高慧珍，陳理星，董定娟，高甜甜，黃敏婕，徐寧迎

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

miR-let-7基因家族在金華豬和長白豬中的組織表達(dá)分析

高慧珍，陳理星，董定娟，高甜甜，黃敏婕，徐寧迎*

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

miR-let-7基因廣泛參與動物組織器官的發(fā)育調(diào)控，其表達(dá)具有組織特異性。本研究選用70 d的金華豬和長白豬公豬（各3頭），采用實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測了let-7基因家族6個成員（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在心臟、肝、脾、肺、腎、小腸中的表達(dá)量，分析它們在組織間及品種間的表達(dá)差異，重點(diǎn)分析了在小腸中的表達(dá)差異。結(jié)果表明：let-7基因家族在長白豬肝組織中表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05），在金華豬小腸和心臟中顯著高于其他組織（P＜0.05）；在小腸中，金華豬let-7a和let-7c基因表達(dá)量極顯著高于其他成員（P＜0.01），長白豬let-7a基因表達(dá)量極顯著高于其他成員（P＜0.01），let-7在小腸的表達(dá)存在品種間差異，金華豬的let-7a和let-7d-3p基因表達(dá)量極顯著高于長白豬（P＜0.01），let-7c基因顯著高于長白豬（P＜0.05），而let-7e基因卻顯著低于長白豬（P＜0.05）。本研究結(jié)果為探究miR-let-7基因在金華豬和長白豬生長和脂肪形成方面的分子作用機(jī)制提供了參考。

miR-let-7；基因相對表達(dá)量；組織表達(dá)；小腸；豬

microRNA（miRNA）介導(dǎo)的調(diào)控方式是基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制中不可或缺的重要組成部分。通過對miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，基因組的非組蛋白編碼區(qū)蘊(yùn)藏著重要的生命功能活動信息，miRNA參與調(diào)控哺乳動物一系列的生物學(xué)過程，包括發(fā)育和衰老及死亡的時序調(diào)控[1]、肌細(xì)胞分化[2]、脂肪代謝和脂肪細(xì)胞分化[3]、腦及神經(jīng)發(fā)育[4]、心臟發(fā)育[5]等。miR-let-7基因最早是在線蟲中發(fā)現(xiàn)，是線蟲發(fā)育的時間調(diào)控器[6]，被認(rèn)為是miRNA的代表。miR-let-7基因可以促進(jìn)成年動物體內(nèi)脂肪細(xì)胞[7]、心肌細(xì)胞[8]以及肝臟和卵巢的發(fā)育，對青春期的時序和體型的調(diào)控有著重要的影響[9]。對miRNA調(diào)控機(jī)制的研究為動物生長及品質(zhì)調(diào)控分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，對調(diào)控動物肌肉和脂肪組織生長發(fā)育和肉品質(zhì)等性狀具有重要意義。金華豬是我國著名的優(yōu)良地方豬種之一，主要分布在浙江省，頭部和尾部呈黑色，中間體部為白色，又稱“兩頭烏”，具有肉質(zhì)好、皮薄骨細(xì)、性成熟早、繁殖率高等優(yōu)點(diǎn)，常被用于腌制優(yōu)質(zhì)火腿。長白豬又名蘭德瑞斯豬，原產(chǎn)于丹麥，體軀長，被毛白色，是典型的瘦肉型豬種，具有生長快、體形大、產(chǎn)仔多、飼料利用率高等優(yōu)點(diǎn)。金華豬和長白豬在生長速度、肌內(nèi)脂肪含量等方面存在著極大的差異。豬的脂肪消化和吸收主要在小腸，脂肪合成主要在肝臟。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）分析比較金華豬和長白豬肝臟、小腸及其他組織中miR-let-7基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究miRNA在豬的生長發(fā)育過程中對生長速度和脂肪合成發(fā)揮的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取相同飼養(yǎng)條件下70 d的金華豬和長白豬公豬（各3頭），體重在（8.87±0.09）kg。采集心臟、肝、脾、肺、腎、小腸組織，每個部位取3個重復(fù)樣品，立即投入液氮中速凍，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 熒光定量PCR儀為Step one plusPCR System(ABI)，NanoDrop2000c核酸分析儀，引物序列由上海Invitrogen公司合成。Trizol法提取總RNA，miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒（TIANGEN，北京），miRcute Plus miRNA qPCR 檢測試劑盒（TIANGEN，北京）。

1.3 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 用Trizol試劑提取組織總RNA，用NanoDrop2000c核酸分析儀檢測RNA濃度和純度，OD260/280均在1.8～2.0，RNA濃度和純度都符合用miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄的要求。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 用反轉(zhuǎn)錄的cDNA按照miRcute Plus miRNA qPCR 試劑盒說明書利用通用引物和特定的miRNA引物在Step one plus （PCR System(ABI)）儀器上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系：2× miRcute Plus miRNA Premix（含SYBR, 含ROX）10 μL， 上、下游引物 （10 μmol/L）各0.4 μL，miRNA第1鏈cDNA 2 μL，50× ROX Reference Dye 2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃起始模板變性 15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計分析 本研究采用相對實(shí)時熒光定量qRT-PCR 法，內(nèi)參引物為Met-tRNA。采用2-ΔΔCt方法來計算基因在組織中的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析來分析miR-let-7在金華和長白豬的不同組織間的表達(dá)差異性，采用LSD進(jìn)行多重比較。采用t檢驗(yàn)法分析miR-let-7在品種間的肝和小腸組織中的表達(dá)差異性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。結(jié)果數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-let-7基因熒光定量擴(kuò)增結(jié)果 從圖1可以看出，擴(kuò)增曲線為平滑的S型曲線，基線平整，拐點(diǎn)清楚，指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好。由圖2可知，熔解曲線均為單峰，且重合性好，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性強(qiáng)，可以用于進(jìn)一步分析。說明本實(shí)驗(yàn)中熒光定量PCR反應(yīng)特異性和重復(fù)性良好，表達(dá)定量檢測結(jié)果可靠。

圖1 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

2.2 miR-let-7基因成員在不同組織中表達(dá)量的比較 相對實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-let-7家族6個成員（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在金華豬和長白豬6個組織的表達(dá)量，利用SPSS20. 0軟件進(jìn)行單因素方差分析并采用LSD法進(jìn)行多重比較。由圖3可知，在長白豬中，let-7a和let-7c在肝組織的表達(dá)量顯著高于其他組織（P ＜0.05），7d-3p基因在肝組織的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P ＜0.01），let-7e和let-7g基因在肝、腎組織的表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05），let-7f基因在肝、心臟中的表達(dá)量顯著高于其他組織（P ＜0.05）；在金華豬中，let-7a和let-7e基因在心臟中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P ＜0.01），let-7c基因在心臟、小腸組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織（P ＜0.05），let-7d-3p和let-7g基因在小腸和心臟中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P ＜0.01），let-7f基因在心臟的表達(dá)量顯著高于其他組織（P ＜0.05）。let-7基因家族成員在長白豬的肝組織中表達(dá)最高，在金華豬的小腸中表達(dá)最高、心臟次之。

2.3 miR-let-7基因在小腸中的表達(dá)差異分析 如圖4所示，let-7基因在金華豬和長白豬小腸中的表達(dá)模式不同。在金華豬小腸組織中，let-7a和let-7c基因表達(dá)量最高，極顯著高于其他成員（P＜0.01），let-7g表達(dá)量較高，let-7d-3p、let-7e和let-7f在小腸中都是低表達(dá)，且三者間無差異。在長白豬的小腸中，let-7a基因表達(dá)最高，極顯著高于其他成員（P ＜0.01）；let-7c、let-7e和let-7f的表達(dá)量較高，且三者間無差異，let-7d-3p、let-7f表達(dá)量最低，兩者間無差異。let-7基因成員在小腸中的表達(dá)也存在品種間的差異，在金華豬小腸中，let-7a和let-7d-3p基因表達(dá)量極顯著高于長白豬（P ＜0.01），let-7c基因表達(dá)量顯著高于長白豬（P＜0.05），而let-7e基因卻顯著低于長白豬（P ＜0.05）。

圖3miR-let-7基因在金華和長白豬各組織中的相對表達(dá)量

圖4miR-let-7基因在金華和長白豬小腸組織中的相對表達(dá)量

3 討 論

與其他miRNA一樣，miR-let-7基因的表達(dá)具有組織特異性[10]，在豬的肝臟、心臟和胸腺組織上有120個miRNA被鑒定出來，其中miR-499和miR-208在心臟中特異性表達(dá)，miR-122則是在肝臟特異性表達(dá)[11]。本研究結(jié)果顯示，let-7基因家族6個成員（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在金華豬和長白豬心臟、肝、脾、肺、腎、小腸中均有表達(dá)，這與前人研究的let-7基因參與了心臟[12]、骨骼和肌肉[13]等器官的發(fā)育調(diào)控的結(jié)果相一致。但每個基因成員在各組織的表達(dá)量存在差異，let-7基因家族成員在長白豬的肝組織中表達(dá)量高于其他組織，在金華豬的小腸中表達(dá)量最高，心臟次之。趙俊生等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，大約克夏豬的let-7i基因在小腸組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織。let-7基因家族成員在金華豬和長白豬小腸組織中表達(dá)模式不同，說明let-7基因通過基因表達(dá)量的變化實(shí)現(xiàn)對組織的調(diào)控作用。雖然let-7a基因在金華豬和長白豬的小腸組織中表達(dá)量都極顯著高于其他組織，但金華豬let-7a基因表達(dá)量極顯著高于長白豬；趙俊生等也發(fā)現(xiàn)miR-let-7i基因在金華豬和大約克夏豬的心臟、肝、脾、肺、腎、胰和皮脂中都有表達(dá)，但表達(dá)量存在品種間差異[14]。王云霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著let-7a的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增大；也有前人發(fā)現(xiàn)，let-7基因家族能直接或間接地作用于相關(guān)的細(xì)胞周期基因，在調(diào)控細(xì)胞分裂和分化方面發(fā)揮重要的作用[16-17]。小腸中miR-let-7基因的表達(dá)對小腸的生長抑制和潘氏細(xì)胞的增殖有關(guān)鍵作用[18]。let-7a在細(xì)胞生長增殖方面有重要的調(diào)控作用。苗志國等[19-21]檢測發(fā)現(xiàn)，與長白豬相比，金華豬具有較低的始重、終重和平均日增重，有較高的胴體脂肪率、平均背膘厚、肌內(nèi)脂肪；回腸黏膜絨毛高度在80 d和125 d時都顯著低于長白豬，隱窩深度顯著高于長白豬。豬對營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是脂肪的消化和吸收主要在小腸，所以金華豬和長白豬小腸的結(jié)構(gòu)差異影響著兩豬種的生長和脂肪形成方面的差異。推測由于let-7a基因的表達(dá)影響了小腸細(xì)胞的生長增殖，進(jìn)而影響小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，let-7a基因在金華和長白豬小腸中的表達(dá)差異一定程度地影響了兩豬種在生長發(fā)育和脂肪沉積方面的差異。此后，筆者的研究將預(yù)測和篩選miR-let-7可能的靶基因，以了解miR-let-7對小腸影響的分子機(jī)制和功能，為進(jìn)一步探究miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)，并檢測miR-let-7前體基因多態(tài)性，分析其多態(tài)性與肉質(zhì)或生長性狀的關(guān)聯(lián)，以期成為豬的肉質(zhì)及生長標(biāo)記。

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Analysis of miR-let-7 Tissue Expression Pattern in Jinhua and Landrace Pigs

GAO Hui-zhen, CHEN Li-xing, DONG Ding-juan, GAO Tian-tian, HUANG Min-jie, XU Ning-ying*
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Zhejiang Hangzhou 310058, China)

miR-let-7 gene family is a tissue-specific expressed and widely involved in the regulation and the development of animal tissues and organs. In our study, three of each Jinhua and Landrace pigs at 70 days old were selected to detected the expression of let-7 gene family (let-7a, let-7c, let-7d-3p, let- 7e, let-7f, let-7g) in six tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine). The differential expression of let-7 genes were analyzed in various tissues and especially in the small intestine for the Jinhua and Landrace pigs. The results showed that the expression level of let-7 genes were abundantly expressed in liver of landrace (P ＜0.05) while the expression of let-7 genes in the heart and small intestine of Jinhua pig were greater than other tissues(P ＜0.05). In the small intestine of Jinhua pig, the expression levels of let-7a and let-7c genes were significantly higher than other members of the let-7 gene family; the expression level of let-7a gene was observably higher than other members in Landrace. The expression levels of let-7a and let-7d-3p gene in small intestine of Jinhua was significantly higher than those of Landrace (P＜0.01). The expression of let-7c gene was higher than that of Landrace (P ＜0.05). But the expression of let-7e gene was lower than that of Landrace (P ＜0.05). The expression of miR-let-7 gene family was studied in this paper, it provides useful clues for further study of molecular mechanism of miR-let-7 on the growth and fat formation for Jinhua and Landrace.

miR-let-7; Gene expression ; Tissue expression ; Small intestinal ; Pig

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-044

2016-10-26；

2016-11-18

國家自然科學(xué)基金（31272424）

高慧珍（1991-），女，河南人，碩士研究生，主要從事microRNA方面研究，E-mail：21517004@zju.edu.cn

* 通訊作者：徐寧迎，E-mail：nyxu@zju.edu.cn