黃樂(lè)
【摘 要】 目的:分析PD-1抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值。方法:從2014年2月~2015年9月,醫(yī)院住院的15名肺癌患者中、15名體檢健康的志愿者,采血獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞,進(jìn)行腫瘤組織離體培養(yǎng),以CIK為效應(yīng)細(xì)胞,以A549、H1299、原代細(xì)胞為靶細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按照10:1比例混合,采用GytoTox-Glo細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行活化淋巴細(xì)胞殺傷作用檢測(cè),以自身PBMC作為陰性對(duì)照組,設(shè)置實(shí)驗(yàn)組加入效應(yīng)細(xì)胞,同時(shí)另設(shè)三組分別加入10、50、100ngPD -1抗體(低劑量組、中劑量組、高劑量組)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組、小劑量組、中劑量組、高劑量組腫瘤細(xì)胞殺傷率指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高劑量組高于中劑量組,中劑量組高于小劑量組,小劑量組高于實(shí)驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:PD-1抗體可增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用。
【關(guān)鍵詞】 惡性腫瘤 靶向治療 PD-1抗體
靶向治療是惡性腫瘤治療的新療法,也是當(dāng)前最有潛力的腫瘤療法。PD-1抗體是PD-LI一個(gè)抑制性受體,PD-1分子尾部含有2個(gè)酪氨酸殘基,他們與下游信號(hào)傳導(dǎo)分子相互作用,可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用,PD-1表達(dá)與活化的T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、活化的單核以及樹(shù)突狀細(xì)胞[1]。本次研究采用體外試驗(yàn)研究,評(píng)價(jià)PD-1抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值。
1 材料與方法
1.1 樣本來(lái)源
從2014年2月~2015年9月,醫(yī)院住院的15名肺癌患者中,抽取血液10ml,其中男6例、女4例,平均年齡(58.1±5.2)歲。另選擇體檢健康的志愿者15名,其中男6例、女4例,平均年齡(58.3±5.2)歲,采血10ml。從人淋巴新=細(xì)胞中,采用梯度離心法,獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),含有10%FCS和200U/ml IL-2的PRMI-1640培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。
1.2 儀器與試劑
儀器主要包括牛血清單板、PD-1單抗、流式細(xì)胞儀、自動(dòng)酶標(biāo)儀、各類(lèi)培養(yǎng)基,BX-60熒光顯微鏡等。
1.3 方法
首先:體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞,取靜脈血EDTA抗凝,分離淋巴細(xì)胞分離液,獲得的細(xì)胞,于4ml1640完全培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)備用,而后進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)。健康的人PBMC采用1-2×106/mln濃度懸浮無(wú)血清培養(yǎng)液,加入重組人IFN-g,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h加入CD3單克隆抗體50ng/ml,重組人IL-2 300U/ml,刺激CIK細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,加入重組人IL-1a 100U/ml,換液培養(yǎng)擴(kuò)瓶,并補(bǔ)充IL-1a,第14日收獲CIK細(xì)胞,染色。其次,進(jìn)行腫瘤組織離體培養(yǎng),保存離體組織,快處理,消化,培養(yǎng),過(guò)濾,離心濾液,進(jìn)行培養(yǎng),換液傳代。最后進(jìn)行腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn):以CIK為效應(yīng)細(xì)胞,以A549、H1299、原代細(xì)胞為靶細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按照10:1比例加入到96孔U型板中,采用GytoTox-Glo細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行活化淋巴細(xì)胞殺傷作用檢測(cè),以AAF-GloTM為底物,發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞毒效應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量成正比,計(jì)算總細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度減去死細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞活力,計(jì)算活化淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷率。以自身PBMC作為陰性對(duì)照組,設(shè)置實(shí)驗(yàn)組加入效應(yīng)細(xì)胞,同時(shí)另設(shè)三組分別加入10、50、100ngPD -1抗體(低劑量組、中劑量組、高劑量組)。37℃,5%CO2孵育6h,每孔加入50μl熒光底物檢測(cè),室溫下?lián)u床低速震蕩15min,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔發(fā)光值。細(xì)胞殺傷率=[(目標(biāo)組發(fā)光值-淋巴對(duì)照組組發(fā)光值-靶細(xì)胞對(duì)照組發(fā)光值+培養(yǎng)基發(fā)光值)/(靶細(xì)胞總發(fā)光值-靶細(xì)胞對(duì)照組發(fā)光值)]×100%。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算,殺傷率指標(biāo)采用(Mena±SD)符號(hào)(x±s)表示,服從正態(tài)分布組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較F檢驗(yàn),以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
實(shí)驗(yàn)組、小劑量組、中劑量組、高劑量組腫瘤細(xì)胞殺傷率指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高劑量組高于中劑量組,中劑量組高于小劑量組,小劑量組高于實(shí)驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。
3 討論
從本次研究結(jié)果來(lái)看,體外試驗(yàn)證實(shí):PD-1抗體可增強(qiáng)CIK效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用,提高腫瘤細(xì)胞殺傷率,且表現(xiàn)出劑量依賴。目前抗PD-1藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,一項(xiàng)針對(duì)進(jìn)展期難治性NSCLC的meta分析顯示,抗PD-L1藥物可起到增效作用,提高患者的中位總生存期[HR=0.61,95%CI0.61~0.75,P<0.05),和總緩解率[HR=0.56,95%CI0.43~0.73,P<0.05)[2]。另一項(xiàng)針對(duì)PD-1/PD-L1抗體與多西他賽治療晚期非小細(xì)胞肺癌的meta分析顯示,看題組不良反應(yīng)發(fā)生率較低,總的不良反應(yīng)發(fā)生率顯著下降,但免疫相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率上升[3]。PD-1抗體通過(guò)發(fā)揮增效作用,延長(zhǎng)惡性腫瘤患者生存期,也可能存在不良反應(yīng),影響免疫功能[4]。
參考文獻(xiàn)
[1]曹佳彬,魏敬雙.PD-1 抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2014,27(6):856-860.
[2]王心怡,李晨露.抗PD-L1藥物治療進(jìn)展期難治型NSCLC有效性與安全性Meta分析[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,52(6):659-664.
[3]蘇強(qiáng),閆涵,侯艷麗,等.PD-1/PD-L1抗體與多西他賽治療晚期非小細(xì)胞肺癌安全性meta分析[J].中華腫瘤防治雜志,2016,23(21):1450-1452.