茶角胸葉甲高毒力球孢白僵菌菌株的篩選

王定鋒，李良德，黎健龍，李慧玲，張輝，王慶森，吳光遠*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲用植物研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640

茶角胸葉甲高毒力球孢白僵菌菌株的篩選

王定鋒1，李良德1，黎健龍2，李慧玲1，張輝1，王慶森1，吳光遠1*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲用植物研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640

茶角胸葉甲（Basilepta melanopusLefevre）是一種茶樹上常見的食葉性害蟲，其發(fā)生為害嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，該蟲在局部茶園，尤其是有機茶園中常爆發(fā)成災(zāi)。如何有效防治該害蟲，已成為亟待解決的問題。本研究選擇原寄主為茶園鞘翅目害蟲的9個球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株，依據(jù)菌落形態(tài)、菌株生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、耐熱力和抗紫外能力等生物學(xué)性狀初步篩選出Bb338、Bb346和Bb2-1等3個生物學(xué)性狀優(yōu)良的菌株；在此基礎(chǔ)上，利用浸蟲法研究了3個菌株對茶角胸葉甲成蟲的殺蟲毒力。生測結(jié)果表明，用每毫升1×107個孢子的孢懸液處理后，球孢白僵菌Bb2-1對茶角胸葉甲成蟲的累計校正死亡率達100%，僵蟲率達86.11%；LT50僅為3.32 d。綜合上述各生物學(xué)特性和殺蟲毒力表明，篩選到的Bb2-1菌株具有生長速率快、產(chǎn)孢量大、耐熱力和抗紫外能力強，以及對茶角胸葉甲殺蟲毒力最強和殺蟲速率最快等優(yōu)點，在今后茶角胸葉甲的生物防治中將發(fā)揮重要的作用。

茶角胸葉甲；球孢白僵菌；生物學(xué)特性；毒力；菌株篩選

茶角胸葉甲（Basilepta melanopusLefevre）又名黑足角胸葉甲，屬鞘翅目（Coleoptera）肖葉甲科（Eumolpidae），是茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]上一種常見的食葉性害蟲，主要分布于福建、江西、湖南、廣東和廣西等產(chǎn)茶省。該蟲成蟲咬食茶樹嫩梢芽葉或成葉，形成不規(guī)則缺刻或孔洞，致葉片千瘡百孔，破爛不堪，嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。除茶樹外，它還為害油茶Camellia oleifera[4]和珍珠菜Lysimachia clethroides[5]。自1979年在江西發(fā)現(xiàn)以來，該蟲在贛西北北部、南部，贛南西部發(fā)生嚴重，常導(dǎo)致夏茶減產(chǎn)48%以上[6]。汪榮灶的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，角胸葉甲對茶叢的為害率達100%，對茶葉的為害率達70%以上，被害葉的取食孔達5～47個不等[5]。譚濟才等[7]發(fā)現(xiàn)自1979年以來該蟲在湖南多個產(chǎn)茶縣為害成災(zāi)；其中郴州地區(qū)70%以上的茶園發(fā)生嚴重。而何學(xué)友等對福建省清流縣、邵武市油茶林樣地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)油茶株受害率為100%，葉片受害率15%～90%，危害均較為嚴重[4]。對該蟲的防治除了農(nóng)業(yè)防治[5,7-9]、物理防治[5,7-9]以外，尚以化學(xué)防治為主[5,7-11]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長期大量使用所產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)3R問題（抗性、殘留和再猖獗），嚴重破壞生態(tài)環(huán)境、危害人類健康。近年來，隨著人們對茶葉食品安全問題的日益關(guān)注和有機茶種植的興起，在茶葉生產(chǎn)過程中如何安全、有效地防治該害蟲，已成為亟待解決的問題。

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）具有寄主范圍廣、易于培養(yǎng)、可持續(xù)控制害蟲和對環(huán)境友好等優(yōu)點，已被用于防治多種農(nóng)林害蟲[12]。而截至2008年，全球先后有182個真菌殺蟲劑產(chǎn)品問世，其中35.16%以球孢白僵菌為有效成分[13-15]。何學(xué)友等[16]通過測定白僵菌（B. bassiana）和綠僵菌（Metarrhizium anisopliae）菌株的生長速率、產(chǎn)孢量和對角胸葉甲的室內(nèi)毒力，篩選出了兩株生物學(xué)性狀優(yōu)良且殺蟲活性強的白僵菌菌株。曾明森等[17]對分離至茶角胸葉甲的2個白僵菌分離株開展室內(nèi)毒力測定和茶園小區(qū)寄生率的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)菌株I對茶角胸葉甲的室內(nèi)寄生效果較好，每毫升2×107個孢子處理后15 d的寄生率為66.65%；菌粉用量15 kg·hm-2時，對茶角胸葉甲的田間寄生率最高可達45.21%。前人研究發(fā)現(xiàn)從原寄主或其近緣種上分離的蟲生真菌菌株對靶標昆蟲具有更強的毒力[18-19]。因此，為進一步豐富茶角胸葉甲生防菌資源，獲得高效的生防菌株，我們從本實驗室保存的、茶樹鞘翅目害蟲上分離獲得的球孢白僵菌菌株中挑選出9個株系；并以菌落形態(tài)、生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、耐熱力和抗紫外能力等指標為參數(shù)篩選優(yōu)良菌株，繼而采用浸蟲法對篩選到的優(yōu)良菌株進行室內(nèi)生物測定。最終篩選出1株生物學(xué)性狀優(yōu)良，且對茶角胸葉甲毒力高的球孢白僵菌Bb2-1菌株。本研究以期為今后田間大規(guī)模應(yīng)用白僵菌防治茶角胸葉甲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

于角胸葉甲成蟲發(fā)生高峰期，從茶園中采集成蟲帶回實驗室，用扦插在花泥上的無農(nóng)藥污染的新鮮茶梢飼養(yǎng)2 d，選取健康活躍、大小基本一致的成蟲（不分雌雄）用于生物測定。

1.2 供試菌株

9株供試球孢白僵菌菌株信息詳見表1，用SDAY試管斜面保存于本實驗室4℃冰箱中。

1.3 培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基（SDAY）：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%瓊脂，pH7.0。高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min。

孢子萌發(fā)液：2%蔗糖、0.5%蛋白胨，0.05%吐溫–80。滅菌條件同SDAY培養(yǎng)基。

1.4 菌株生長速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率測定

菌株生長速率測定：采用菌塊接種法，參照文獻[20]的方法。用三角玻璃棒將各菌株的分生孢子懸液均勻涂布在SDAY平板上培養(yǎng)

5 d，然后用直徑為8 mm的打孔器從上述平板中打出新鮮菌塊，并接種于SDAY平板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（25℃，光照條件12L/12D），每個菌株3次重復(fù)。用直尺十字交叉法測量培養(yǎng)5 d、10 d和15 d的菌落直徑。產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率測定：參照雷妍圓等[21]方法測定產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率。用直徑為8 mm的打孔器從在SDAY平板上培養(yǎng)14 d的菌落中心至邊緣1/2處隨機打取1個菌塊，放入裝有10 mL萌發(fā)液的三角瓶（50 mL）中，用磁力攪拌器充分攪拌，然后置于130 r·min-1、25℃搖瓶培養(yǎng)18 h。用血球計數(shù)板計數(shù)，計算產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率。每菌株為1個處理，重復(fù)3次。

表1 供試菌株Table 1 Fungal strains used in this study

1.5 不同菌株孢子耐熱性測定

參照俞佳和馮明光方法測定分生孢子耐熱力[22]，并稍做修改。具體操作如下：從SDAY平板培養(yǎng)14 d的各菌株中刮取分生孢子，用0.05%吐溫-80配成濃度為每毫升1.0×107個孢子的孢懸液，用移液槍移取100 μL孢懸液于裝有4 mL孢子萌發(fā)液的試管中，渦旋振蕩混勻。將上述試管置于48℃恒溫水浴鍋中水浴12 min后立即取出，繼而放于搖床中25℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)24 h。各菌株孢子的萌發(fā)率用血球計數(shù)板計數(shù)，并以未經(jīng)水浴處理的相同條件下培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率為對照（CK）。每個菌株3次重復(fù)。不同菌株孢子的耐熱性用孢子萌發(fā)抑制率來表示，抑制率越弱，表明菌株的耐熱力越強。孢子萌發(fā)抑制率計算公式如下：

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（1－處理組孢子萌發(fā)率/對照組孢子萌發(fā)率）×100。

1.6 不同菌株孢子抗紫外能力測定

用膠頭滴管取1滴孢懸液（每毫升1.0×107個孢子）滴于載玻片上，于室溫下自然風(fēng)干后，置于8 W紫外燈下，距離44 cm，照射10 min。接著往載玻片菌斑處加入100 mL萌發(fā)液，用移液器槍頭在菌斑上刮3～5次，然后反復(fù)吹吸萌發(fā)液5次，以便洗下孢子，最后把萌發(fā)液連同洗下的孢子轉(zhuǎn)移到4 mL孢子萌發(fā)液中，渦旋振蕩混勻。并在25℃，150 r·min-1，黑暗條件下，振蕩培養(yǎng)24 h。最后，用血球計數(shù)板對各菌株孢子的萌發(fā)率進行計數(shù)，并以未經(jīng)紫外光處理、相同培養(yǎng)條件的孢子萌發(fā)率作為對照（CK）。每個菌株重復(fù)3次。孢子萌發(fā)抑制率的計算方法參照步驟1.5。孢子萌發(fā)抑制率越弱，表明菌株的抗紫外能力越強。

1.7 菌株對茶角胸葉甲成蟲毒力測定

1.7.1 菌株準備

將前面篩選到3個優(yōu)良菌株（Bb338、Bb346和Bb2-1）的孢懸液（每毫升1.0×107個孢子），用移液器取5 μL分別點植于SDAY平板上，25℃下培養(yǎng)14 d，收集新鮮的分生孢子，用0.05%吐溫-80溶液配成每毫升1.0×107個孢子的孢懸液。

1.7.2 毒力測定

參照文獻[20]的方法進行浸蟲處理，角胸葉甲成蟲接菌后置于1L塑料杯中，用基部包有濕潤的無菌脫脂棉的新鮮茶梢飼養(yǎng)。用紗網(wǎng)封住塑料杯口，置于25℃、95%濕度、光周期12L/12D的人工氣候箱飼養(yǎng)，每2 d更換1次新的茶梢。每個菌株為1個處理，每個處理12頭茶角胸葉甲成蟲，重復(fù)3次，以0.05%吐溫-80溶液為對照。接菌處理后第2天開始，每天調(diào)查1次葉甲的死亡情況。如發(fā)現(xiàn)死蟲，將其移出塑料杯并置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，觀察死蟲上是否長出菌絲。死亡率、校正死亡率和僵蟲率（蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子）的計算公式如下：

累計死亡率（%）＝死亡蟲口數(shù)/處理總蟲數(shù)×100

累計校正死亡率（%）＝（處理組累計死亡率－對照組累計死亡率）/（1－對照組累計死亡率）×100

僵蟲率（%）＝死亡后形成僵蟲的蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進行處理。利用鄧肯氏新復(fù)極差法對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較分析；采用probit方法計算致死中時（LT50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)形態(tài)

從表2可以看出，供試的9個白僵菌菌株的菌落形態(tài)差異較大，大致可分A型（粉質(zhì)型菌落）、B型（緊密型菌落）和C型（疏松型菌落）。其中，C型生長速度較慢，且產(chǎn)孢量較少的；A型生長速率較快，且產(chǎn)孢量較大；而B型菌落生長速度和產(chǎn)孢量介于A型和C型之間（表2，表3）。

2.2 不同菌株的平均生長速度、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率比較

由表3可見，供試的9個白僵菌菌株的菌落生長速率存在較大差異。Bb2-1、Bb338、Bb346和Bb317 4個菌株生長最快，15 d時菌落直徑為49.83～51.67 mm，顯著大于其他5個菌株（P＜0.05），4個菌株的生長速度之間不存在顯著差異。供試的9個白僵菌菌株的產(chǎn)孢量之間也存在較大差異，Bb2-1、Bb338和Bb346 3個菌株的產(chǎn)孢量明顯優(yōu)于其他6個菌株；菌株Bb2-1的產(chǎn)孢量是菌株Bb4-86的3.9倍。此外，供試的9個白僵菌菌株的孢子萌發(fā)率都超過90%，且各菌株產(chǎn)孢量之間不存在顯著差異。

表2 不同菌株在SDAY上的形態(tài)特征Table 2 Colony morphological characteristics of the tested strains on SDAY medium

表3 白僵菌不同菌株的生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率情況Table 3 Growth, sporulation and conidia germination of the tested strains on SDAY medium

2.3 不同菌株孢子耐熱力比較

從圖1可以看出，經(jīng)48℃水浴熱激處理后，各菌株之間的孢子萌發(fā)抑制率存在顯著差異。其中，菌株Bb4-86和Bb2-1孢子萌發(fā)抑制率分別為30.09%和34.40%，顯著低于其他菌株，顯示出最強的耐熱力。菌株Bb338和Bb4-33也顯示出較強的耐熱力。

2.4 不同菌株孢子抗紫外能力比較

從圖2可以看出，紫外輻射處理后，不同菌株抗紫外能力分化明顯；且紫外處理對各菌株的孢子萌發(fā)抑制率都較高，從72.11%～100.00%不等。其中，Bb338的孢子萌發(fā)抑制率最小，其次是Bb2-1和Bb346。

圖1 不同菌株分生孢子熱激處理后孢子萌發(fā)抑制率Fig. 1 Inhibition rate of conidia germination ofB. bassianaafter exposure to thermal stress

2.5 生物測定

在生物學(xué)指標測定的基礎(chǔ)上，我們選取了3個生物學(xué)性狀優(yōu)良的菌株Bb338、Bb346和Bb2-1進行生物測定。實驗結(jié)果表明，3個菌株對茶角胸葉甲成蟲的致病力強弱順序為Bb2-1＞Bb338＞Bb346。其中菌株Bb2-1殺蟲毒力最強，在每毫升1.0×107個孢子的孢懸液處理7 d，該菌對茶角胸葉甲成蟲的累計校正死亡率達100%，僵蟲率達86.11%，LT50為3.32 d（表4）。

3 討論

近年來，隨著人們對茶葉食品安全問題的日益關(guān)注，選擇一種綠色安全的害蟲防治手段來防治茶樹害蟲（如茶角胸葉甲）已成為當前亟待解決的問題。蟲生真菌具有對環(huán)境安全、容易大量培養(yǎng)和可持續(xù)控制害蟲等優(yōu)點，在當前農(nóng)林害蟲生物防治中發(fā)揮重要的作用。獲得對靶標害蟲高毒力的蟲生真菌菌株是開展害蟲生物防治的先決條件。前人對靶標害蟲高毒力菌株的篩選常通過直接開展室內(nèi)生測來完成[23-25]。但該方法需要使用大量靶標昆蟲，這對于許多未實現(xiàn)室內(nèi)規(guī)?；斯わ曫B(yǎng)的昆蟲來說，要完成生測試驗的難度很大。而從與生防菌株毒力密切相關(guān)的生物學(xué)性狀（如菌落形態(tài)、生長速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率等）入手，先初步篩選出生物學(xué)性狀優(yōu)良的菌株，再對初篩到的優(yōu)良菌株開展生物測定，進一步篩選出高毒力菌株的方法正受到越來越多研究者的青睞[26-28]。

圖2 紫外輻射對不同菌株分生孢子的萌發(fā)抑制率Fig. 2 Inhibition of conidia germination ofB. bassianaafter exposure to ultraviolet radiation

表4 球孢白僵菌菌株對茶角胸葉甲成蟲的殺蟲毒力Table 3 Pathogenicity of the testedB. bassianastrains against the adults ofB.melanopus

前期的研究發(fā)現(xiàn)蟲生真菌的菌落形態(tài)、菌株生長速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率等生物學(xué)性狀與菌株的毒力有很大關(guān)聯(lián)性，呈現(xiàn)薄粉狀質(zhì)地的菌落一般具有較強的毒力，而生長速率快、產(chǎn)孢量大的菌株也往往表現(xiàn)出較強的殺蟲活性[26-28]。本研究的結(jié)果也基本支持了菌株生物學(xué)性狀與毒力密切相關(guān)這一觀點，即菌株Bb2-1和Bb338呈粉質(zhì)型菌落、生長速率快、產(chǎn)孢量高，且對茶角胸葉甲成蟲的殺蟲活性也很強。

蟲生真菌的耐熱力和抗紫外能力是衡量其抗逆性能的兩個重要指標。高溫不僅會嚴重阻礙白僵菌的孢子萌發(fā)[29-30]、菌絲生長[31]和侵染毒力[32-33]，而且還會縮短真菌孢子的儲藏壽命[34]。茶角胸葉甲一般在5月上旬開始羽化出土，并于5月中旬到6月中旬進入為害盛期，此時田間氣溫正逐漸上升。因此，篩選出耐熱力強的白僵菌菌株，對今后菌劑的生產(chǎn)和田間應(yīng)用具有重要的意義。本研究中我們通過48℃水浴熱激處理（12 min），從9個白僵菌菌株中篩選出Bb4-86和Bb2-1具有最強的耐熱力，孢子萌發(fā)抑制率分別為30.09%和34.40%，顯著低于其他菌株。該結(jié)果與李鴻文等[35]研究發(fā)現(xiàn)12株球孢白僵菌對48℃熱脅迫的LT50平均為12.6 min較一致。除了來自高溫的脅迫外，陽光中的紫外線產(chǎn)生的紫外輻射也是限制真菌制劑在田間應(yīng)用的一大因素。陽光中的紫外線（尤其是短波紫外線）能夠穿透孢子壁產(chǎn)生高活性的游離基[36]，會抑制白僵菌孢子的萌發(fā)或直接殺死孢子[37]。篩選出抗紫外能力強的菌株，將為今后真菌制劑的生產(chǎn)和田間應(yīng)用提供有力的保障[38]。本研究中我們從9個白僵菌菌株中篩選出Bb338、Bb2-1和Bb346等3個具有較強抗紫外能力的菌株，將為今后抗紫外能力強的真菌制劑的生產(chǎn)及田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究先通過測定菌落形態(tài)、菌株生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、耐熱力和抗紫外能力等生物學(xué)性狀，初步篩選出Bb338、Bb346和Bb2-1等3個生物學(xué)性狀優(yōu)良的白僵菌菌株。在此基礎(chǔ)上，對篩選到的3個生物學(xué)性狀優(yōu)良的菌株進行過生物測定。最終篩選出菌株Bb2-1不僅生長速率快、產(chǎn)孢量高、耐熱力強和抗紫外能力強，而且對茶角胸葉甲成蟲具有最強的殺蟲毒力和最快的殺蟲速率。用每毫升1×107個孢子孢懸液處理后，該菌對茶角胸葉甲成蟲的校正死亡率達100%，僵蟲率達86.11%，LT50僅為3.32 d，在今后茶角胸葉甲的田間防治中將發(fā)揮巨大的生防潛力。

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Screening of the Beauveria bassiana Strain with High Virulence to Basilepta melanopus (Coleoptera: Chrysomeloidea)

WANG Dingfeng1, LI Liangde1, LI Jianlong2, LI Huiling1, ZHANG Hui1, WANG Qingsen1, WU Guangyuan1*
1. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu′an 355015, China; 2. Drinkable Plants Institute (Tea Research Center), Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Provincial Key Laboratory of Tea Plant Resources Innovation & Utilization, Guangzhou 510640, China

The beetle (Basilepta melanopus) is one of the most serious leaf-feeding insects in tea garden, which seriously affects both tea yield and quality. In recent years, the beetle often caused serious damage in some tea gardens, especially organic tea gardens. How to effectively control this pest has become a serious problem. In order to screen high virulence strains ofBeauveria bassianatoB. melanopus, 9 strains ofB. bassianaisolated from the coleoptera pests in tea gardens were selected as candidates. In the preliminary screening, the biological characteristics of these 9 strains, including colony morphology, growth rate, sporulation, spore germination rate, thermotolerance and UV radiation resistance were detected. According to the above biological characteristics, threestrains Bb338, Bb346 and Bb2-1 were selected for further bioassay against the adult ofB. melanopus. Bioassay results showed that the strain Bb2-1 was the most virulent strain to the adults ofB. melanopus, which had the highest corrected mortality rates of 100%, highest cadaver rates of 86.11% and shortest LT50of 3.32 d at a concentration of 1.0×107conidia per milliliter. The strain Bb2-1 has the best biological characteristics and the highest virulent against the adults ofB. melanopus, which would play a very important role in biocontrol ofB. melanopus.

Basilepta melanopus,Beauveria bassiana, biological characteristics, virulence, strain screening

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2017)03-229-08

2017-02-10

：2017-02-24

福建省自然科學(xué)基金項目（2015J01099）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-23）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所重點項目（2014-cys-02）

王定鋒，男，碩士，助理研究員，主要從事害蟲生物防治研究。*通訊作者：gywupt@163.com