鉑納米粒子標(biāo)記抗體引入電極表面，進而實現(xiàn)響應(yīng)信號的放大和檢測限的極大提高。Shao等[5]基于三重放大電化學(xué)傳感器對于檢測低豐度生物標(biāo)志物的優(yōu)越性，以“Stretch-Stowage-Growth”策略構(gòu)建了三重放大 ECL 免疫生物傳感器來超靈敏檢測假狂犬病病毒抗體 (圖1)，對假狂犬病病毒抗體的檢測限可達到0.4 pg·mL-1。該技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。

4.2 在癌癥等疾病診斷方面的應(yīng)用研究

癌癥也稱惡性腫瘤，目前已成為中國乃至全世界最重要的死亡原因，也是非常重要的公共健康問題[28]。對癌癥的早期有效診斷措施是對患者血清中的特殊腫瘤標(biāo)志物進行特異性、高靈敏檢測，從而實現(xiàn)對腫瘤(癌)的預(yù)警及早期診斷、治療。常見腫瘤(癌)及腫瘤標(biāo)志物如表1所示。

如何有效、靈敏地對癌癥等疾病進行早期診斷檢測與治療仍是生命分析研究亟需解決的問題和研究熱點。目前，針對腫瘤標(biāo)志物的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[29-30]、化學(xué)發(fā)光免疫法[31-32]、熒光免疫分析法[33-34]等，其中將高特異性的免疫分析方法與高靈敏的電化學(xué)方法相結(jié)合而構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器一直是研究熱點[35-37]。

表1 常見腫瘤(癌癥)及其標(biāo)志物

Bruno等[38]構(gòu)建了體外DNA寡核苷酸適配體ECL傳感器檢測炭疽桿菌。Xiang等[8]設(shè)計了一種可在同一位點同時檢測多種目標(biāo)物的基因傳感器(圖2)，能同時分別檢測來自鼠傷寒沙門氏桿菌病原體(gyrB基因)和直腸腫瘤(K-ras基因)的基因生物標(biāo)記物。Huang等[39]運用鈀納米簇，設(shè)計了一種雙電位比率型 ECL策略用于免疫分析，并以癌胚抗原為模型，研究了該設(shè)計的可行性。結(jié)果表明：該設(shè)計對生物標(biāo)記蛋白具有很好的選擇性和檢測，最低檢測限可達0.62 pg·mL-1。

圖2 同時檢測鼠傷寒沙門氏桿菌病原體(gyr基因)和直腸腫瘤(K-ras基因)的基因生物標(biāo)記物電化學(xué)免疫傳感器[8]

Fig.2 Simultaneous detection of Salmonella typhimurium pathogen(gyrB gene) and rectal tumor(K-ras gene) gene biomarker electrochemical immunosensor[8]

Cao等[40]基于納米合金顆粒(Au-Pt)構(gòu)建了檢測 CEA 的夾心免疫結(jié)構(gòu)，其原理如圖3。由于 Au 和 Pt 之間的高效協(xié)同作用，Au-Pt 合金納米粒子除具有較大的比表面積、良好的生物相容性和優(yōu)良的導(dǎo)電能力外，還可進一步催化底液中的H2O2溶液，進而利用Au-Pt納米粒子及HRP對過氧化氫的協(xié)同催化作用實現(xiàn)雙重信號放大。該傳感器用于測定CEA的濃度范圍為0.01～200 ng/mL。

Yang等[41]構(gòu)建了一種新型的電流型免疫傳感器，對腫瘤標(biāo)志物 CEA 的檢測限為12 pg·mL-1。

圖3 用于CEA檢測的Au-Pt 雙金屬電化學(xué)傳感器[40]

另外，Zhou等[17]用氮摻雜石墨烯設(shè)計了一種猝滅型ECL免疫傳感器，以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(Alpha-fetal protein,AFP)為模型探究了該傳感器的分析性能，當(dāng)濃度范圍在0.01～100 ng·mL-1時具有很好的線性，最低檢測限可達到3.3 pg·mL-1。

最近文獻報道，Zhang等[42]設(shè)計了一種比率型ECL免疫傳感器，能夠超靈敏、特異性檢測腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)并對其具有很寬的線性檢測范圍(1 fg·mL-1～20 ng·mL-1)，最低檢測限可以達到1 fg·mL-1。Zhang等[43]基于魯米諾-金納米粒子構(gòu)建了雙信號生物傳感器用于檢測端粒酶，該方法不僅能夠檢測100～9 000個HL 細胞中端粒酶的含量，還可以用于研究腫瘤細胞的凋亡。

4.3 對生物分子的檢測

Gu等[44]將碳量子點(CDs)制作成 “off-on” 型熒光探針檢測Au(Ⅲ)與谷胱甘肽含量，該方法可以用于細胞內(nèi)不同狀態(tài)下谷胱甘肽含量的測定。多巴胺是下丘腦和腦垂體腺中的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，與人們的情緒息息相關(guān)，Liu等[25]首次基于他們合成的 Ag NCs 構(gòu)建的電化學(xué)傳感器對多巴胺進行了檢測，檢測限可以達到 9.2×10-10mol/L。后來，Li等[27]基于他們合成的Au NC的ECL檢測多巴胺，并研究了Au NC的ECL發(fā)光機理。Zhang等[45]基于逐步化學(xué)反應(yīng)策略，構(gòu)建了高靈敏 ECL 傳感器檢測多巴胺，以 O2作為內(nèi)源性共反應(yīng)劑，大大提高了檢測信號及檢測限，下限可達到 26 pmol/L。

Yuan等[46]構(gòu)建了石墨烯/多壁碳納米管/金納米簇復(fù)合型 ECL傳感器，用于檢測酚類化合物。Wu等[47]將制備的 AuNC@BSA-silica NPs 構(gòu)建成固態(tài) ECL傳感器檢測過氧化氫。Chen等[48]基于離子液體的優(yōu)越性構(gòu)建了離子液體誘導(dǎo)型 CO2傳感器檢測CO2，檢測限為 80 ×10-6，其反應(yīng)過程如圖4所示。Jia等[49]基于Au-HS/SO3H-PMO構(gòu)建了一種可靈敏檢測葡萄糖的非酶電化學(xué)傳感器，對葡萄糖的檢測限可達到 2.5×10-8mol/L，靈敏度為 6.45×102μA·mmol-1·L·cm-2，該方法為人類血清中葡萄糖含量的有效測定提供了一種可能。

Gui等[50]將 Ru(Ⅱ) 和氨卡青霉素連接在一起作為識別元件構(gòu)建了一種新型的 ECL 生物傳感器用于檢測內(nèi)酰胺酶(圖5)。在該過程中，構(gòu)建的Ru-Amp不僅作為識別元件，同時也作為發(fā)光試劑，通過靜電吸附和分子內(nèi)部的π-π鍵相互作用將其與制備的 Au NPs構(gòu)建成復(fù)合納米材料。該復(fù)合材料會子組裝到 CNTs-Nf 修飾的玻碳電極上，基于Amp的自身水解反應(yīng)，從而明顯增強 ECL 信號，可以對內(nèi)酰胺酶進行高靈敏檢測，檢測濃度范圍為50 pg·mL-1～100 ng·mL-1，最低檢測限為 37 pg·mL-1。

Xu等[51]用釕(Ⅱ) 和1,10-菲咯啉-5,6-二酮絡(luò)合物(Ru-dpq)構(gòu)建了一種可以高選擇性、靈敏檢測 GSH 的猝滅型ECL傳感器，在0.1 pmol/L～50 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性，檢測限可以達 0.087pmol/L。質(zhì)譜探究發(fā)現(xiàn)，在該反應(yīng)過程中，GSH 使 Ru-dpq 反應(yīng)后結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，生成了一種氧化產(chǎn)物Ru-dcbpy，同時還原型 GSH 變成了氧化性 GSSG。

圖4 離子液體誘導(dǎo)型CO2傳感器檢測CO2[48]

Fig.4 Inducible ionic liquid CO2sensor CO2[48]

圖5 生物傳感器構(gòu)建示意圖及目標(biāo)檢測機制[50]

4.4 本課題組近年對生命分析的相關(guān)研究

Du等[52]基于三維石墨烯構(gòu)建的電化學(xué)傳感器可以實現(xiàn)對對苯二酚(HQ) 和鄰苯二酚(CC)的同時檢測，HQ和CC的線性檢測范圍分別為3.10×10-7～1.31×10-5mol/L和2.50×10-7～1.29×10-5mol/L。Bi 等[53]基于2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)-氧化纖維素納米晶體(TOCNCs) 和 L-半胱氨酸修飾到金電極表面構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器，能夠靈敏地檢測和鑒別手性氨基酸，包括苯基丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，這3種手性氨基酸與人體的代謝疾病相關(guān)。利用該電化學(xué)傳感器對正常人和糖尿病人血清進行檢測，結(jié)果表現(xiàn)出顯著性差異，從而為代謝疾病的篩查、診斷和治療具有重要的意義。

5 展 望

綜上所述，基于貴金屬納米簇的電化學(xué)發(fā)光傳感器為生命分析研究提供了強有力的技術(shù)支撐，利用免疫分析及 DNA 雜交技術(shù)構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器被廣泛應(yīng)用于生物電分析及生命分析領(lǐng)域。在我們的日常生活中，羅氏血糖儀及醫(yī)院常用的羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀等是最好的理論研究轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用的實例。

盡管在醫(yī)學(xué)診斷、免疫分析、食品和水質(zhì)分析檢測、藥物分析等方面的研究取得了一些可喜的成果，但對于癌癥等疾病的早期診斷與治療仍是生物學(xué)家和分析化學(xué)研究者所共同關(guān)注的問題和面臨的挑戰(zhàn)。很多研究報道了基于 NMCs 構(gòu)建的ECL生物傳感器能超靈敏檢測癌癥等疾病，但這些研究只是局限于實驗室的理想條件下對細胞的研究，并沒有應(yīng)用于體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的深層次研究。另外，如何將低毒性的貴金屬納米簇有效地作為藥物示蹤標(biāo)記物應(yīng)用到臨床疾病的靶向治療及藥物“負載-釋放”過程的可視化具有重要的研究意義。

近些年的研究趨勢充分體現(xiàn)了化學(xué)與生物的交叉融合、生物學(xué)家和化學(xué)家的協(xié)同合作?；诩{米材料與 ECL 技術(shù)的生物電化學(xué)傳感器及生物電分析的研究為生物學(xué)及生命分析的研究提供了更好的技術(shù)支撐。技術(shù)的發(fā)展是為了更好地服務(wù)于應(yīng)用，只有當(dāng)技術(shù)的發(fā)展永遠走在應(yīng)用的前面，才能更好地服務(wù)于應(yīng)用。相信隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進步，肯定會取得更大的成果，更好地為人類健康服務(wù)。

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安曉剛(1989-)，男，甘肅靜寧人， 碩士，2017年于西北師范大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事生物分析化學(xué)、電化學(xué)生物傳感器等方面的研究。

E-mail: axg225@163.com杜捷 (1971-)男，甘肅成縣人，博士，教授，2011年于西北師范大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事遺傳學(xué)、生物分析化學(xué)、生物傳感器及納米分析技術(shù)的研究。

E-mail: dujie@nwnu.edu.cn

Application in Life Analysis of Electrochemiluminescent Sensor Based on Noble Metal Nanocluster

AN Xiao-gang1, DU Jie1,2*, LU Xiao-quan2

(1.CollegeofLifeScience,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofBioelectrochemistry&EnvironmentalAnalysisofGansuProvince,Lanzhou730070,China)

In order to study the synthesis mechanism of noble metal nanoclusters and the application of noble metal nanoclusters-electrochemical sensors, some methods of the synthesis and the properties of noble metal nanoclusters are described and compared. The principle and characteristics of electrogenerated chemiluminescence (ECL) are briefly described, the progress of application of noble metal nanoclusters-electrochemical sensor in life analysis and the related research of our research group are mainly introduced. The development and application are prospected, which may provide a reference for the research of noble metal nanoclusters-electrochemiluminescent sensor in life analysis.

noble metal clusters (MNCs); electrogenerated chemiluminescence (ECL); electrochemical biosensor; life analysis

1000-7032(2017)05-0675-10

2016-12-12；

2017-02-12

國家自然科學(xué)基金(21165015,21565020)資助項目 Supported by National Natural Science Foundation of China (21165015,21565020)

O657.1

A

10.3788/fgxb20173805.0675

*CorrespondingAuthor,E-mail:dujie@nwnu.edu.cn