陸勤佳,蔡 強(qiáng)*,沈國(guó)金,王振華

(1.杭州電子科技大學(xué)電子信息學(xué)院,杭州 310018;2.浙江清華長(zhǎng)三角研究院,浙江 嘉興 314006)

黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)*

陸勤佳1,2,蔡 強(qiáng)1,2*,沈國(guó)金2,王振華2

(1.杭州電子科技大學(xué)電子信息學(xué)院,杭州 310018;2.浙江清華長(zhǎng)三角研究院,浙江 嘉興 314006)

基于高效液相色譜熒光法設(shè)計(jì)并完成了一套黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要由分離系統(tǒng)、恒溫控制系統(tǒng)、熒光檢測(cè)器、主控板和人機(jī)交互界面組成。儀器通過分離系統(tǒng)將黃曲霉毒素進(jìn)行分離,再由熒光檢測(cè)器激發(fā)黃曲霉毒素產(chǎn)生熒光,以光子計(jì)數(shù)的方式進(jìn)行信號(hào)采集,最終在PC的色譜工作站上顯示檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)測(cè)試表明該系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性,結(jié)構(gòu)緊湊,檢測(cè)速度快,靈敏度高,能用于黃曲霉毒素的實(shí)際檢測(cè)。

高效液相色譜熒光法;黃曲霉毒素檢測(cè);熒光檢測(cè)器;光子計(jì)數(shù)

黃曲霉毒素AFT(Aflatoxin)是由真菌類如黃曲霉菌、寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物,主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2[1]。它們?cè)谧匀唤缰袕V泛存在,且具有強(qiáng)致癌性[2-3]。黃曲霉毒素已成為食品質(zhì)檢的必檢項(xiàng)目之一[4]。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜法[5-6]、也有一些酶聯(lián)免疫吸附法[7]、檢測(cè)卡等快檢方法。國(guó)標(biāo)檢測(cè)法靈敏度高、重現(xiàn)性好,可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)黃曲霉種類。但是檢測(cè)周期長(zhǎng),操作復(fù)雜,且一般檢測(cè)儀器龐大,不能滿足簡(jiǎn)捷、現(xiàn)場(chǎng)化的要求。而免疫檢測(cè)法雖然檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單,但是檢測(cè)準(zhǔn)確度和精確度都比較差。

本文以高效液相色譜法為基礎(chǔ),開發(fā)特定波長(zhǎng)熒光檢測(cè)模塊,將液相色譜和熒光檢測(cè)集成于儀器,研制專用黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng),力圖解決傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)儀器體積龐大、操作復(fù)雜的問題。

1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和檢測(cè)原理

圖1和圖2分別為黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖和實(shí)物圖。該系統(tǒng)主要由分離系統(tǒng)、恒溫控制系統(tǒng)、熒光檢測(cè)器、主控板和人機(jī)交互界面組成。

檢測(cè)原理:儀器上電后輸液泵工作加壓,待測(cè)AFT樣品(經(jīng)提取、凈化處理后所得樣品)通過進(jìn)樣閥加入,隨流動(dòng)相進(jìn)入柱溫箱內(nèi)的C18色譜柱中[8]。各AFT在親和色譜作用下被分離,依次進(jìn)入檢測(cè)器內(nèi)置的玻盒中。在LED的激發(fā)下各AFT產(chǎn)生光強(qiáng)不等的熒光信號(hào)。這些熒光信號(hào)經(jīng)過透鏡、濾光片等光路作用被PMT接收,由計(jì)數(shù)模塊進(jìn)行光子計(jì)數(shù)[9]并上傳給上位機(jī),最終上位機(jī)通過譜圖處理得到各AFT的濃度。

圖1 黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

圖2 黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)物圖

2 主要硬件模塊

2.1 分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)主要由輸液泵和C18色譜柱組成。其中輸液泵采用清博華科技的一款型號(hào)為P1010的產(chǎn)品。色譜柱采用了賽智的一款型號(hào)為Vertex-C18色譜柱。

2.2 恒溫控制系統(tǒng)

溫度會(huì)影響C18色譜柱對(duì)AFT的分離效果。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,設(shè)計(jì)了恒溫控制系統(tǒng),將色譜柱溫度控制在25°C(±1°C)。圖3為恒溫控制系統(tǒng)實(shí)物圖。它由柱溫箱、制冷熱片、風(fēng)扇、DS18B20溫度傳感器以及溫控板組成。柱溫箱為一個(gè)柱狀封閉的鋁合金箱體,用于放置C18色譜柱。在柱溫箱(距兩側(cè)20 cm)下壁緊貼著兩個(gè)半導(dǎo)體制冷熱片,制冷熱片的下方是兩個(gè)用于輔助散熱的風(fēng)扇。在箱體的兩側(cè)裝有兩個(gè)防水型DS18B20數(shù)字溫度傳感器[10],用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)箱內(nèi)色譜柱的溫度[11]。溫控板通過讀取傳感器溫度與目標(biāo)設(shè)定值進(jìn)行比對(duì),控制制冷熱片加熱或制冷。

圖3 恒溫控制系統(tǒng)實(shí)物圖

2.3 熒光檢測(cè)器

為保證耦合效率,熒光檢測(cè)器采用緊湊結(jié)構(gòu),整個(gè)檢測(cè)器由光源模塊和信號(hào)采集模塊組成。其中光源模塊包括LED驅(qū)動(dòng)電路和光路結(jié)構(gòu)。信號(hào)采集模塊包括PMT和CPLD計(jì)數(shù)電路。圖4和圖5分別為熒光檢測(cè)器原理圖和實(shí)物圖。檢測(cè)器采用LED(索雷博,LED370E)作為光源,單色光經(jīng)透鏡準(zhǔn)直后垂直入射石英玻盒。此時(shí)流經(jīng)玻盒的流動(dòng)相中若混有被分離的AFT,在LED紫外光(365 nm)的激發(fā)下就會(huì)產(chǎn)生熒光,熒光信號(hào)經(jīng)透鏡聚光準(zhǔn)直、濾光片(440 nm)濾除雜散光后被PMT檢測(cè)窗口接收。PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電脈沖信號(hào),最終被CPLD計(jì)數(shù)電路采集以光子數(shù)的形式反映熒光信號(hào)強(qiáng)弱。

圖4 熒光檢器檢測(cè)原理圖

圖5 熒光檢測(cè)器實(shí)物圖

為保證LED光功率的穩(wěn)定,系統(tǒng)采用閉環(huán)控制方式給LED供電。圖6為光強(qiáng)反饋驅(qū)動(dòng)電路。采用ADI公司的ADN2830集成芯片,芯片偏置電流輸出范圍在4 mA～200 mA,支持可編程報(bào)警機(jī)制,可軟件控制光源驅(qū)動(dòng)器。其中PSET引腳為光功率設(shè)置引腳,可接光電池來監(jiān)測(cè)LED的光功率,IBIAS引腳為偏置電流輸出引腳,接LED。芯片通過光電池反饋光強(qiáng)從而調(diào)節(jié)IBIAS引腳輸出電流的大小,采用閉環(huán)控制方式保證了LED光功率的恒定。光功率的大小可以通過改變R3的阻值來調(diào)節(jié)(本電路中選用24 kΩ)。

圖6 光強(qiáng)反饋驅(qū)動(dòng)電路

檢測(cè)器模塊的PMT采用日本濱松公司的H10682-210光子計(jì)數(shù)探頭,該探頭包含了一個(gè)金屬封裝型光電倍增管,高速光子計(jì)數(shù)電路和高壓電源。它的計(jì)數(shù)靈敏度(400 nm)可以達(dá)到6.1×105s-1·pW-1,典型暗計(jì)數(shù)為50 s-1,計(jì)數(shù)線性為5.0×106s-1,脈沖對(duì)分辨率為20 ns。其輸出信號(hào)為電脈沖信號(hào),直接由CPLD計(jì)數(shù)電路采集。

激發(fā)的熒光信號(hào)強(qiáng)度與AFT的濃度呈正相關(guān)關(guān)系,為保證高濃度時(shí)計(jì)數(shù)不溢出,計(jì)數(shù)模塊必須要有寬范圍的線性計(jì)數(shù)范圍。以20 MHz頻率為計(jì)數(shù)上限,一般的單片機(jī)難以達(dá)到要求,本系統(tǒng)采用Altera公司的EPM240T100C5N芯片作為計(jì)數(shù)模塊的主芯片。該芯片的最大工作頻率可達(dá)304 MHz,采用該公司開發(fā)的QUATUUS Ⅱ軟件,使用Verilog語言來進(jìn)行軟件開發(fā)。

2.4 主控板

主控板實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的傳輸和控制。采用ST公司的STM32F103RCT6單片機(jī),它的最大工作時(shí)鐘為72 MHz,擁有256K FLASH,48 K SRAM,5個(gè)串口,8個(gè)16位定時(shí)器,SPI通信[12]功能。主控制板主要功能如下:

(1)利用定時(shí)器精確定時(shí)0.1 s,通過SPI定時(shí)讀取CPLD的計(jì)數(shù)值,并將計(jì)數(shù)值通過串口傳給上位機(jī)。

(2)利用定時(shí)器精確定時(shí)2 s,通過串口定時(shí)查詢泵的壓力值,并將壓力值通過串口傳給液晶屏及上位機(jī)。

(3)利用定時(shí)器精確定時(shí)3 s,通過串口定時(shí)查詢溫控板的溫度,并將溫度通過串口傳給液晶屏及上位機(jī)。

(4)通過讀取IO電平控制PMT和LED的開關(guān),通過串口發(fā)送指令控制泵的開關(guān);接收進(jìn)樣閥的同步信號(hào),控制計(jì)數(shù)的同步開始與停止。

(5)通過串口定時(shí)更新溫度和壓力值以及儀器的工作狀態(tài)。

(6)通過串口接收上位機(jī)的下發(fā)指令,上傳泵壓力,柱溫箱溫度,計(jì)數(shù)值等數(shù)據(jù);接收上位機(jī)的控制指令,控制泵、LED以及計(jì)數(shù)功能的開與關(guān),設(shè)定泵的流量、柱溫箱的溫度。

2.5 電源模塊

圖7為儀器供電需求分析圖?？傠娫礊橥饨拥?20 V交流電,通過100 W的開關(guān)電源將交流220 V轉(zhuǎn)換成直流24 V,再由DC/DC模塊將直流24 V轉(zhuǎn)為直流5 V。CPLD計(jì)數(shù)電路、主控板以及恒溫控制系統(tǒng)的3.3 V直流電由SPX1117M3-3.3的穩(wěn)壓芯片由直流5 V轉(zhuǎn)化而來。

圖7 供電需求分析圖

2.6 其他模塊

RS232/485轉(zhuǎn)網(wǎng)口模塊采用了聯(lián)創(chuàng)科技的一款型號(hào)為SL0110的產(chǎn)品,實(shí)現(xiàn)本地?cái)?shù)據(jù)與以太網(wǎng)數(shù)據(jù)的交換[13]。液晶屏采用了谷鑫公司一款型號(hào)為MT32240A035的產(chǎn)品。該液晶屏分辨率為320像素×240像素,通信波特率為115 200,實(shí)時(shí)顯示柱溫箱的溫度、輸液泵的壓力、泵和LED的開關(guān)狀態(tài)以及整個(gè)儀器的工作狀態(tài)。

3 通信協(xié)議

3.1 通信協(xié)議定義

除了CPLD計(jì)數(shù)電路與主控板之間采用SPI進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸,主控板、恒溫控制系統(tǒng)、分離系統(tǒng)以及上位機(jī)之間均采用串口進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸。根據(jù)實(shí)際需求,設(shè)計(jì)表1通信協(xié)議幀。其中指令位分別為下發(fā)指令0x1010,查詢指令0x1001,數(shù)據(jù)校驗(yàn)采用數(shù)據(jù)段按位異或方式。

表1 協(xié)議幀結(jié)構(gòu)

*為具體指令編碼

3.2 數(shù)據(jù)字段內(nèi)容

整個(gè)數(shù)據(jù)協(xié)議幀共16 byte,其中數(shù)據(jù)字段的內(nèi)容與長(zhǎng)度如表2所示。

表2 協(xié)議幀數(shù)據(jù)段結(jié)構(gòu)

圖8 DS18B20溫度采集流程圖

4 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

4.1 流程圖

柱溫箱的溫度通過DS18B20定時(shí)采集,最終上傳給液晶屏和上位機(jī)。圖8是溫度采集流程圖。

主控板主要負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的傳輸與控制。柱溫箱的溫度、泵的壓力以及CPLD計(jì)數(shù)值等均由主控板接收,最終將所有數(shù)據(jù)打包以RS232方式上傳給液晶屏和上位機(jī)。圖9是主控板工作流程圖。

圖9 主控板工作流程圖

4.2 上位機(jī)軟件

上位機(jī)包括采用C#開發(fā)的具有讀寫串口、曲線繪制功能的測(cè)試軟件以及實(shí)際應(yīng)用測(cè)試采用的清博華科技公司開發(fā)的色譜工作站。

5 性能測(cè)試

5.1 CPLD計(jì)數(shù)功能測(cè)試

CPLD計(jì)數(shù)電路的計(jì)數(shù)上限、計(jì)數(shù)誤差以及計(jì)數(shù)穩(wěn)定性對(duì)儀器的檢測(cè)限、精度以及重復(fù)性均有很大影響,所以做了計(jì)數(shù)性能測(cè)試。

測(cè)試條件:采用Agilent公司81150A型號(hào)的信號(hào)發(fā)生器模擬光子經(jīng)PMT轉(zhuǎn)換后的電脈沖信號(hào)。輸入占空比為50%、Vpp為2.5 V的矩形波信號(hào),通過串口調(diào)試助手接收CPLD的計(jì)數(shù)值。

測(cè)試結(jié)果:實(shí)際最大計(jì)數(shù)值可以達(dá)到44 MHz,計(jì)數(shù)誤差約為0.04%,最大計(jì)數(shù)波動(dòng)值為38(44 MHz頻率信號(hào)輸入),滿足實(shí)際設(shè)計(jì)需要。

5.2 黃曲霉毒素檢測(cè)的應(yīng)用測(cè)試

液相色譜條件:色譜柱:Vertex-C18色譜柱;流動(dòng)相:V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=50∶35∶15;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25°C;LED激發(fā)中心波長(zhǎng):365 nm;熒光發(fā)射中心波長(zhǎng):440 nm。

測(cè)試試劑:如表2所示采用6種不同濃度的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標(biāo)準(zhǔn)混合試劑進(jìn)行測(cè)試,采用B1、G1濃度為2 μg/L,B2、G2濃度為0.005 μg/L標(biāo)準(zhǔn)混合試劑進(jìn)行檢出限測(cè)試。

表2 7種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合試劑

單位:μg/L

測(cè)試圖譜:圖10為B1、G1濃度為2 μg/L,B2、G2濃度為0.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合試劑測(cè)試所得的譜圖。圖中從左到右分別為AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)峰。

圖10 G2、G1、B2、B1標(biāo)準(zhǔn)混合試劑色譜圖

測(cè)試結(jié)果:圖11為AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,由圖10可以看出在0.25 μg/L～8.0 μg/L之間AFB1具有較好的線性關(guān)系[15]。G2、G1、B2、B1檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系如表3所示,檢測(cè)精度、重復(fù)性和檢出限如表4所示。由表3和表4可知儀器的線性度、檢測(cè)精度以及重復(fù)性均較好。其中G1、B1的檢出限可以達(dá)到0.1 μg/kg,這一數(shù)值低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)(B1<2 μg/kg)[16]。

圖11 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

AFT線性范圍/(μg/L)線性方程相關(guān)系數(shù)G20.063～2.000y=3.1742x+1.8428≥0.9997G10.250～8.000y=0.7863x+0.2424≥0.9996B20.063～2.000y=4.9307x+1.5064≥0.9997B10.250～8.000y=1.5858x+0.5484≥0.9995

表4 4種AFT重復(fù)性和檢出限

6 結(jié)論

設(shè)計(jì)并完成了一套緊湊型結(jié)構(gòu)的黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng),采用不同濃度的AFT標(biāo)準(zhǔn)混合試劑進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果表明該儀器性能穩(wěn)定,檢測(cè)速度較快。4種AFT的r值均大于0.999 5,RSD均小于4%,說明儀器的線性度和精密度良好。G1、B1的檢出限可以達(dá)到0.1 μg/kg,G2、B2的檢出限可以達(dá)到0.005 μg/kg,能用于黃曲霉毒素的實(shí)際檢測(cè)。

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Design and Implementation of Aflatoxin Rapid Detection System*

LUQinjia1,2,CAIQiang1,2*,SHENGuojin2,WANGZhenhua2

(1.Electronic Information Institution of HangzhouDianziUniversity,Hangzhou 310018,China;2.Yangtze Delta Region Institute of TsinghuaUniversity,Jiaxing Zhejiang 314006,China)

An integrated structure of aflatoxin detection system is designed and implements based on high-performance liquid chromatography with fluorescence method. This detection system consists of separation system,constant temperature control system,fluorescence detector,main control board and human-machine interface components. It separates aflatoxin by separation system and inspires aflatoxin producing fluorescence by the fluorescence detector. It uses photon counting method to collect the signal and finally through the PC of the chromatography workstation to display the detection results. Test results show that this system has good stability,compact structure,high detection speed and high sensitivity. It can be used for the actual detection of aflatoxin.

high performance liquid chromatography with fluorescence;aflatoxin detection;fluorescence detector;photon counting

項(xiàng)目來源:國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(2012YQ15008705);浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C33009);嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015AY11013)

2016-04-22 修改日期:2016-07-19

TP23

A

1005-9490(2017)03-0748-06

C:7210;7320T

10.3969/j.issn.1005-9490.2017.03.046