喬春元 張懷勤

基托樹脂表面浮游態(tài)白色念珠菌的滅活研究*

喬春元 張懷勤

目的：比較氬氣、30% H2O2和50% H2O2等離子體對樹脂表面浮游白色念珠菌的殺滅效果。方法：將甲基丙烯酸甲酯制作成9mm×9mm×2mm的試件56塊，在濃度為1．0×108CFU/m l白色念珠菌菌懸液中培養(yǎng)2h后取出，PBS輕漂兩次，分為14組(n=4)。對照組不做處理，氬氣等離子體分別處理20s、40s、60s、80s、100s，30% H2O2和50% H2O2等離子體分別處理5s、10s、15s、20s。處理后洗脫、系列稀釋、涂板。48h后計數(shù)菌落形成單位，計算殺滅對數(shù)值。參考?xì)W洲標(biāo)準(zhǔn)EN 1275-2005，處理后真菌減少＞4 log10CFU視為有效。結(jié)果：氬氣等離子體處理100s、30% H2O2和50% H2O2等離子體處理15s后，白色念珠菌數(shù)量降低均＞4 log10CFU，均能達(dá)到有效殺滅。結(jié)論：氬氣、30% H2O2和50% H2O2等離子體均能有效殺滅樹脂表面浮游白色念珠菌。30% H2O2和50% H2O2等離子體殺菌效能優(yōu)于氬氣等離子體。

等離子體；丙烯酸樹脂；白色念珠菌；消毒

口腔是一個復(fù)雜的生態(tài)系，口腔正常微生物群包含細(xì)菌、真菌和病毒。目前可摘義齒仍然是牙缺失的修復(fù)方法之一,可摘義齒戴入口腔后，暴露于口腔微生物，會被細(xì)菌、病毒和真菌污染。在調(diào)改、修理和重襯過程中口腔醫(yī)生和技師會頻繁接觸義齒，在此之前應(yīng)對義齒進(jìn)行消毒，避免意外感染[1]。常用的義齒清潔劑和化學(xué)消毒劑可造成表面顏色和粗糙度變化，甚至形成微孔[2]。低溫等離子體技術(shù)作為消毒醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項新興技術(shù)，其良好的殺菌性能已得到諸多學(xué)者的肯定。低溫等離子體消毒技術(shù)具有快速，高效，無有害物質(zhì)殘留，且對材料本體性能無影響等優(yōu)點(diǎn)。前期研究采用等離子體對印模表面乙肝病毒、石膏模型表面金黃色葡萄球菌進(jìn)行處理，均已取得良好的殺滅效果。本研究采用氬氣、30%H2O2和50%H2O2等離子體，對樹脂表面浮游態(tài)白色念珠菌分別處理不同時間，評估三種等離子體殺菌效果。

1．材料與方法

1．1 材料與設(shè)備聚甲基丙烯酸甲酯基托材料(日進(jìn)中國昆山合資公司)；國際標(biāo)準(zhǔn)菌株白色念珠菌(ATCC90028, 南京便診生物科技有限公司)；50%過氧化氫(南京康克化工有限公司)；30%過氧化氫(滬試，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；離心機(jī)( Thermo，Electron Corporation，德國)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；恒溫振蕩器(上海易亮醫(yī)療器械有限公司)；細(xì)菌比濁儀(上海昕瑞儀器儀表有限公司)；HPD-2400次大氣壓輝光放電低溫等離子體表面處理機(jī)(南京蘇曼電子有限公司)；全自動菌落分析儀(Scan1200, Interscience,法國)。

1．2 基托試件制作將聚甲基丙烯酸甲酯基托材料制成9mm×9mm×2mm的試件56塊，表面用600目、800目、1000目砂紙沿同一方向打磨，實驗前所有試件先蒸餾水清洗，后超聲振蕩清洗20m in，并在紫外光下正反面分別照射20m in 滅菌備用。

1．3 試件染菌將復(fù)蘇的白色念珠菌(ATCC 90028) 種于沙堡培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)傳5-7代后，取其培養(yǎng)物，于液態(tài)培養(yǎng)基中增菌，37 ℃恒溫振蕩器(180r/m in)搖床培養(yǎng)18h。取增菌產(chǎn)物，離心機(jī)離心(5000r/m in，4℃，6m in) 和磷酸鹽緩沖液(phosphate bufffered saline，PBS)清洗2 次后，制備PBS菌懸液，通過細(xì)菌比濁儀測定其MCF(麥?zhǔn)蠞岫葐挝?值為0．333，即濃度為1．0×108CFU/m l。試件在滅菌PBS液中浸泡2h后放入24孔板內(nèi)，每孔加入1m lPBS菌懸液，在30℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置2h。

1．4 等離子體處理從PBS菌懸液取出試件并用PBS輕漂兩次。分為對照組和13個處理組，n=4。對照組不做等離子體處理，氬氣等離子體分別處理20s、40s、60s、80s、100s，30%H2O2和50%H2O2等離子體分別處理5s、10s、15s、20s。輝光放電時電壓220V，電極距離55mm，電流1．5-1．8A。進(jìn)行氬氣等離子體處理時，標(biāo)本放于處理基臺上，用真空泵將氣壓降至1800-2000Pa后通入氬氣(氣體流量約500m l/m in)，當(dāng)氣壓升至大氣壓，用真空泵再次調(diào)壓至1800-2000Pa，輝光放電。采用30%H2O2和50%H2O2等離子體處理時，將標(biāo)本和1m l 30%H2O2(或50%H2O2)溶液放于處理基臺上，真空泵調(diào)壓至1800-2000Pa，輝光放電。

1．5 洗脫計數(shù)將處理后的試件于2m l PBS液中浸泡2h，超聲震蕩5m in，取200μl菌液系列稀釋、涂板，37℃培養(yǎng)48h，用全自動菌落分析儀計數(shù)菌落形成單位，取每組洗脫菌量均值對數(shù)值，計數(shù)殺滅對數(shù)值，評估三種等離子體對試件表面浮游態(tài)白色念珠菌的殺菌效果。殺滅對數(shù)值為對照組和處理組洗脫菌量對數(shù)值之差。參考?xì)W洲標(biāo)準(zhǔn)EN 1275-2005，處理后真菌減少＞4 log10CFU視為有效。

2. 結(jié)果

2．1 氬氣等離子體殺菌效果(表1) 氬氣等離子體處理20s后，樹脂試件表面的白色念珠菌數(shù)量從5．317 log10CFU下降至4．458 log10CFU，即殺滅對數(shù)值為0．859 log10CFU；處理時間延長至100s后，洗脫的真菌數(shù)量僅為1．301 log10CFU，殺滅對數(shù)值達(dá)4．016 log10CFU，能達(dá)到有效消毒的要求。

2．2 30%H2O2等離子體殺菌效果(表2) 30% H2O2等離子體處理5s，白色念珠菌菌量降低至2．928 log10CFU，殺滅對數(shù)值為2．389 log10CFU；延長處理時間至15s后，存活數(shù)量為1．097 log10CFU，殺滅對數(shù)值達(dá)4．220 log10CFU，達(dá)到消毒要求；繼續(xù)延長處理時間至20s，白色念珠菌僅剩0．875 log10CFU，殺滅對數(shù)值為4．442 log10CFU。

表1 氬氣等離子體對白色念珠菌的殺菌效果(n=4)

表2 30%H2O2等離子體對白色念珠菌的殺菌效果(n=4)

2．3 50%H2O2等離子體殺菌效果(表3) 50% H2O2等離子體處理試件5s后，真菌數(shù)量為2．562 log10CFU，殺滅對數(shù)值為2．755 log10CFU ；延長處理時間至15s，樹脂表面菌量為1．011 log10CFU，殺滅對數(shù)值為4．306 log10CFU，達(dá)到消毒要求；50% H2O2等離子體處理20s，僅有0．699 log10CFU真菌存活，殺滅對數(shù)值為4．618 log10CFU。

表3 50%H2O2等離子體對白色念珠菌的殺菌效果(n=4)

3．討論

有研究發(fā)現(xiàn)牙科診室和技工室之間微生物傳播，可導(dǎo)致口腔醫(yī)護(hù)人員和技師罹患感染[2]。美國牙科協(xié)會規(guī)定印模及使用過的修復(fù)體在送往技工室之前應(yīng)該進(jìn)行清洗并消毒。白色念珠菌致病性強(qiáng)，是口腔中最常見的真菌病原體。戴用義齒后，75%患者口腔內(nèi)會定植白色念珠菌，通常來源于義齒的組織面，而不是黏膜[3]，因此白色念珠菌是義齒性口炎的主要病原體。義齒性口炎患者常有燒灼感、味覺減退、不適等主訴[4]，且治療后常有復(fù)發(fā)，影響患者的生活質(zhì)量。伴有白色念珠菌感染的口腔黏膜白斑，發(fā)生上皮異常增生和癌變的可能性增加[5]。義齒基托在制作、復(fù)診過程中所采用的消毒方法可分為化學(xué)消毒法、微波輻射法和機(jī)械法。單獨(dú)使用機(jī)械法往往達(dá)不到消毒要求，化學(xué)消毒法和微波消毒法可對基托的強(qiáng)度、色澤穩(wěn)定性、表面粗糙度等造成不良影響[6]。醫(yī)療物品一旦被念珠菌污染即可形成念珠菌生物膜，念珠菌生物膜對抗真菌藥物的耐受較浮游菌更強(qiáng)[7]。因此，應(yīng)及時清除物體表面的浮游菌，以免形成生物膜，增加消毒難度。

白色念珠菌細(xì)胞壁是由甲殼素和β-D-葡聚糖組成的多糖網(wǎng)，支持其機(jī)械強(qiáng)度，為糖蛋白提供共價結(jié)合的支架[8]。K lampfl等[9]比較了低溫大氣壓空氣等離子體對4種革蘭陰性菌、11種革蘭陽性菌和白色念珠菌的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌最難殺滅。故本研究采用氬氣、30%H2O2和50% H2O2作為放電介質(zhì)，評估三種等離子體對白色念珠菌的殺菌效果。由本研究結(jié)果可知?dú)鍤獾入x子體處理時間延長至100s，對白色念珠菌的殺滅對數(shù)值升高至4．016 log10CFU；而30%H2O2和50%H2O2等離子體處理15s，白色念珠菌的殺滅對數(shù)值均＞4 log10CFU，隨著處理時間的延長，兩種過氧化氫等離子體對白色念珠菌的殺滅效果進(jìn)一步增強(qiáng)。為了達(dá)到EN 1040-2005消毒標(biāo)準(zhǔn)的要求，氬氣等離子體所需時間較長(100s)，30%H2O2和50%H2O2等離子體處理15s即可達(dá)到有效消毒。等離子體能產(chǎn)生影響殺菌效果的活性物質(zhì)，包括正負(fù)離子和電子、自由基(電離激發(fā)的分子產(chǎn)物)、穩(wěn)態(tài)的反應(yīng)性原子和分子(如臭氧和氫氣)、過氧化物、亞穩(wěn)態(tài)的原子和分子、高能光子(如紫外線)等[10]。等離子體的殺菌作用大多歸因于其產(chǎn)生的活性氧成分，如O2、O、OH、NO、H2O2等，可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、鐵硫依賴性脫氫酶和單核鐵蛋白的失活、DNA損傷，最終對細(xì)胞造成氧化損傷[11]，其它成分僅起微弱協(xié)同作用。有研究[12]提出等離子體中的活性氧成分通過以下機(jī)制殺菌：(i)對細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的直接穿通，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)滲漏；(ii)氧化物或氮化物導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白的致命損傷；(iii)DNA的直接化學(xué)損傷。隨著等離子體處理時間的增加，對白色念珠菌的損傷持續(xù)進(jìn)行，最終造成細(xì)胞死亡。氬氣等離子體和過氧化氫等離子體對浮游態(tài)白色念珠菌殺菌效果的差異主要由于它們中的活性氧成分含量不同。氬氣等離子體主要放電介質(zhì)為氬氣，30%H2O2和50% H2O2等離子體的放電介質(zhì)中含有過氧化氫，故輝光放電后過氧化氫等離子體中活性氧成分含量高，能快速、高效殺滅基托樹脂表面的浮游態(tài)白色念珠菌。

本實驗為系列研究的一部分，前期已采用等離子體技術(shù)對印模表面乙肝病毒、石膏模型表面金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺滅研究，均取得良好的效果。本研究結(jié)果顯示氬氣、30%H2O2和50%H2O2等離子體均能有效殺滅白色念珠菌，30%H2O2和50% H2O2等離子體的殺真菌效能較氬氣等離子體更強(qiáng)，可見等離子體是一項有應(yīng)用前景的消毒技術(shù)。

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Study on inactivation of planktonic Candida albicanson the surfaceofdenturebase resin

QIAO Chun-yuan,ZHANG Huai-qin(Jiangsu Key Laboratory of Oral Diseases,Nanjing Medical University; Departmentof Prosthodontics,Affiliated Hospitalof Stomatology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective:To investigate the fungicidal effects of different plasma (argon, 30%H2O2and 50%H2O2plasma) on planktonic Candida albicans on the surface of acrylic resin. Methods:Candida albicans were inoculated on polymethyl methacrylate specimens with the size of 9mm×9mm×2mm. Fifty-six resin specimens were random ly divided into fourteen groups (n=4). The specimens in control group did not receive any treatment and the other groups were exposed to argon, 30%H2O2and 50%H2O2plasma for different time durations. Each specimen was immersed into phosphate bufffered saline (PBS) for 2h and sonicated for 5 m in in an ultrasonic bath sonicater. PBS cell suspensions of corresponding specimens were serially diluted. Then aliquots of appropriate dilutions (200μl) were inoculated on Sabouraud dextrose agar and incubated at 37℃for 48h before the colonies were counted. The anticandidal efficacy of plasma was evaluated by the reduction of colony forming units(CFU) in log10. Reduction of 4 log10CFU was regarded as the threshold of clinical relevance in accordance with EN 1275-2005. Resu lts:The reduction of viable Candida albicans on the resin was 4.016 log10CFU with 100s of argon plasma treatment. The inactivation efficacy of 4.220 log10CFU was observed after 15s for 30%H2O2plasma treatment time. The reduction of viable fungi was 4.442 log10CFU w ith the prolonged exposure time of 20s. The anticandidal efficacy of 4.306 log10CFU w as achieved after 15s 50%H2O2plasma treatment. The reduction of Candida albicans cells was increased further up to 4.618 log10CFU when 50%H2O2plasma treatment time extended to 20s. Conclusions:Argon, 30%H2O2and 50%H2O2plasma are effective in inactivation of planktonic Candida albicans on the resin. The anticandidal effects of 30%H2O2and 50%H2O2plasma are superior to that of argon plasma.

Plasma; acrylic resins; Candida albicans; disinfection

R783．6

A

1672-2973(2017)02-0103-04

2016-10-28)

喬春元 南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實驗室，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科碩士生江蘇210029

張懷勤 通訊作者南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實驗室，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科主任醫(yī)師副教授江蘇210029