李宗平

（湖北省煙草科學研究院/中國煙草白肋煙試驗站，武漢 430030）

不同雜交方式對白肋煙煙堿轉化率的影響

李宗平

（湖北省煙草科學研究院/中國煙草白肋煙試驗站，武漢 430030）

采用白肋煙B37的高煙堿轉化品系（HC）和低轉化品系（LC）進行正、反雜交試驗，分析比較雙親與正、反交F1的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉化率的平均值、群體分布頻率特點和雜種優(yōu)勢的大小。結果表明：低轉化材料作母本F1（正交）煙堿含量表現出24.58%的正向平均優(yōu)勢，降煙堿和煙堿轉化率則為49.79%和57.43%的負向平均優(yōu)勢；以高轉化率材料作母本，F1（反交）表現出同樣的趨勢，但雜種優(yōu)勢小于正交F1。為此認為，雄性不育雜交一代優(yōu)勢利用是選育低煙堿轉化、低煙草特有亞硝胺（TSNA）含量新品種的有效方法，其中選擇純合的低煙堿轉化品系作雜交母本尤為主要。

白肋煙；正交；反交；生物堿；轉化率；雜種優(yōu)勢

煙草生物堿主要包括煙堿、降煙堿和微量的新煙堿和假木賊堿。降煙堿，亦稱去甲基煙堿，可由煙堿脫甲基形成，正常情況下降煙堿含量不超過生物堿總含量的3.5%。由于降煙堿屬仲胺類的降煙堿，在煙葉調制和陳化過程中代謝比較活躍，極易發(fā)生亞硝化反應生成煙草特有亞硝胺（TSNA）中具有強致癌作用的N-亞硝基降煙堿（NNN），從而嚴重影響到煙葉的安全性和人類健康。同時降煙堿還易于氧化、?；磻甥溗姑鳎é?氧基煙堿）和一系列的酰化降煙堿，直接改變煙葉和煙氣化學成分的組成和含量，對煙葉的香味品質產生不利影響[1-3]。美國已將降煙堿作為考核新品種的主要指標，并制定了降煙堿含量不超過總生物堿15%的標準[1，3]。普通煙草是純合雙隱性基因型（ctctcscs），不具有煙堿去甲基能力，但在栽培品種的煙株群體中，一些煙株往往會因為基因突變，形成煙堿轉化能力，導致煙堿含量顯著降低，降煙堿含量大幅增加[3]。史宏志等[4]通過對國內不同煙草類型降煙堿及煙堿向降煙堿轉化研究后認為，白肋煙降煙堿含量及煙堿轉化率較高，問題突出。史宏志等[5]、李進平等[6]在對白肋煙鄂煙1號煙堿向降煙堿轉化的遺傳改良研究中發(fā)現，母本的MSB21和保持系B21的群體中都含有極高比例的轉化株，而作為父本的B37轉化株較少，認為鄂煙1號的高轉化株比例主要由母本引起。本研究的目的在于通過相同親本進行正反交測驗，分析雜交親本對其F1生物堿及煙堿轉化率的影響，為以降低煙草特有亞硝胺（TSNA）含量為目標的白肋煙新品種選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 P1：白肋煙B37 低煙堿轉化率品系（LC），P2：B37高煙堿轉化率品系（HC）。正交P1×P2（F1）和反交P2×P1（F1），共4份。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗 2011年對白肋煙B37原種群體進行連續(xù)選擇4代的低煙堿轉化株（LC）和高煙堿株（HC）單株選擇，2014年在恩施煙草良種繁殖基地種植性狀穩(wěn)定的P1（LC）、P2（HC）材料，配制正交（P1×P2）、反交（P2×P1）雜交組合。2015年進行P1、P2，及正、反交雜交F1等4份材料的田間試驗，其中P1、P2各種植60株，取樣55株，正、反交雜交F1各種植30株，取樣20株。田間種植方法同白肋煙大面積生產。

1.2.2 轉化率誘導鑒定 煙株團棵期取9~10葉位（由下至上）煙葉2片，樣品按H.Z.Shi等〔7〕的誘導方法進行煙堿轉化率化學誘導。即摘取煙葉后，噴施2-氯乙基磷酸水溶液后保濕晾制，待煙葉變黃后，測定煙葉的煙堿和降煙堿含量。煙堿轉化能力用煙堿轉化率表示，即降煙堿含量占煙堿和降煙堿含量之和的百分比，可由下式計算。

煙堿轉化率（%）＝[降煙堿含量/（煙堿含量+降煙堿含量）]×100

根據煙堿轉化率將煙株分為非轉化株（煙堿轉化率低于3%）、低轉化株（煙堿轉化率3%~20%）、中轉化株（煙堿轉化率20%~50%）和高轉化株（煙堿轉化率大于50%）[3]。

1.2.3 生物堿測定 生物堿測定采用氣相色譜法。樣品經烘干后粉碎，每樣品稱取100mg，用三氯甲烷提取生物堿。氣相色譜儀為Agilent-6890，檢測器為FID，具體操作和參數設定按H.R.Burton等[8]的方法進行。

1.2.4 雜種優(yōu)勢分析 雜種優(yōu)勢是指雜交一代的某些性狀優(yōu)于雙親的現象。分為平均優(yōu)勢和超親優(yōu)勢[9]。

平均優(yōu)勢，雜種一代（F1）超過雙親平均值（MP）的百分比。

超親優(yōu)勢，雜種一代（F1）超過其最好親本（HP）的百分比。

2 結果與分析

2.1 群體平均生物堿含量及煙堿轉化率比較 從表1可以看出，P1、P2的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉化率存在較大差異，其中P1（B37LC）煙堿含量較高在17.08~24.92mg/g之間，降煙堿含量、煙堿轉化率較低，分別在1.02~1.55 mg/g和4.09%~6.68%之間；P2（B37HC）煙堿含量較低在1.33~12.57mg/g之間，降煙堿含量、煙堿轉化率較高，分別為6.66~ 15.55mg/g和41.51%~87.56%。正交F1煙堿含量較高為14.36~19.08mg/g，降煙堿含量、煙堿轉化率較低，分別為1.79~3.45 mg/g和9.33%~16.80%；反交F1煙堿含量在12.11~16.73mg/g之間，降煙堿含量、煙堿轉化率分別在3.35~5.20 mg/g和17.00%~ 29.08%之間；正交F1和反交F1的煙堿、降煙堿和煙堿轉化率均在P1和P2之間，但均偏向P1，且正交F1平均煙堿含量高于反交F1，而降煙堿、煙堿轉化率則反交F1高于正交F1（表2）。

表1 P1、P2生物堿含量及煙堿轉化率比較

表2 正、反交F1的生物堿含量及煙堿轉化率比較

2.2 分布頻率分析 進一步分析煙株群體的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉化率的分布頻率，結果如圖1~3所示。煙堿含量P1的頻率高峰在23mg/g位點，P2的在7mg/g，正交F1在19mg/g，反交F1在15mg/g；降煙堿則P1的頻率高峰在1.5mg/g，P2在12mg/g，正交F1在3.5mg/g，反交F1在5mg/g；P1的煙堿轉化率頻率高峰在4%；P2在70%；正交F1在15%；反交F1在25%。因此得知，正交F1和反交F1的煙堿、降煙堿和煙堿轉化率的頻率高峰位點均在P1、P2之間，但均向P1偏移，且以正交F1更明顯。

圖1 雙親及正反交F1群體煙堿分布頻率

圖2 雙親及正反交F1群體降煙堿分布頻率

圖3 雙親及正反交F1群體煙堿轉化率分布頻率

2.3 雜種優(yōu)勢分析 在前述平均值比較及分布頻率分析的基礎上，進一步分析正、反交F1的雜種優(yōu)勢大小。結果表明（表3）：正、反交F1的煙堿含量均存在正向的平均優(yōu)勢，且正交F1大于反交F1；而降煙堿含量、煙堿轉化率均表現為負向優(yōu)勢，尤以煙堿轉化率的負向優(yōu)勢更明顯，且正交F1優(yōu)勢的絕對值大于反交F1。煙堿、降煙堿及轉化率均無超親雜種優(yōu)勢。

表3 正、反交F1的雜種優(yōu)勢分析

3 結論與討論

本研究結果表明，不同煙堿轉化率類型的品系雜交，雜交F1的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉化率均大幅度偏離雙親平均值，其中煙堿含量表現出正向平均優(yōu)勢，降煙堿和煙堿轉化率則為負向平均優(yōu)勢。與筆者之前白肋煙生物堿和煙堿轉化率的配合力及遺傳力的研究結果[10]基本一致。

目前人們普遍認為栽培品種煙堿含量由2對獨立的顯性Nic1Nic1Nic2Nic2基因控制，鮮葉煙堿含量一般較高，但晾制和陳化過程中由于存在煙堿向降煙堿轉化問題，導致煙堿轉化為降煙堿。煙堿轉化由顯性CtCtCsCs基因控制，2個位點均為隱形基因型即ctctcscs不具備煙堿轉化能力[3-5]。由此推斷，同為栽培品種的不同煙堿轉化類型品系的煙堿基因型均為Nic1Nic1Nic2Nic2，只是轉化率基因型不同，低轉化品系的轉化率基因型為ctctcscs，高轉化品系為CtCtCsCs，雜交F1的基因型應是CtctCscs，性狀表現應為顯性，即低煙堿、高降煙堿含量、高轉化率，煙堿含量低于雙親平均值為負向雜交優(yōu)勢，降煙堿和轉化率大于雙親平均值，具有正向雜種優(yōu)勢，這顯然不能解釋本研究結果。本研究中的材料為同一品種經人為選擇后的不同轉化率類型品系，遺傳背景除煙堿、降煙堿及轉化率外，其他性狀應完全一致，從而排除了其他基因的連鎖與干擾，但煙堿、降煙堿及轉化率的煙株群體分布頻率結果表明，高轉化親本P2的轉化率在41.51%~87.56%之間，平均值62.77%，據前人研究結果 ctcs基因型的轉化率3%~9%，Ctcs基因型17%~51%，CtCs基因型73%~94%[3]推測，本研究中的P2可能尚屬雜合基因型，且Ctctcscs存在較大的比例，由于雜交F1基因型中ctctcscs的大量積累，從而導致降煙堿及轉化率的表現型產生負向雜種優(yōu)勢。同時，在本研究中煙堿、降煙堿及轉化率均無超親雜種優(yōu)勢。由此推斷，一是白肋煙煙堿、降煙堿及轉化率的遺傳主要受微效多基因控制，且基因對數可能不止已知的2對，雜種優(yōu)勢的產生是隱性多基因累加的結果；二是在白肋煙雄性不育雜交一代優(yōu)勢利用過程中，P1是純合的低轉化率材料，P2只要不是純合的高轉化率材料，均可獲得轉化率低于雙親平均值的雜交F1；三是目前劃分非、低、中、高轉化株，特別是非和高轉化株的界定值的合理性有待進一步商榷。

從原理上講，正交F1和反交F1的基因型應該是完全一致的，但在本研究中發(fā)現正交F1的雜種優(yōu)勢大于反交F1的現象，初步推測可能與廣泛存在于細胞質中的各種功能酶有關，同時亦排除其他遺傳物質參與的可能。

綜上所述認為：在白肋煙新品種選育中，充分利用雜交F1具有較大的煙堿含量正向雜交優(yōu)勢、降煙堿和煙堿轉化率負向雜交優(yōu)勢的特點，是目前選育低煙堿轉化、低TSNA含量新品種的主要途徑和方法，其中選擇純合的低或非煙堿轉化品系作雜交母本尤為關鍵。

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2017-02-20）

湖北省煙草專賣局項目（027Y2011-055）