采用生色底物測定尿激酶效價的方法探討

謝京

摘 要：文章提供了一種采用生色底物測定尿激酶效價的方法，即使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽作為底物來進(jìn)行分析。采用此生色底物法測得結(jié)果與氣泡法測定結(jié)果基本上是一致的。經(jīng)實驗證明，生色底物法更易于操作，簡捷快速，準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性也較好。

關(guān)鍵詞：尿激酶 效價測定 底物

中圖分類號：Q556.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）04（c）-0167-02

尿激酶由人體腎臟生成，是可以通過人體新鮮的尿液進(jìn)行分離提純進(jìn)而得到的一種堿性蛋白水解酶。而要測定尿激酶的效價方法有很多，如平板法、小球下落法、合成底物法以及《中華人民共和國藥典》記載的氣泡上升法等。此文采用生色底物法測定尿激酶效價，使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽作為底物，是依靠尿激酶的酶活性來水解底物產(chǎn)生對硝基苯胺，并選擇在405 nm波長處測定吸光度。

1 材料

1.1 儀器與試藥

日本島津UV-2550紫外分光光度計。

尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；尿激酶供試品購自北京唯美生物技術(shù)公司；L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽購自積水化學(xué)工業(yè)株式會社；明膠為生物試劑；三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、冰醋酸、均為分析純。

1.2 溶液制備

醋酸溶液配制需取20 mL冰醋酸用純化水稀釋成50 mL；

需用純化水稀釋L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽配制成濃度為0.6 mmol/L的底物溶液。

緩沖液的配制需將三羥甲基氨基甲烷6.06 g和氯化納2.22 g放在一起，大約加700 mL純化水進(jìn)行溶解；再單獨取10 g明膠加適量的純化水進(jìn)行加熱溶解。將此溶液擱置直到?jīng)隽艘院螅賹⑦@兩種溶液混合在一起搖勻，取稀鹽酸將溶液的pH值調(diào)至8.8，再往里加入純化水稀釋至1 000 mL。

2 確定測定條件的方法

2.1 反應(yīng)時間的確定

當(dāng)水浴溫度為37 ℃時，取60 IU/ml的供試品溶液與底物溶液混合在一起進(jìn)行反應(yīng)5～40 min。經(jīng)過抽取不同時間的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在30 min以內(nèi)的酶反應(yīng)速度呈現(xiàn)出有規(guī)律的遞增趨勢，而在30 min過后的酶反應(yīng)速度的遞增趨勢卻沒有之前那么明顯，有所減弱。故測定過程中酶反應(yīng)的時間確定為30 min。

2.2 檢測波長的確定

要確定檢測波長，需取底物溶液分別與30 IU/mL、120 IU/mL 2種不同濃度的供試品溶液混合在一起發(fā)生反應(yīng)，最后分別往里加入醋酸溶液搖勻，反應(yīng)停止，選擇在波長范圍250～480 nm內(nèi)進(jìn)行測定其吸收光譜。與此同時尿激酶水溶液、底物溶液以及緩沖液的吸收光譜也需要一一進(jìn)行測定。通過反復(fù)實驗，在波長為405 nm處時緩沖液有少量吸收，而尿激酶水溶液和底物溶液都沒有吸收，但是發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后所生成的產(chǎn)物卻對硝基苯氨有吸收。所以試驗過程中選用測定吸光度的檢測波長定為405 nm。

2.3 底物濃度的確定

37 ℃水浴中，采用配制好的pH8.8的緩沖液稀釋尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品成30 IU/mL的溶液，測定得到米氏常數(shù)Km=5.5×10-5mol/L。用純化水配制不同濃度的底物溶液。從理論知識上我們知道了當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到最大值的合理濃度時酶反應(yīng)會激發(fā)它最大的活性，底物濃度為10 Km時反應(yīng)速度在理論上計算出的約91%的極限值。檢測酶活性時底物濃度有輕微改變，但幾乎不影響反應(yīng)的速度，如有物質(zhì)會抑制酶進(jìn)行反應(yīng)，在底物用量為10 Km時幾乎不影響反應(yīng)的速度，則說明在一定時間段內(nèi)反應(yīng)的速度恒定不變。所以底物濃度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為0.6 mmol/L。

2.4 緩沖液pH值的確定

緩沖液配制過程中，將兩種溶液混合均勻后，用稀鹽酸分別調(diào)制成若干pH值不同的溶液，然后再分別與尿激酶供試品混合配制成30 IU/mL的溶液，再與配制好的底物溶液混合發(fā)生反應(yīng)。隨后采用分光光度法在波長405 nm處測定其吸光度。反復(fù)試驗后得出緩沖液的pH值于8.5～9.0時測出的酶活性最高。因此緩沖液的最佳pH采用8.8。

2.5 水浴溫度的確定

眾所周知，水浴溫度對某些物質(zhì)之間進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)是有一定影響的，而對尿激酶效價的檢測方法卻也是對水浴溫度有一定要求。用30 IU/mL供試品溶液與底物溶液混合，讓其分別在不同溫度的水浴中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，不同溫度下測得的結(jié)果卻是有區(qū)別的。經(jīng)過反復(fù)試驗測出37 ℃是個臨界點，低于37 ℃測到的酶活性會隨著水浴溫度的升高呈上升趨勢。當(dāng)水浴溫度位于37 ℃～45 ℃之間時，所測到的酶活性是最高的。而超過45 ℃之后呈下降趨勢，這說明過高溫度會破壞酶的活性。所以37 ℃可以作為檢測尿激酶效價測定實驗時的水浴溫度選擇。

3 測定方法及回收率試驗

3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用緩沖液將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品正確調(diào)配為50 IU/mL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。取干凈小試管6支并往每支試管內(nèi)都加入2.0 mL的底物溶液，置于37 ℃水浴中。接著將不同量的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別加入到6支試管內(nèi)，再根據(jù)每個試管的溶液量多少分別加入緩沖液至1.0 mL。經(jīng)過30 min準(zhǔn)確無誤的反應(yīng)過后，再分別往小試管里加入1.0 mL醋酸溶液搖勻，反應(yīng)停止。放至室溫，在選定波長405 nm處測定其吸光度。最后計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出：Y=0.0304+0.05355X，r=0.9984，n=3。反復(fù)試驗檢測結(jié)果顯示，在濃度范圍10～50 IU/mL內(nèi)尿激酶與吸收度持線性關(guān)系。

3.2 穩(wěn)定性試驗

待制備好標(biāo)準(zhǔn)曲線后將其溶液放于室溫，分別在不同的時間一一測定其吸光度，最后結(jié)果顯示24 h內(nèi)吸光度并沒有明顯變化。

3.3 回收率試驗

通過在相同的條件下進(jìn)行的6次試驗記錄下的結(jié)果可以利用回歸方程計算出濃度，所得平均回收率為101.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86%。試驗過程如下：取2.0 mL的底物溶液于干凈小試管內(nèi)后并將其置于37 ℃的水浴中。同時取10 mL 30 IU/mL的尿激酶供試品溶液與10 mL 30 IU/mL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液混合在一起搖勻。接著往小試管內(nèi)加入上述兩者混合的尿激酶溶液1.0 mL。經(jīng)過30 min準(zhǔn)確無誤的反應(yīng)過后往小試管內(nèi)加入1.0 mL醋酸溶液搖勻，反應(yīng)停止。放至室溫，并在選定的波長405 nm處測定其吸光度。

4 尿激酶供試品的效價測定

采用回收率試驗中所使用的測定方法，取尿激酶供試品用緩沖液稀釋至30 IU/mL的溶液進(jìn)行測定，6次結(jié)果記錄好，以便與用氣泡上升法測試出來的結(jié)果進(jìn)行對照。配制試劑溶液和測定供試品效價的方法均按《藥典》2010年版二部尿激酶效價測定法進(jìn)行，采用此公式計算結(jié)果，尿激酶效價=（供試品單位數(shù)每毫升單位數(shù)×稀釋倍數(shù)）/取樣量。采用兩種方法進(jìn)行測定后所得結(jié)果對照如表1。然而在實際操作過程中如若不小心讓微生物污染了底物溶液，則會引起底物水解從而使得實際的底物濃度要偏低， 最后會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。將調(diào)制好并已放了3 d的底物溶液與剛配好的新鮮底物溶液在完全相同的反應(yīng)條件下分別進(jìn)行反應(yīng)。通過檢測顯示擱置了3 d的底物溶液反應(yīng)后在波長405 nm處被測到的吸光度與新鮮溶液比較已經(jīng)有所下降了。因此在配制溶液時所需的容器、溶劑都需要通過無菌消毒處理，如此便可以更好地延長底物溶液的貯存時間。

從表1的結(jié)果可以看出，生色底物法測定的尿激酶效價的結(jié)果與藥典記載的氣泡上升法測定出來的結(jié)果基本上是一致的。

5 結(jié)論

綜上所述，文章歸納了酶反應(yīng)最適合的基礎(chǔ)條件是：37 ℃水浴溫度，采用pH8.8的三羥甲基氨基甲烷-明膠緩沖液配制的尿激酶溶液與底物溶液濃度為0.6 mmol/L發(fā)生反應(yīng)30 min。最后再往里加入醋酸溶液搖勻，反應(yīng)終止，通過分光光度計在波長405 nm處測定其吸光度。記錄后的結(jié)果表明尿激酶濃度在10～50 IU/mL范圍內(nèi)與吸光度之間呈線性關(guān)系。

藥典記載的氣泡上升法也可以測定尿激酶效價，但與生色底物法相比，氣泡上升法在測定過程中存在著較多的問題。因為氣泡上升法在測定尿激酶效價時使用的試劑會相對偏多，而且都是一些蛋白質(zhì)或者酶類物質(zhì)，這些物質(zhì)都很容易發(fā)生質(zhì)變。最后還是通過肉眼來決定反應(yīng)的終點，如此就易產(chǎn)生由人為因素而引起的誤差。而文章講述的生色底物法卻是利用尿激酶與所選底物L(fēng)-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽進(jìn)行反應(yīng)從而產(chǎn)生淡黃色針狀結(jié)晶物對硝基苯胺，再通過紫外可見分光光度計進(jìn)行分光光度法測定其吸光度。與氣泡上升法相比較，生色底物法更易于操作，簡捷快速，準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性也較好。

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