不同pH值甲醛固定液對腎臟標(biāo)本特殊染色的影響

朱小蘭，駱新蘭，張科平，武鴻美，許 潔

不同pH值甲醛固定液對腎臟標(biāo)本特殊染色的影響

朱小蘭，駱新蘭，張科平，武鴻美，許 潔

腎臟；甲醛；pH值；特殊染色

特殊染色是腎臟病理診斷不可缺少的依據(jù)，而特殊染色制片質(zhì)量是否穩(wěn)定直接影響到病理診斷的準(zhǔn)確性、及時(shí)性。制片質(zhì)量受多種因素影響，其中最關(guān)鍵的是腎臟組織光鏡標(biāo)本的固定，因此固定液的選擇至關(guān)重要。本文將對配制的三種不同pH值的甲醛固定液用于腎臟組織光鏡標(biāo)本的固定情況進(jìn)行比較，觀察腎臟組織切片六胺銀、Masson三色、高碘酸-無色品紅等特殊染色的染色效果，找到腎臟組織固定效果最好的固定液配制方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集廣東省人民醫(yī)院2014年10月～2015年4月腎內(nèi)科腎臟穿刺送檢組織、外院腎臟穿刺送檢組織切片共359例，其中男性238例，女性121例，年齡23～76歲，平均49歲。

1.2 儀器與設(shè)備 Shandon全自動(dòng)密閉脫水機(jī)、Shandon Histocentre 3包埋機(jī)、Shandon MICROM HM340-E切片機(jī)、Shandon全自動(dòng)封片機(jī)、10～100 ℃恒溫烘干箱、標(biāo)簽打印機(jī)。

1.3 固定劑 A組：10%中性緩沖福爾馬林；B組：10%酸性緩沖福爾馬林；C組：10%堿性緩沖福爾馬林。

1.4 固定液配制 10%中性緩沖福爾馬林、10%酸性緩沖福爾馬林、10%堿性緩沖福爾馬林均為混合PBS-福爾馬林固定液，pH值分別為7.0、6.0、9.0(取磷酸二氫鈉4.0 g與磷酸氫二鈉6.5 mg，加水溶解成900 mL溶液，再加40%甲醛100 mL配制而成，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH值為6.0、7.0和9.0的固定液)。

1.5 方法

1.5.1 標(biāo)本制備 切取標(biāo)本時(shí)，動(dòng)作一定要輕，切勿擠壓，避免人為破壞腎組織結(jié)構(gòu)，且應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)切取標(biāo)本。將新鮮的腎臟標(biāo)本沿腎門切開，取皮髓質(zhì)交界處組織，按照取材大小(1.2 cm×0.5 cm×0.1 cm)切取4塊，分別固定在4種預(yù)先配制好的固定液中。固定5 h后取出，當(dāng)天下午5點(diǎn)半用全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟等處理[1-2]。

1.5.2 方法 4組標(biāo)本分別進(jìn)行包埋、連續(xù)切片(厚1 μm)，依次裱片于3張載玻片上，進(jìn)行Masson三色、六胺銀、高碘酸-無色品紅染色。上述三種特殊染色中的試劑配制和操作流程均按文獻(xiàn)要求進(jìn)行[3]。3張組織切片的Masson三色染色、3張組織切片的六胺銀染色、3張組織切片的高碘酸-無色品紅染色均在相同條件下進(jìn)行，以保證結(jié)果客觀、可信。

1.5.3 評定標(biāo)準(zhǔn) 優(yōu)：組織切片結(jié)構(gòu)完整，顏色鮮艷，均勻一致，腎小球毛細(xì)血管、系膜細(xì)胞清晰，細(xì)胞無收縮；良：細(xì)胞相對清晰，有輕度收縮，形態(tài)發(fā)生一定改變，核著色分明；差：組織結(jié)構(gòu)模糊，普遍有核溶解現(xiàn)象，胞質(zhì)染色不清晰，色彩黯啞，染色對比度差。

2 結(jié)果

2.1 3組固定液對三種特殊染色切片質(zhì)量效果比較 通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，10%中性緩沖福爾馬林組，Masson三色法顯示組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管胞質(zhì)和紅細(xì)胞呈鮮紅色，免疫復(fù)合物呈紅色，膠原纖維、腎小球基膜、系膜呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。六胺銀染色顯示組織結(jié)構(gòu)清晰：基膜著色深，背景清晰。高碘酸-無色品紅染色顯示組織結(jié)構(gòu)清晰：基膜著色呈鮮紅色，背景清晰；10%酸性緩沖福爾馬林、10%堿性緩沖福爾馬林2組固定液Masson三色法染色的結(jié)果：組織結(jié)構(gòu)不清晰，有核溶解、核固縮現(xiàn)象，胞質(zhì)染色不清晰，三色對比度差，染色對比度差。10%酸性緩沖福爾馬林、10%堿性緩沖福爾馬林2組固定液六胺銀法、高碘酸-無色品紅染色的結(jié)果：組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有核溶解、核固縮現(xiàn)象，基膜著色深，背景較清晰(10%酸性緩沖福爾馬林)，背景紅染(10%堿性緩沖福爾馬林)(表1，圖1～3)。

表1 3組固定液對359例腎臟組織三種特殊染色鏡下切片質(zhì)量效果比較

2.2 3組固定液對三種特殊染色切片質(zhì)量等級比較 10%中性緩沖福爾馬林組：組織無明顯收縮，平整度好，切片連續(xù)完整，染色優(yōu)良率在95%以上；10%酸性緩沖福爾馬林和10%堿性緩沖福爾馬林2組固定液：腎組織結(jié)構(gòu)均不清晰，有核溶解、核固縮現(xiàn)象，胞質(zhì)染色不清晰，三種特殊染色的優(yōu)良率僅12%～31%(表2)。

3 討論

3.1 固定液的作用 固定液的選擇至關(guān)重要，理想的固定液要滿足三點(diǎn)[4]：(1)滲透快，盡可能減少細(xì)胞自溶性變化；(2)不改變組織細(xì)胞原來生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)，不產(chǎn)生人工假象和變形；(3)盡可能保持組織細(xì)胞內(nèi)抗原活性，防止抗原彌散和丟失，因?yàn)楣潭ㄒ旱膒H值可直接影響滲透作用、滲透壓、染色強(qiáng)度及背景染色。

3.2 中性固定液對腎臟穿刺組織的作用 10%中性緩沖福爾馬林固定液可使新鮮組織中的蛋白質(zhì)沉淀，細(xì)胞保存完好不被溶解，組織形態(tài)好，固定均勻，收縮少，既最大程度保存了組織結(jié)構(gòu)的完整，有利于切薄片進(jìn)行特殊染色，并使細(xì)胞內(nèi)不同成分產(chǎn)生不同的折光率，對染料產(chǎn)生不同的親和力，經(jīng)染色后容易區(qū)分[5]。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖1 A.10%中性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管胞質(zhì)和紅細(xì)胞呈鮮紅色，膠原纖維、腎小球基膜、系膜、呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，三色對比清晰；B.10%酸性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)不清晰，腎小管胞質(zhì)和紅細(xì)胞顏色黯啞，核溶解呈空泡狀，三色對比不鮮明；C.10%堿性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)不清晰，腎小管胞質(zhì)和紅細(xì)胞顏色深紅，核溶解呈空泡狀，三色對比差，Masson三色染色 圖2 A.10%中性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)清晰，基膜呈黑色，背景清晰；B.10%酸性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)欠清晰，基膜呈黑色，核溶解呈空泡狀，背景清晰；C.10%堿性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞腫脹，基膜呈黑色，背景均質(zhì)紅染，六胺銀染色 圖3 A.10%中性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)清晰，基膜呈鮮紅色，背景清晰；B.10%酸性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)欠清晰，核溶解呈空泡狀，基膜呈紅色，背景清晰；C.10%堿性緩沖福爾馬林固定：腎組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞腫脹，基膜呈紅色，核溶解呈空泡狀，高碘酸-無色品紅染色

表2 3組固定液對359例腎組織三種特殊染色切片質(zhì)量等級比較[n(%)]

3.3 酸性固定液對腎臟穿刺組織的影響 組織甲醛久存易致氧化產(chǎn)生甲酸而呈酸性，pH值的影響十分明顯，在酸性環(huán)境下(-NH3)不能與水合甲醛發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)固定液放置一段時(shí)間后可發(fā)生重聚作用，而且重聚作用的速度取決于pH值，pH值低時(shí)聚合加快，使固定效果急劇下降[6]，腎組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，殘缺，細(xì)胞變形、變位，溶液呈酸性，影響Masson三色染色中麗春紅、亮綠染色，所制出的切片效果很差，難以診斷。

3.4 堿性固定液對腎臟穿刺組織的影響 在pH>8.0的堿性固定液中，腎組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，殘缺，有核溶解現(xiàn)象，抗原物質(zhì)被破壞，染色定位差，易產(chǎn)生染色背景，影響對腎小管毛細(xì)血管壁及系膜細(xì)胞的觀察。3組固定液中以10%中性緩沖福爾馬林對腎臟組織的固定效果最佳(表1、2)。

3.5 固定液的規(guī)范使用 手術(shù)標(biāo)本的無可替代性與不可重復(fù)性決定了固定液配制的重要性。由于固定液具有較強(qiáng)刺激性、毒性、腐蝕性，易揮發(fā)并對人體健康有危害，目前大多數(shù)醫(yī)院都在使用商品化固定液，而甲醛久存則氧化產(chǎn)生甲酸而呈酸性，因此，病理科對臨床科室應(yīng)重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)固定液的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。首先，要求商品化固定液的生產(chǎn)廠家必須三證(營業(yè)執(zhí)照、生產(chǎn)許可證、衛(wèi)生許可證)齊全。其次，要定期檢查固定液的生產(chǎn)日期、有效期和固定液的pH值。最后，在標(biāo)本送檢方面，病理科應(yīng)定期抽查臨床科室送檢標(biāo)本固定液的有效期和pH值，將抽查結(jié)果詳細(xì)統(tǒng)計(jì)并反饋給醫(yī)務(wù)部門和臨床科室，對于不符合要求的送檢標(biāo)本，應(yīng)積極與臨床科室溝通，強(qiáng)調(diào)標(biāo)本固定的重要性，確保臨床科室按要求將離體標(biāo)本及時(shí)固定，并保證標(biāo)本完全浸泡在固定液中，達(dá)到送檢標(biāo)本的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，降低醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。

[1] 孟 奎, 馬恒輝, 石群立, 等. 病理制片質(zhì)量控制[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2001,17(5):439-440.

[2] 楊 楓. 影響HE染色細(xì)胞形態(tài)的因素控討[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 1999,15(4):361.

[3] 凌啟波.實(shí)用病理特殊染色和組化技術(shù)[M]. 廣州: 廣東高等教育出版社, 1989:238-241.

[4] 楊美娟. 組織標(biāo)本固定方法與免疫組織化學(xué)染色效果的關(guān)系[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2003,9(1):89-90.

[5] 全國衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)資格考試專家委員會(huì). 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013:261-262.

[6] 王伯沄, 李玉松, 黃高昇, 等. 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2000:67-70.

國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目(S2013010014009)

廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病理醫(yī)學(xué)部病理科，廣州 510080

朱小蘭，女，副主任技師。E-mail：zxlllp@163.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.027.html

R 446.8

B

1001-7399(2017)04-0458-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.027

接受日期：2016-12-19