儲(chǔ)藏條件和種子粒徑對天師栗種子生活力的影響研究

明孟碟，熊 超，胡志剛，楊紅兵，鄭國華，石召華，徐 雷*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.武漢愛民制藥股份有限公司，湖北 鄂州 436070)

儲(chǔ)藏條件和種子粒徑對天師栗種子生活力的影響研究

明孟碟1，熊 超1，胡志剛1，楊紅兵1，鄭國華1，石召華2，徐 雷1*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.武漢愛民制藥股份有限公司，湖北 鄂州 436070)

通過探索天師栗種子的適宜儲(chǔ)藏條件及播種種子粒徑，以提高種子生活力，節(jié)約種子繁殖過程中種子用量。采用二因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選TTC染色法測定天師栗種子生活力的最佳TTC濃度和染色時(shí)間，同時(shí)運(yùn)用TTC染色法對不同儲(chǔ)藏條件下不同粒徑的天師栗種子生活力進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，TTC染色法測定天師栗種子生活力的最佳條件為：0.20%濃度的TTC溶液染色11～13 h；沙藏方式儲(chǔ)藏的種子生活力較其它方式均高，達(dá)85.30%，并且差異達(dá)到顯著水平；大粒徑種子(φ≥4.5 cm)和中粒徑種子(3.0 cm≤φ<4.5 cm)的生活力比小粒徑種子(φ<3.0 cm)生活力高。故在天師栗種子繁殖過程中，宜采用沙藏方式儲(chǔ)藏，并選用較大粒徑種子(φ≥3.0 cm)。

天師栗；種子；儲(chǔ)藏條件；粒徑；TTC染色法；生活力

0 引言

天師栗(AesculuswilsoniiRehd.)為無患子目(Sapindales)七葉樹科(Hippocastanaceae)七葉樹屬(AesculusLinn.)的落葉喬木，是我國特有的珍稀樹種。其干燥種子為《中國藥典》收載的 “娑羅子”藥材的主要來源之一，具有疏肝理氣、和胃止痛的功效，用于治療肝胃氣滯、胸腹脹悶、胃脘疼痛等[1]。娑羅子含有皂苷類、有機(jī)酸、脂肪酸、多糖[2]等多種化學(xué)成分，七葉皂苷為其主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明七葉皂苷具有抗炎、抗?jié)B出、抗腦水腫、抗腫瘤、增加靜脈張力、保護(hù)大腦缺血性損傷、保護(hù)胃腸道的功效[3]。近年來，以七葉皂苷鈉為主要有效成分的凍干粉針劑、搽劑、片劑、膠囊等被廣泛應(yīng)用于臨床，產(chǎn)業(yè)規(guī)模高達(dá)20億元[4]。同時(shí)由于娑羅子在去油脂、抗氧抗衰老、消浮腫等方面的獨(dú)特療效，以其藥材為原料開發(fā)的美容、美體等系列產(chǎn)品亦展現(xiàn)出廣闊的市場應(yīng)用前景。此外，由于娑羅樹作為著名的觀賞樹種和佛教所賦予的“圣樹”寓意，其在作為綠化園林建設(shè)行業(yè)行道樹和旅游開發(fā)等方面也具有較好的綜合開發(fā)前景。

近年來，市場對娑羅子藥材需求量逐年增加，野生資源遠(yuǎn)不能滿足藥用需求，當(dāng)前其藥材主要源自人工栽培[5]。野生天師栗分布于海拔1000～1800 m的闊葉林中，主產(chǎn)于湖北西部、河南西南部、湖南、江西西部、廣東北部、四川、貴州和云南東北部等地區(qū)，通過分根、扦插及種子等方式進(jìn)行繁殖，生產(chǎn)實(shí)踐中以種子繁殖為主。種子繁殖雖然繁殖系數(shù)大，操作簡單，但存在存活率低、種子投入成本高、播種期短、越冬易凍苗等問題。研究還表明天師栗種子屬頑拗性種子[6]，極易失活,不易保存,所以提高天師栗種子的生活力，既對生產(chǎn)實(shí)踐中指導(dǎo)種子繁殖具有重要意義，亦能緩解種子用于育苗和入藥間的矛盾，從而提高經(jīng)濟(jì)效益?；诖耍驹囼?yàn)通過TTC染色法對天師栗種子生活力的適宜測定條件進(jìn)行了篩選，并對不同儲(chǔ)藏條件下不同粒徑的天師栗種子生活力進(jìn)行了比較研究，以期為實(shí)現(xiàn)科學(xué)化、規(guī)范化種植和資源的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試天師栗種子于2015年9月采自湖北省竹溪縣湖北神農(nóng)愛民藥業(yè)有限公司娑羅子規(guī)范化種植示范基地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)楊紅兵教授鑒定為七葉樹科七葉樹屬植物天師栗(A.wilsoniiRehd.)的種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子采集與儲(chǔ)藏 選取生長健壯、無病蟲害的成年植株，采集其成熟后自然脫落的蒴果，除去果皮后隨機(jī)分為A、B兩組，A組用于TTC染色法最佳染色條件的選擇，B組用于不同儲(chǔ)藏條件下種子生活力測定。

1.2.2 種子染色及觀察鑒定 天師栗種子室溫浸種24 h后，剝?nèi)シN皮，然后沿種胚縱切，置于培養(yǎng)皿中，加入用磷酸緩沖液配制的TTC (2 ,3, 5-氯化三苯基四氮唑)溶液至種子被完全浸沒[7]，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色，染色結(jié)束后，取出種子并用自來水沖洗，觀察、記錄并統(tǒng)計(jì)種子的生活力。

根據(jù)種子染色的部位和染色程度判斷種子的生活力情況。凡是胚被染成鮮紅色的為活種子；胚的主要結(jié)構(gòu)胚根不染色或者營養(yǎng)組織不染色或?yàn)榛野咨M織異常，如軟化腐爛、蟲蛀、損傷等，均為無活力的種子；腐爛的為死亡種子[8-9]。

1.2.3 TTC染色法最佳染色條件的選擇 采用二因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，篩選最佳的TTC濃度(c)和染色時(shí)間(t)。設(shè)置TTC濃度為0.05%(c1)、0.20%(c2)、0.50%(c3)；設(shè)置染色時(shí)間為9(t1)、11(t2)、13(t3)h，共9個(gè)處理。每次處理均重復(fù)3次，每次重復(fù)30粒種子。

1.2.4 不同儲(chǔ)藏條件下天師栗種子生活力測定 將B組種子采用-20 ℃、-80 ℃、沙藏(保持濕度層積處理)3種貯藏條件儲(chǔ)藏至翌春3月，按照1.2.2所示試驗(yàn)方法和1.2.3所確定的TTC染色法最佳染色條件對種子進(jìn)行生活力檢測。每種儲(chǔ)藏條件均重復(fù)4次，每次重復(fù)34粒種子。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計(jì)胚完全染色有生活力種子的個(gè)數(shù)，計(jì)算百分率；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P< 0.05差異顯著，P< 0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色法最佳染色條件的選擇

不同TTC濃度和染色時(shí)間處理的天師栗種子生活力的方差分析結(jié)果表明，處理組合、TTC濃度和染色時(shí)間對天師栗種子生活力測定結(jié)果均有顯著性影響(P< 0.05)(表1)。不同TTC濃度和染色時(shí)間組合協(xié)同處理的種子生活力的比較，結(jié)果見表2，顯示c2t3組合處理下天師栗種子生活力最高，達(dá)到94.44%；其次為c2t2處理組合(83.33%)；最低處理組合為c1t3，生活力為48.89%。

表1 TTC濃度和染色時(shí)間對天師栗種子生活力的方差分析

同一染色時(shí)間不同TTC濃度對天師栗種子生活力影響的多重比較結(jié)果見表3。在不同染色時(shí)間下均以c2(0.20%)處理的種子生活力最高，且表現(xiàn)為c2(0.20%)處理下種子生活力高于c3(0.50%)處理高于c1(0.05%)處理。不同TTC濃度以c2(0.20%)處理下天師栗種子生活力最高，達(dá)到86.67%，與c1、c3存在顯著差異，且三者間存在極顯著性差異(P<0.01)(表4)。

同一TTC濃度不同染色時(shí)間對天師栗種子生活力影響的多重比較結(jié)果見表5。結(jié)果表明：c2、c3條件下t3(13 h)處理的種子生活力均最高；c1條件下t2(11 h)處理的種子生活力最高，c3處理的種子生活力最低。不同染色時(shí)間對天師栗種子生活力影響的比較，結(jié)果見表6。t2(11 h)處理下天師栗種子生活力最高，但與t3沒有顯著性差異，與t1之間差異達(dá)到顯著水平(P< 0.05)，表明在TTC染色處理過程中，隨著時(shí)間的延長，TTC與種子生活細(xì)胞中的脫氫酶逐漸反應(yīng)，當(dāng)達(dá)到11 h以上時(shí)反應(yīng)趨于完全。因此，TTC染色法測定天師栗種子生活力的最佳條件為：TTC濃度為0.20%，染色處理11～13 h。

2.2 不同儲(chǔ)藏條件下天師栗種子生活力測定

不同儲(chǔ)藏條件處理的天師栗種子生活力的方差分析結(jié)果見表7。結(jié)果表明不同儲(chǔ)藏條件對天師栗種子生活力有顯著性影響(P< 0.05)。不同儲(chǔ)藏條件處理下天師栗種子生活力的多重比較詳見表8。結(jié)果表明：沙藏條件下天師栗種子生活力最高，達(dá)到85.30%；-20 ℃與-80 ℃儲(chǔ)藏條件下天師栗種子生活力沒有顯著性差異，但與沙藏條件下的存在顯著性差異，且較沙藏條件下的顯著降低。

表2 TTC濃度和染色時(shí)間對天師栗種子生活力的影響

表3 同一染色時(shí)間不同TTC濃度對天師栗種子生活力影響的多重比較

結(jié)果顯示低溫儲(chǔ)藏的天師栗種子生活力比沙藏處理的種子生活力低，可能與其種子頑拗性、不耐脫水和對低溫敏感有關(guān)。對于頑拗性種子而言，較高自由水含量可能是保障其生活力的重要條件，低溫儲(chǔ)藏的種子在緩慢降溫的過程中，水分首先在胞間隙形成冰晶，并引起胞內(nèi)自由水向胞間隙遷移，隨著溫度的繼續(xù)下降，胞內(nèi)水分亦形成冰晶，同時(shí)在低溫環(huán)境下細(xì)胞活性氧增加而發(fā)生膜脂過氧化作用，導(dǎo)致膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致種子生活力逐漸喪失。

表4 不同TTC濃度處理的天師栗種子生活力的多重比較

表5 同一TTC濃度不同染色時(shí)間對天師栗種子生活力影響的多重比較

表6 不同染色時(shí)間處理的天師栗種子生活力的多重比較

2.3 不同儲(chǔ)藏條件下種子粒徑對天師栗種子生活力的影響

種子處理后逐粒測量其直徑(φ)，按大粒種子(φ≥4.5 cm)、中粒種子(3.0 cm≤φ<4.5 cm)、小粒種子(φ<3.0 cm)進(jìn)行分級(jí)，將3種不同粒徑的種子分別于-20 ℃、-80 ℃、沙藏3種儲(chǔ)藏條件下儲(chǔ)藏。各級(jí)種子生活力結(jié)果詳見圖1。結(jié)果表明不同粒徑種子生活力差異較大，不同儲(chǔ)藏條件下均表現(xiàn)為大粒及中粒種子生活力較強(qiáng)，小粒種子生活力較弱。

表7 不同儲(chǔ)藏方式下天師栗種子生活力的方差分析

和小粒徑種子相比，大粒徑種子表面積與體積之比小，水分散失慢；同時(shí)種胚體積大，種子內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)亦更多，因此在同等條件下，大粒徑種子更能維持種胚活力，保障種子生活力。種子萌發(fā)后，較大粒徑種子所貯藏的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)能更充分地滿足種子萌發(fā)所需的營養(yǎng)要求，因而比小粒徑種子表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性。故在種子繁殖過程中，宜選用較大粒徑種子(φ≥3.0 cm)。

表8 不同儲(chǔ)藏方式處理的天師栗種子生活力的多重比較

圖1 不同儲(chǔ)藏條件下不同粒徑對天師栗種子生活力的影響

3 結(jié)論與討論

TTC染色法是目前國際上公認(rèn)較好的測定種子生活力的方法，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和藥用植物等種子生活力的測定[10]。研究表明浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC濃度、染色溫度、染色時(shí)間以及不同影響因素的組合對種子生活力的測定結(jié)果均有影響[11-12]，且不同植物間存在較大的差異，因此對于不同物種，需針對性地確定適宜的測定條件。本研究探索了TTC濃度和染色時(shí)間對天師栗種子生活力的影響，結(jié)果表明TTC濃度、染色時(shí)間以及兩者的不同組合對其生活力均有顯著性影響，TTC染色法測定天師栗種子生活力的最佳條件為：TTC濃度為0.20%，染色處理11～13 h。通過不同TTC濃度和染色時(shí)間的多重比較分析，不同TTC濃度間的種子生活力差異較不同染色時(shí)間間的差異更顯著，表明TTC濃度對天師栗種子生活力測定更為關(guān)鍵。

種子是顯花植物自然繁殖的主要載體，適宜的儲(chǔ)藏條件是決定其在下一生活周期起始時(shí)能否正常萌發(fā)的重要因素。天師栗種子具有頑拗性，不易儲(chǔ)藏，研究結(jié)果表明不同儲(chǔ)藏條件以及不同粒徑的天師栗種子生活力呈現(xiàn)較大差異，選用較大粒徑種子(φ≥3.0 cm)并進(jìn)行沙藏為宜。同時(shí)沙藏過程中需維持適宜的溫度和濕度，溫度過高時(shí)種子易提前萌發(fā)導(dǎo)致不能正常越冬，濕度過大時(shí)種子易霉變，而溫度及濕度過低都會(huì)不同程度引起種子的生活力下降。

種子儲(chǔ)藏是種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容，當(dāng)前隨著國家藥用植物種質(zhì)資源庫的建立，種子儲(chǔ)藏研究的重要性進(jìn)一步凸顯。結(jié)合植物生理學(xué)、遺傳學(xué)、植物化學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段，對種質(zhì)資源進(jìn)行研究，既能促進(jìn)資源的保護(hù)，又能充分挖掘利用資源，實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用。沙藏方式適宜短期的儲(chǔ)藏，在實(shí)際生產(chǎn)中簡便適用。如何長期保存并進(jìn)行種質(zhì)資源研究，對娑羅子藥材的可持續(xù)利用及其產(chǎn)業(yè)鏈的構(gòu)建具有重要意義。同時(shí)，天師栗種子作為中藥“娑羅子”的基原之一，在儲(chǔ)藏期間對其臨床藥用物質(zhì)基礎(chǔ)的內(nèi)在藥效成分的變化規(guī)律亦有待深入研究。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2015年版(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:292-293.

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(責(zé)任編輯：許晶晶)

Study on Effects of Storage Condition and Seed Size on Seed Viability ofAesculuswilsonii

MING Meng-die1, XIONG Chao1, HU Zhi-gang1, YANG Hong-bing1, ZHENG Guo-hua1, SHI Zhao-hua2, XU Lei1*

(1. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. Wuhan Aimin Pharmaceutical Limited Company, Ezhou 436070, China)

In order to improve the seed viability ofAesculuswilsoniiand to save its seed usage during seed propagation, the author studied the optimum conditions for its storage and the suitable seed size for its sowing through adopting two-factor and multi-level experiment design. The best TTC concentration and dyeing time for the determination of seed viability ofA.wilsoniiby using TTC method were screened, and the viabilities of different sizes ofA.wilsoniiseeds under various storage conditions were compared. The results showed that the optimal determination condition for the seed viability ofA.wilsoniiwas staining for 11～13 h with 0.2% TTC solution. The viability ofA.wilsoniiseeds under sand-storage condition was the highest (85.30%), and it was significantly higher than that under other storage conditions. The large size of seeds (grain diameter φ≥4.5 cm) and middle size of seeds (3.0 cm≤φ<4.5 cm) had a higher viability than the small size of seeds (φ<3.0 cm). Therefore, in the process of seed propagation ofA.wilsonii, the larger size of seeds (φ≥3.0 cm) should be used and they should be stored in sand.

Aesculuswilsonii; Seed; Storage condition; Seed size; TTC method; Viability

2016-12-07

國家中醫(yī)藥管理局-湖北稀缺中藥材種苗基地建設(shè)項(xiàng)目(2015-21)。

明孟碟(1991─)，女，湖北武漢人，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及其品質(zhì)研究。*通訊作者：徐雷。

R282

A

1001-8581(2017)05-0053-04