林嵐 ，林琳，陳恩中，陳保衛(wèi)，王曉瑋，陳清

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣東 廣州 510282; 3. 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510020； 4. 中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510275)

宏基因組方法比較分析深海和珠江口沉積物中抗生素耐藥基因的特征*

林嵐1, 2，林琳3，陳恩中2，陳保衛(wèi)4，王曉瑋4，陳清1

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣東 廣州 510282; 3. 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510020； 4. 中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510275)

細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性是全球關(guān)注的環(huán)境健康問(wèn)題之一。該研究旨在使用宏基因組方法比較分析西太平洋深海和珠江口沉積物中抗生素耐藥基因，認(rèn)識(shí)抗生素使用與環(huán)境細(xì)菌耐藥性間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，深海沉積物多重耐藥基因的含量高達(dá)77.8%；珠江口沉積物多重耐藥基因只有27.2%，常用抗生素的耐藥基因(磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等)含量明顯提高(約70%)。沉積物中共發(fā)現(xiàn)45種耐藥基因亞型，其中7種基因亞型(acrB、amrB、bacA、ceoB、macB、mexB和smeE)能在所有沉積物中發(fā)現(xiàn)。深海沉積物中質(zhì)粒僅攜帶0.3%的耐藥基因，而珠江口沉積物則超過(guò)40%。研究表面，由于珠江口周邊區(qū)域常用抗生素的廣泛使用，其沉積物中細(xì)菌抗生素耐藥性明顯提高、耐藥機(jī)制趨于多樣化。

抗生素耐藥基因；宏基因組分析；沉積物；西太平洋；珠江口

抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作為一種新興的環(huán)境“污染物”已受到廣泛的重視[1]。從人類(lèi)活動(dòng)干擾環(huán)境采集的水、土壤和沉積物等樣品中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)高豐度的多樣的抗生素耐藥基因[2-4]?？股啬退幓蚩梢詮沫h(huán)境細(xì)菌傳播到人類(lèi)病原菌，顯著降低了抗生素藥物的療效，對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重的影響[5]。在臨床治療中，一些抗生素由于普遍的耐藥性而放棄使用，給臨床治療帶來(lái)很大的問(wèn)題[6]。自然環(huán)境中存在大量微生物，沒(méi)有人類(lèi)干擾的自然環(huán)境中也可以檢出抗生素耐藥基因[7-9]。環(huán)境微生物可分泌抗生素以抑制其他微生物的生長(zhǎng)，作為微生物之間的一種競(jìng)爭(zhēng)模式，抗生素的微生物合成已經(jīng)過(guò)成千上萬(wàn)年的進(jìn)化[10]。此外，一些細(xì)菌可以將抗生素轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，支撐它們的生長(zhǎng)[11]。無(wú)論分泌抗生素的微生物還是利用抗生素的微生物都需要攜帶抗生素耐藥基因，保護(hù)它們免受抗生素的危害[12-14]。由于人類(lèi)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用抗生素，自然環(huán)境如水體和土壤中抗生素污染嚴(yán)重，例如，在珠江口環(huán)境中檢測(cè)到較高濃度的抗生素[15-16]。然而，人類(lèi)活動(dòng)區(qū)域環(huán)境與沒(méi)有人類(lèi)干擾的自然環(huán)境中的抗生素以及耐藥基因的分布差異尚不明確。

本研究將使用基于高通量DNA測(cè)序技術(shù)的宏基因組分析方法分別研究深海和珠江口沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、抗生素耐藥基因的種類(lèi)與水平及其位置，比較分析自然環(huán)境與人類(lèi)活動(dòng)環(huán)境中抗生素耐藥基因的特點(diǎn)，以探討人類(lèi)活動(dòng)對(duì)周邊水環(huán)境的影響。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2014年12月于西太平洋深海(東經(jīng)134°50′5.22″，北緯10°00′12.18″)，水深4 042 m，采集了一個(gè)沉積物樣品，樣本編號(hào)WP1。2011年8月分別在珠江口的虎門(mén)(東經(jīng)113°40′00″，北緯22°43′59″)和深圳灣(東經(jīng)113°56′57″，北緯22°28′12″)采集了兩個(gè)沉積物樣品，樣本編號(hào)分別為PRE1和PRE2。珠江口PRE1采樣點(diǎn)位于獅子洋河口區(qū)域，水深20.0 m，珠江廣州段及北江由此流入珠江口。珠江口PRE2采樣點(diǎn)位于深圳灣，水深5.6 m。深圳灣位于香港和深圳市之間的一個(gè)半封閉海灣，籠箱式水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)密集。使用抓斗采集沉積物樣品，采集后立即放于無(wú)菌的聚乙烯塑料袋中，放到4～6 ℃冰箱保存，直至DNA提取。

1.2 沉積物中基因組提取和高通量測(cè)序

使用FastDNA?SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)試劑盒根據(jù)產(chǎn)品操作手冊(cè)提取沉積物中的DNA。由于海洋沉積物中DNA含量較低，需對(duì)沉積物中的DNA進(jìn)行多次提取并混合，以消除樣品的不均一性和單次DNA提取導(dǎo)致的誤差。使用Thermo Scientific NanoDrop 1000 分光光度計(jì)測(cè)定DNA提取物的濃度與純度，DNA樣品都被送到安諾基因(北京，中國(guó))進(jìn)行測(cè)序。大約5 μg DNA樣品被剪切成200 bp長(zhǎng)度的片段，并使用T4DNA polymerase、Klenow Fragment和T4Polynucleotide Kinase進(jìn)行末端修復(fù)。隨后接頭(Adapters)被連接到DNA片段，并使用凝膠電泳純化需要的DNA片段。使用PCR擴(kuò)增DNA目標(biāo)片段，同時(shí)將index tags連接到接頭上構(gòu)建DNA文庫(kù)，最后使用Illumina HiSeq 2500對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)沉積物樣品的測(cè)序輸出量約為3.0 Gbp。

1.3 生物信息學(xué)分析

首先對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)(序列長(zhǎng)度125 bp)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除含有測(cè)序錯(cuò)誤和測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20的序列。通過(guò)使用BLASTN程序(Linux Release 2.2.29)與SILVA Small Subunit (SSU)數(shù)據(jù)庫(kù)(version 10.4)進(jìn)行比對(duì)，從測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別并抽取16S rRNA基因[17]，比對(duì)門(mén)檻值E-value為10-20。隨后將16S rRNA基因的比對(duì)結(jié)果輸入到MEGAN軟件(version 4.70.4)，使用lowest common ancestor (LCA) algorithm算法，絕對(duì)截止值為BLAST bitscore 等于50，相對(duì)截止值為50個(gè)比對(duì)結(jié)果的10%，分析沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[18]。將測(cè)序數(shù)據(jù)與antibiotic resistance genes database (ARDB)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)[19]，如果比對(duì)長(zhǎng)度大于25個(gè)氨基酸、相似度大于90%，該序列被認(rèn)為是耐藥基因[20]。此外，根據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列，建立一個(gè)質(zhì)粒基因數(shù)據(jù)庫(kù)[20]。如果比對(duì)長(zhǎng)度大于90個(gè)堿基、相似度大于95%，該序列被識(shí)別為質(zhì)?；?。

2 結(jié)果與討論

2.1 西太平洋和珠江口沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

宏基因測(cè)序數(shù)據(jù)首先與SSU微生物分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲取16S rRNA基因，然后用MEGAN軟件分析16S rRNA基因的比對(duì)結(jié)果，以獲取沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息。結(jié)果如圖1所示，沉積物中的細(xì)菌分布在16個(gè)菌門(mén)，不管在西太平洋還是在珠江口的沉積中，多數(shù)細(xì)菌屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)。但是，西太平洋沉積物中變形菌門(mén)的細(xì)菌相對(duì)百分比高達(dá)95%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在珠江口沉積物中的比例。顯然，西太平洋和珠江口沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。在珠江口區(qū)域，咸淡水交匯，因此淡水和海水微生物在口門(mén)區(qū)域交匯，而在西太平洋深海主要是能在極端環(huán)境下(如低溫、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏)生存的微生物。

圖1 西太平洋和珠江口沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較Fig.1 Comparison of bacterial community structures between the WP and PRE sediments

2.2 西太平洋和珠江口沉積物中抗生素耐藥基因的豐度和耐藥性特征

沉積物中識(shí)別的抗生素耐藥基因根據(jù)抗生素的種類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)，即耐藥性類(lèi)型。此外，樣品中抗生素耐藥基因的豐度使用16S rRNA基因進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果如圖2所示?？股啬退幓蛟谥榻赑RE1處采集的沉積物中豐度最高，依次為西太平洋及珠江口PRE2采樣點(diǎn)。沉積物中各抗性類(lèi)型的抗生素耐藥基因的相對(duì)組成如圖3所示。在西太平洋沉積物中，多重耐藥基因和氯霉素耐藥基因相對(duì)含量最高，特別是多重耐藥基因(multidrugs resistance genes)高達(dá)77.8%。與西太平洋沉積物相比，珠江口沉積物中多重耐藥基因的相對(duì)含量較低；相反，與常用抗生素(如，磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)等)相關(guān)的耐藥基因的相對(duì)含量則明顯提高。

圖2 西太平洋和珠江口沉積物中抗生素耐藥性基因的比較Fig.2 Abundance and resistance types of ARGs in the sediments of the in the WP and PRE sediments

圖3 西太平洋和珠江口沉積物中抗生素耐藥性基因的Fig.3 Relative percentages of ARG resistance types in the WP and PRE sediments

在無(wú)污染的自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥基因，表明了耐藥基因的自然起源[7-9]。然而由于耐藥基因的極大的多樣性，很難獲取環(huán)境介質(zhì)中耐藥基因的綜合信息和特征。近來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)和宏基因組分析技術(shù)的迅速發(fā)展[21]，幫助準(zhǔn)確識(shí)別環(huán)境介質(zhì)中的耐藥基因的綜合特征[22]。在西太平洋深海沉積物中，沒(méi)有污染物脅迫的條件下細(xì)菌形成并維持了獨(dú)特的抗生素耐藥基因特征，以多重耐藥基因?yàn)橹鳎儆嗅槍?duì)常用抗生素的特異性耐藥基因。但是，由于抗生素在珠江口周邊地區(qū)的大量使用，抗生素、耐藥菌及其攜帶的耐藥基因從典型污染源(如污水處理廠、家禽養(yǎng)殖場(chǎng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)等)排放到河口環(huán)境中，因而珠江口沉積物中耐藥基因特征以常用抗生素的特異性基因?yàn)橹?。例如，先前的研究表明，四環(huán)素和磺胺耐藥基因的水平，從珠江內(nèi)河道、珠江口到近海區(qū)域呈明顯降低趨勢(shì)，耐藥基因的水平與抗生素濃度顯著相關(guān)[4, 23]。這些研究恰恰與我們的結(jié)果一致，在珠江口沉積物中發(fā)現(xiàn)大量的四環(huán)素和磺胺耐藥基因而在深海沉積物中則沒(méi)有。

2.3 西太平洋和珠江口沉積物中抗生素耐藥基因的亞型

在西太平洋和珠江口沉積物中總共發(fā)現(xiàn)45種抗生素耐藥基因亞型。其中7種抗生素耐藥基因亞型能在所有樣品中被發(fā)現(xiàn)，包括acrB、amrB和mexB是多重耐藥基因，bacA是環(huán)肽耐藥基因，ceoB是氯霉素耐藥基因，macB是大環(huán)內(nèi)酯耐藥基因，smeE是喹諾酮耐藥基因，這些耐藥基因亞型在沉積物中檢測(cè)到的同類(lèi)耐藥基因中大多數(shù)都是豐度最高的。例如，在所有沉積物中ceoB占總氯霉素耐藥基因的至少70%。區(qū)別于西太平洋，氨基糖苷主要耐藥基因亞型(aad9和ant2IA)、β-內(nèi)酰胺主要耐藥基因亞型(bl2d_oxa2和bl3_imp)磺胺主要耐藥基因亞型(sul1)只在珠江口沉積物中發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明由于這些抗生素的大量使用，導(dǎo)致污染環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)化并富集針對(duì)這些常用抗生素的獨(dú)特耐藥基因亞型(圖4)。

圖4 西太平洋和珠江口沉積物中抗生素耐藥性基因亞型Fig.4 Venn diagram of ARG subtypes in the WP and PRE sediments

2.4 西太平洋和珠江口沉積物中質(zhì)?；蜇S度和抗生素耐藥基因的水平傳播

通過(guò)與質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分析了西太平洋和珠江口沉積物中質(zhì)?；虻呢S度，結(jié)果如圖5所示。所有采集的樣品中，在WP1采集的深海沉積物的質(zhì)?；蜇S度最高，其豐度要比珠江口沉積物至少高5倍。同時(shí)，從測(cè)序數(shù)據(jù)中提取抗生素耐藥基因序列，并將其與質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以分析質(zhì)粒攜帶的耐藥基因的相對(duì)含量。圖5顯示，質(zhì)粒攜帶的抗生素耐藥基因的趨勢(shì)與質(zhì)?；蜇S度完全相反，珠江口沉積物中超過(guò)40%的耐藥基因在質(zhì)粒上被發(fā)現(xiàn)，而西太平洋沉積物中僅僅0.3%的耐藥基因在質(zhì)粒上。結(jié)果表明，珠江口沉積物中抗生素耐藥基因的水平傳播潛勢(shì)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西太平洋深海沉積物中的耐藥基因。

圖5 西太平洋和珠江口沉積物中質(zhì)?；蜇S度和質(zhì)粒攜帶的耐藥基因的相對(duì)含量Fig.5 Abundance of plasmid genes and relative percentages of plasmid-related ARGs in the WP and PRE sediments

自然環(huán)境中的大多數(shù)微生物對(duì)抗生素具有較低的耐藥性，其攜帶質(zhì)?；蚪M基含低水平的抗生素耐藥基因[24-25]，這與我們?cè)谖魈窖笊詈３练e物的宏基因分析結(jié)果完全一致。此外，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)也表明自然環(huán)境中的耐藥基因不能在細(xì)菌之間傳遞[26]。然而，隨著人類(lèi)干擾環(huán)境中抗生素脅迫的提高，導(dǎo)致耐藥基因通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)的基因水平傳遞在細(xì)菌宿主之間傳播[27]。因此，質(zhì)粒作為抗生素耐藥基因水平傳播的載體，在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)耐藥基因豐度和質(zhì)?；蜇S度顯著相關(guān)[3]。宏基因組分析發(fā)現(xiàn)珠江口沉積物中高比例的耐藥基因出現(xiàn)在質(zhì)粒上，這可能是耐藥基因在細(xì)菌間水平傳播的結(jié)果，也必將有利于抗生素耐藥性在細(xì)菌間的繼續(xù)傳播。

3 結(jié) 論

基于高通量DNA測(cè)序技術(shù)的宏基因組分析方法，能夠綜合評(píng)價(jià)西太平洋和珠江口沉積物中的抗生素耐藥基因的整體特征。在西太平洋和珠江口沉積物之間抗生素耐藥基因的豐度和種類(lèi)都存在顯著差異，說(shuō)明在抗生素廣泛、大量使用的情況下，人類(lèi)嚴(yán)重干擾環(huán)境中細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的進(jìn)化已與自然環(huán)境產(chǎn)生分化，其耐藥基因主要以表達(dá)對(duì)常用抗生素(四環(huán)素、磺胺、氨基糖苷、β-內(nèi)酰胺等)的耐藥性為主。與深海沉積物相比，珠江口沉積物含有更高比例的質(zhì)粒攜帶的抗生素耐藥基因，表面質(zhì)粒介導(dǎo)的基因水平傳遞是細(xì)菌獲取抗生素耐藥性的主要方式。

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Metagemomic analysis on characteristics of antibiotic resistance genes in the deep ocean and Pearl River Estuary sediments

LINLan1, 2，LINLin3，CHENEnzhong2，CHENBaowei4，WANGXiaowei4，CHENQing1

(1. School of Public Health, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2. Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, China; 3. Department of Respiratory Disease, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou 510020, China; 4. School of Marine Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Antibiotic resistance is one of the most important environmental issues in the world. The relationship between antibiotic use and antibiotic resistance of environmental bacteria were investigated using metagenomic analysis of antibiotic resistance genes (ARGs) in the sediments collected from the Western Pacific (WP) and the Pearl River Estuary (PRE) in this work. The result indicated that multidrug resistance genes (MRGs) were accounted as 77.8% of the total ARGs in the WP sediments, and the PRE sediments as 27.2%. ARGs in the PRE sediments were characterized by increasing abundance of ARGs specific to common antibiotics (e.g., sulfonamides, macrolides, aminoglycoside, etc.) and decreasing relative percentage of MRGs. A total of 45 ARG subtypes were identified in the sediments, and thereof 7 subtypes, includingacrB,amrB,bacA,ceoB,macB,mexB andsmeE, concurrently existed in all sediments. Approximately 0.3% of ARGs in the WP sediments were potentially carried by the plasmids. Different from the WP, relative percentage of plasmid-carrying ARGs in the PRE sediments was higher than 40%. It was suggested that the abundance and diversity of ARGs in the PRE environment were substantially increased probably due to wide use of antibiotics in the nearby regions.

antibiotic resistance genes; metagenomic analysis; sediments; Western Pacific; Pearl River Estuary

2016-11-06 基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313195)

林嵐(1982年生)，女；研究方向：感染性疾病流行病學(xué)；E-mail：105824412@qq.com

陳清(1959年生),女；研究方向：感染性疫病流行病學(xué)、評(píng)價(jià)流行病學(xué)；E-mail：qch.2009@163.com

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.018

R11

A

0529-6579(2017)02-0112-05