巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型的建立和鑒定

張汝鋼, 張修禮, 楊云生

1. 解放軍總醫(yī)院海南分院消化科, 海南 三亞 572013; 2. 解放軍總醫(yī)院消化科

巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型的建立和鑒定

張汝鋼1, 張修禮2, 楊云生2

1. 解放軍總醫(yī)院海南分院消化科, 海南 三亞 572013; 2. 解放軍總醫(yī)院消化科

目的 建立和鑒定巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型。方法 采用在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射金葡菌和自體靜脈血凝塊混合物的方法建立化膿性肝膿腫模型。采用膿液涂片革蘭染色、膿液培養(yǎng)和PCR方法鑒定化膿性肝膿腫的致病菌。采用石蠟切片HE染色法評(píng)估化膿性肝膿腫的病理分期。結(jié)果 利用金葡菌ATCC 29213和自體靜脈血凝塊混合物于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射的方法建立了化膿性肝膿腫模型。膿液涂片革蘭染色、膿液培養(yǎng)和PCR結(jié)果表明引起化膿性肝膿腫的致病菌為注入的細(xì)菌。膿腫石蠟切片HE染色結(jié)果表明造模術(shù)后第15天為膿腫前期、第21天為膿腫形成期、第33天為膿腫恢復(fù)期。結(jié)論 首次建立了巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型?；撔愿文撃[模型的建立為探討化膿性肝膿腫的新的治療模式提供了可能。

金葡菌；巴馬小型豬；化膿性肝膿腫

化膿性肝膿腫發(fā)病率低，但病情嚴(yán)重、治療復(fù)雜。2009年-2011年解放軍總醫(yī)院化膿性肝膿腫的年住院率是46.6/100 000，治愈率為34.7%，死亡率為1.4%(資料未發(fā)表)。因此，有進(jìn)一步探討化膿性肝膿腫的新的治療方式的需要。雄性近交A/J鼠和雄性NZW兔的化膿性肝膿腫模型的建立為探討化膿性肝膿腫患者的新的治療模式起到了促進(jìn)作用[1]。但因動(dòng)物體積小，解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人類差異大限制其應(yīng)用。小型豬的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人類極為相似[2]?；撔愿文撃[經(jīng)皮經(jīng)肝無(wú)水乙醇硬化治療模式的探討迫切需要小型豬化膿性肝膿腫模型的實(shí)驗(yàn)支持[3-4]，然而當(dāng)前還未建立出穩(wěn)定的小型豬化膿性肝膿腫模型。研究屠宰場(chǎng)40頭豬的彌散性肺病變，發(fā)現(xiàn)引起肺膿腫的致病菌主要是金葡菌(8/10)[5]。約克夏小型豬耳緣靜脈內(nèi)滴注金葡菌能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的膿毒敗血癥，接種細(xì)菌4～6 h處死解剖發(fā)現(xiàn)在肺、脾和肝內(nèi)均形成了急性微膿腫[6]，由于所形成的肝膿腫為急性微膿腫(6/8)，不適合探討化膿性肝膿腫的新的治療模式。我們的研究目的是金葡菌能否引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫，在注射金葡菌后多長(zhǎng)時(shí)間是化膿性肝膿腫的膿腫形成期。

1 材料與方法

1.1 巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型的建立廣西巴馬小型豬30頭，雌性9頭，雄性21頭，體質(zhì)量21～25 kg，平均體質(zhì)量(20.9±3.0)kg。按照購(gòu)買時(shí)間和飼養(yǎng)員安置位置的順序分組。術(shù)前1 d禁食，用鹽酸氯氨酮和速眠新Ⅱ進(jìn)行肌肉麻醉，采用上腹部正中切口，用30 ml注射器從脾靜脈抽取30 ml靜脈血，分14 ml和15 ml量注入2只50 ml滅菌離心管，凝結(jié)成血凝塊后用無(wú)菌剪刀剪切至血凝塊能夠順利通過(guò)16 G針頭，在14 ml靜脈血量的離心管內(nèi)加入1 ml菌液(5×108cfu/ml)[7]，混勻。對(duì)照組從右外葉肝游離緣進(jìn)針，實(shí)驗(yàn)組從左外葉肝游離緣進(jìn)針。食指和中指捏住肝組織和針梗，回抽無(wú)血液和膽汁后將細(xì)菌和血凝塊混合物快速注入肝實(shí)質(zhì)，注射過(guò)程中有撕裂感，注射結(jié)束后在肝表面見局限性隆起。退針后用吸收性明膠海綿壓迫針眼止血。腹壁分三層縫合后將動(dòng)物送入飼養(yǎng)房。分別于術(shù)后第1、2、3、4周處死小型豬并記錄觀察結(jié)果。巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型的建立得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 巴馬小型豬化膿性肝膿腫病源菌的鑒定術(shù)前1 d禁食，肌肉麻醉后股動(dòng)脈放血處死。開腹后暴露肝臟，縱形切開膿腫，取綠豆大膿塊涂布載玻片，干燥后進(jìn)行革蘭氏染色，右外葉肝組織涂片作為陰性對(duì)照。另取綠豆大膿塊置于LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，觀察培養(yǎng)基顏色，未加膿塊的LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。取1環(huán)量純培養(yǎng)菌液劃線接種于LB瓊脂平板，37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察菌落形態(tài)，未加菌液的LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。取3 ml純培養(yǎng)菌液，4 000×g離心10 min，收集細(xì)菌沉淀。采用E.Z.N.A.TM細(xì)菌DNA提取試劑盒和溶葡球菌酶(1 U/μl)提取細(xì)菌染色質(zhì)DNA，紫外可見分光光度計(jì)定量，去離子水定量為100 ng/μl，置于4 ℃冰箱備用。采用2×Taq PCR MasterMix試劑在PCR儀上擴(kuò)增，PCR反應(yīng)合成耐熱核酸酶A(nucA)基因的引物參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)。引物序列為5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′(前向)和5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′(反向)。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃，45 s；1循環(huán)。94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30循環(huán)。72 ℃，120 s；1個(gè)循環(huán)。最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為279 bp，反應(yīng)體系為50 μl，反應(yīng)結(jié)束后取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/ml EB)電泳，紫外分析儀照相。陽(yáng)性對(duì)照為金葡菌ATCC 25923和ATCC 29213，陰性對(duì)照是用去離子水代替細(xì)菌染色質(zhì)DNA。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，巴馬小型豬化膿性肝膿腫的膿腫大小比較采用單因素方差分析中LSD法進(jìn)行均值多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型的建立采用金葡菌ATCC29213與自體靜脈血凝塊混合物在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射的方法對(duì)6頭巴馬小型豬進(jìn)行化膿性肝膿腫模型的探討(No.24、25、26、27、28、29)。造模術(shù)后不同時(shí)間處死取材，發(fā)現(xiàn)5頭豬(No.24、25、27、28、29)在左外葉肝細(xì)菌混合物注射處均存在膿腫，而在右外葉肝均無(wú)膿腫形成。膿腫特征：膿腔形成，膿腔內(nèi)肝組織溶解壞死，溶解壞死的外層為灰黃色膿液，內(nèi)層為暗紅色無(wú)定形物(見圖1～2)。

細(xì)菌與新鮮靜脈血混合物注射組(第1組)，膿腫(23.6±14.9)mm2；細(xì)菌、肝素鈉與新鮮靜脈血混合物注射組(第2組)，膿腫(58.7±62.2)mm2；細(xì)菌、血凝酶與新鮮靜脈血混合物注射組(第3組)，膿腫(141.0±72.1)mm2；細(xì)菌與自體脂肪顆?；旌衔镒⑸浣M(第4組)，膿腫(587.0±249.2)mm2；細(xì)菌與自體靜脈血凝塊混合物注射組(第5組)，膿腫(570.2±115.1)mm2。第1組、第2組和第3組之間膿腫大小無(wú)顯著性差異(P>0.05)，第4組與第5組之間膿腫大小無(wú)顯著性差異(P>0.05)，第4組與第5組的膿腫大小顯著大于第1組、第2組和第3組(P<0.05)。

No.26小型豬無(wú)肝膿腫形成。No.21小型豬注射細(xì)菌(0.2ml)和自體脂肪顆粒(9ml)混合物后因麻醉意外動(dòng)物死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)有裂傷，裂傷大小為300mm2；No.24小型豬處死后在左內(nèi)葉肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射15ml自體靜脈血凝塊，解剖發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)有裂傷，裂傷大小為250mm2；No.30小型豬處死后在右內(nèi)葉肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射15ml生理鹽水，解剖發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)有裂傷，裂傷大小為160mm2。

圖1 化膿性肝膿腫膿腫面積比較

2.2 巴馬小型豬化膿性肝膿腫致病菌的鑒定5頭巴馬小型豬的化膿性肝膿腫膿塊涂布載玻片，干燥后進(jìn)行革蘭染色油鏡下觀察(No.24、25、27、28、29)，均見到片狀分布的革蘭染色陽(yáng)性的葡萄串狀球菌(見圖2)。肝膿腫膿塊在LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)基均呈淡黃色均勻混濁；純培養(yǎng)菌液在LB瓊脂平板上分離培養(yǎng)過(guò)夜，均形成典型的金葡菌菌落(見圖2)。利用金葡菌耐熱核酸酶基因A對(duì)細(xì)菌染色質(zhì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均出現(xiàn)目的條帶(見圖3)。提示，引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫的細(xì)菌為注入的細(xì)菌，即金葡菌ATCC 29213。

圖2 化膿性肝膿腫造模術(shù)后不同時(shí)間取材、膿腫大小、膿腫塊涂片革蘭染色和膿塊分離培養(yǎng) A: 35 mm×20 mm(造模術(shù)后第7天); B: 32 mm×16 mm(造模術(shù)后第14天); C: 32 mm×20 mm(造模術(shù)后第21天); D: 27 mm×22 mm(造模術(shù)后第33天)。A、E、I: No.27; B、F、J: No.28; C、G、K: No.29; D、H、L: No.24

Fig 2 Different time size, Gram stain and culture of pyogenic hepatic abscess after modeling A: 35 mm×20 mm (7 days after modeling); B:32 mm×16 mm (14 days after modeling); C: 32 mm×20 mm (21 days after modeling); D:27 mm×22 mm (33 days after modeling);A、E、I: No.27; B、F、J: No.28; C、G、K: No.29; D、H、L: No.24

圖3 化膿性肝膿腫致病菌PCR鑒定

Fig 3 PCR identification of the pathogenic bacteria of pyogenic hepatic abscess

2.3 巴馬小型豬肝膿腫的病理鑒定巴馬小型豬化膿性肝膿腫的膿腫組織固定后進(jìn)行石蠟切片HE染色，

均見到膿腫形成，隨著動(dòng)物生存時(shí)間的延長(zhǎng)，膿腫壁逐漸形成(見圖4)。No.27(7 d)和No.28(14 d)：膿腫中心大片壞死，膿腫壁不明顯。No.25(15 d)：膿腫中心大片壞死，纖維組織增生；膿腫壁疏松、不完整。No.29(21 d)：膿腫中心大片壞死，纖維組織增生；膿腫壁疏松、完整。No.24(33 d)：膿腫中心大片壞死，纖維組織增生和毛細(xì)血管增生；膿腫壁致密、完整。提示造模術(shù)后第7、14、15天病變?yōu)槟撃[前期，第21天病變?yōu)槟撃[形成期，第33天為膿腫恢復(fù)期。

圖4 巴馬小型豬化膿性肝膿腫膿塊石蠟切片HE染色(100×) A：NO.27，造模術(shù)后第7天；B：NO.28，造模術(shù)后第14天；C：NO.29，造模術(shù)后第21天；D：NO.24，造模術(shù)后第33天

Fig 4 Pathological findings of pyogenic hepatic abscess (100×) A: No.27, 7 days after post mortem; B:No.28, 14 days after post mortem; C: No.29, 21 days after post mortem; D: No.24, 33 days after post mortem

3 討論

挫傷后向前腔系膜靜脈內(nèi)注入金葡菌ATCC 25923不能產(chǎn)生肝膿腫，在肝挫傷區(qū)內(nèi)直接注入細(xì)菌不能產(chǎn)生肝膿腫，在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注入細(xì)菌與自體靜脈血凝塊混合物也不能產(chǎn)生肝膿腫。說(shuō)明金葡菌ATCC 25923可能不引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫。在肝挫傷區(qū)注入細(xì)菌與新鮮靜脈血混合物能夠產(chǎn)生肝膿腫，但是膿腫體積小，肝素或血凝酶的添加對(duì)產(chǎn)生的膿腫大小無(wú)明顯影響。雖然注射細(xì)菌與自體脂肪顆?；旌衔锬軌蝻@著增加膿腫大小，但因脂肪顆粒無(wú)液化、膿液干燥無(wú)法在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行介入治療。肝挫傷后能夠形成局部血腫，但其內(nèi)淤血和進(jìn)入的細(xì)菌很快被吸收入血進(jìn)而被清除也許是不產(chǎn)生膿腫的原因[6]。細(xì)菌與新鮮靜脈血混合后注入肝挫傷區(qū)能形成較小的膿腫，說(shuō)明血液的添加能夠延緩細(xì)菌進(jìn)入血循環(huán)，使得細(xì)菌在局部得以繁殖進(jìn)而形成膿腫；雖然血凝酶的添加能夠促進(jìn)血液凝結(jié)，但血液進(jìn)入血循環(huán)的速度大于血液凝結(jié)的速度，可能是血液還未凝結(jié)就進(jìn)入了血循環(huán)；肝素的添加不能阻止膿腫形成提示局部血液滯留能夠促進(jìn)膿腫形成；細(xì)菌與自體脂肪顆?；旌衔镒⑷敫螌?shí)質(zhì)，產(chǎn)生了較大的膿腫，說(shuō)明脂肪顆粒殘留能夠促進(jìn)膿腫形成，但因細(xì)菌分泌的脂酶活性弱，不能液化脂肪，導(dǎo)致無(wú)法在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行介入治療。

在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注入金葡菌ATCC29213與自體靜脈血凝塊混合物，產(chǎn)生了穩(wěn)定的化膿性肝膿腫，膿腫體積大、內(nèi)含膿液，適合超聲引導(dǎo)下介入治療，說(shuō)明血凝塊的滯留是化膿性肝膿腫形成的關(guān)鍵因素。原因可能與血凝塊不被吸收入血有關(guān)。因?yàn)樵炷Ｐg(shù)后不同時(shí)間取材，肝膿腫膿液內(nèi)層均為暗紅色無(wú)定形物。

雖然在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注入金葡菌ATCC29213與自體靜脈血凝塊混合物，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的化膿性肝膿腫，但是肺膿腫的出現(xiàn)頻率也高，為60%(3/5)，此時(shí)脾、雙腎和心瓣膜均未出現(xiàn)膿腫，可能與注入的細(xì)菌數(shù)量多和肺的細(xì)菌負(fù)荷量大有關(guān)[6]。21、24和30號(hào)豬的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射自體脂肪顆粒、自體靜脈血凝塊和生理鹽水均能造成肝裂傷，說(shuō)明單純的肝實(shí)質(zhì)損傷不能引起肝膿腫，只是形成肝膿腫的必要條件。26號(hào)豬造模術(shù)后未形成肝膿腫的原因與抽取菌液時(shí)菌液未振蕩混勻，抽取上清時(shí)未抽取到細(xì)菌有關(guān)。

從化膿性肝膿腫膿塊涂片革蘭染色、膿塊培養(yǎng)和膿塊細(xì)菌PCR鑒定中，我們發(fā)現(xiàn)引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫的致病菌為注入的細(xì)菌，即金葡菌ATCC29213。取材結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注入金葡菌ATCC29213與自體靜脈血凝塊混合物7 d即能形成肉眼可見的膿腫。但膿腫石蠟切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 d以內(nèi)的病變?yōu)槟撃[前期，21 d的病變?yōu)槟撃[形成期，33 d的病變?yōu)槟撃[恢復(fù)期。因此，造模術(shù)后21 d可能是超聲引導(dǎo)下化膿性肝膿腫穿剌置管引流治療[9]或無(wú)水乙醇沖洗治療[3-4]的最佳時(shí)期。

不足之處：巴馬小型豬化膿性肝膿腫造模術(shù)后肺膿腫出現(xiàn)的頻率高可能影響肝膿腫的轉(zhuǎn)歸；金葡菌引起的化膿性肝膿腫膿液稠厚，不能用介入穿剌針(18 G×200 mm)抽出可能為探討化膿性肝膿腫的新的治療模式帶來(lái)了困難；金葡菌ATCC25923不能產(chǎn)生肝膿腫的原因尚需深入研究。

總之，采用金葡菌ATCC29213和自體靜脈血凝塊混合物于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)快速注射的方法能夠建立穩(wěn)定的巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型，造模術(shù)后21 d為膿腫形成期[10]。抽取金葡菌菌液前菌液徹底混勻、自體靜脈血充分凝結(jié)及細(xì)菌血凝塊混合物于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注射時(shí)速度快是化膿性肝膿腫形成的必要條件。巴馬小型豬化膿性肝膿腫模型的建立為探討化膿性肝膿腫的新的治療模式[3-4]提供了可能。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Establishment and identification of pyogenic hepatic abscess in Bama minipig

ZHANG Rugang1, ZHANG Xiuli2, YANG Yunsheng2

1.Department of Gastroenterology, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 572013; 2.Department of Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital, China

Objective To establish and identify pyogenic hepatic abscess in Bama minipig.Methods Pyogenic hepatic abscess was established by injecting the mixture of S.aureus and self venous blood clot in liver parenchyma. Pathogenic bacterium was identified by the way of Gram’s stain, bacterial culture and PCR amplification methods, and pathological identification was performed by the way of stained paraffin section.Results Pyogenic hepatic abscess was successfully established by rapidly injecting the mixture of S.aureus ATCC 29213 and self venous blood clot in liver parenchyma. The pathogenic bacterium was S.aureus ATCC 29213. The abscess prophase was found after 15th day, the abscess-formation stage after 21st day and the abscess recovery phase after 33rd day of the operation.Conclusion Pyogenic hepatic abscess in Bama minipig was firstly established and identified, which will help in the studies of new treatment methods of pyogenic hepatic abscess.

S.aureus; Bama minipig; Pyogenic hepatic abscess

全軍“十一五”重大專項(xiàng)課題資助(08Z037)；中國(guó)博士后科學(xué)基金第47批面上資助(20100471817)

張汝鋼，副主任醫(yī)師,研究方向：內(nèi)窺鏡下消化道病變的微創(chuàng)治療。E-mail: zrg026@163.com

楊云生，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師,研究方向：腸道微生態(tài)及疾病、內(nèi)鏡新技術(shù)。E-mail: sunny301ddc@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.018

R575.4

A

1006-5709(2017)01-0066-04

2016-04-28