陳世明，章瑾，王卓然，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

人成體神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)后遺傳穩(wěn)定性研究

陳世明，章瑾，王卓然，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

神經(jīng)干細(xì)胞因具有自我更新、增殖和多向分化潛能[1]，神經(jīng)干細(xì)胞移植已成為治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病的新方法[2-5]。但神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍存在許多技術(shù)難點(diǎn)，培養(yǎng)過程中細(xì)胞易分化或凋亡，難以長期培養(yǎng)[6]。且培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生遺傳漂變、微生物污染、細(xì)胞交叉污染等問題[7]。培養(yǎng)傳代時(shí)，一般使用化學(xué)性酶，如胰蛋白酶等分離神經(jīng)干細(xì)胞球，酶的多次使用對長期培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可能產(chǎn)生累積損傷[8-11]。因此，經(jīng)體外長期培養(yǎng)后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化能力，尤其是遺傳信息穩(wěn)定性依然未知。我們以物理方法切割分離神經(jīng)干細(xì)胞球，并改良了神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，成功實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)[12]。但該方法是否存在遺傳不穩(wěn)定性仍需要進(jìn)行研究。本文通過對體外傳代培養(yǎng)不同時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行短串重復(fù)序列（STR）分析和端粒酶活性鑒定，為神經(jīng)干細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM/F-12（1∶1）培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司；人重組表皮細(xì)胞生長因子（rhEGF）、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rhbFGF）、N2 Supplement 均購自美國 Gibco公司；16 位點(diǎn) STR 試劑盒和 2800 M DNA 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Promega 公司；TeloTAGGG 端粒酶 PCR-ELISA 試劑盒購自瑞士羅氏公司；巢蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 取流產(chǎn)胎兒腦組織，在無菌條件下分離出海馬組織，D-Hank’s 液清洗，眼科剪剪成小組織塊，加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min，胰酶抑制劑終止其消化。用 100 目不銹鋼細(xì)胞過濾篩過濾，去除大組織塊，離心收集沉淀細(xì)胞。將沉淀細(xì)胞重懸于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)后以（1 ～ 2）× 106/ml接種到 T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，3 ～ 4 d半量更換神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基一次。每月用自行研制的干細(xì)胞球切割器切割分離傳代一次。

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞球及分化細(xì)胞觀察 分別取神經(jīng)干細(xì)胞球懸液滴于經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，置 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，使細(xì)胞黏附于載玻片上，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并照相記錄。

1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的 STR 分析法 按 STR 試劑盒說明書操作，檢測體外培養(yǎng) 2、6、12 和 30 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞的短串聯(lián)重復(fù)序列。取 1 × 106個(gè)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，加入裂解液裂解，再加入平衡酚、氯仿、異戊醇提取 DNA，無水乙醇清洗后棄上清，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行 STR 測序。

1.2.4 神經(jīng)干細(xì)胞端粒酶活性檢測 按端粒酶試劑盒說明書檢測體外培養(yǎng) 2、6、12、24 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞。空白對照為 DEPC 水，陰性對照選擇 RNase 處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞，陽性對照選擇神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞及試劑盒提供的人腎細(xì)胞 293 凍干粉。取培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞，胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。取約 2 × 105個(gè)細(xì)胞，加入裂解液裂解，孵育、離心后取上清進(jìn)行端粒酶催化特異底物反應(yīng)的 PCR。PCR 產(chǎn)物變性后按試劑盒要求用地高辛標(biāo)記的特異探針雜交，而后用偶聯(lián)過氧化物酶的抗地高辛抗體行 ELISA 反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定 ELISA 結(jié)果（檢測波長為 450 nm，參考波長為 690 nm）。測定值大于 0.25 為端粒酶陽性。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞球及分化細(xì)胞觀察

傳代培養(yǎng) 30 個(gè)月神經(jīng)干細(xì)胞球形態(tài)見圖 1，神經(jīng)干細(xì)胞的分化細(xì)胞形態(tài)見圖 2。

圖 1 倒置顯微鏡下觀察人神經(jīng)干細(xì)胞球（× 100）

2.2 STR 分析

通過檢測發(fā)現(xiàn)，2、6、12 和 30 個(gè)月培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均有相同的短串連重復(fù)序列（表 1）。

圖 2 神經(jīng)干細(xì)胞球部分分化[A：經(jīng)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞球（× 100）；B：神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞（× 100）；C：神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞（× 200）；D：神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞（× 400）]

表 1 不同培養(yǎng)時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞短串連重復(fù)序列檢測結(jié)果

2.3 端粒酶活性測定

結(jié)果（圖 3）顯示，陽性對照和 IMR-32 細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。2、6、12、24 個(gè)月培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均為陰性。

3 討論

圖 3 不同培養(yǎng)時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞端粒酶活性

神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中極易分化，并發(fā)生微生物污染、細(xì)胞間交叉污染等問題，長期傳代培養(yǎng)又易導(dǎo)致細(xì)胞遺傳信息的漂移和變異[13]，進(jìn)而出現(xiàn)異常分化、基因不穩(wěn)定和癌變等現(xiàn)象，因此，在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對其遺傳穩(wěn)定性的檢測尤為重要。實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)干細(xì)胞球的形態(tài)在30 個(gè)月內(nèi)無明顯變化。體外培養(yǎng) 30 個(gè)月后神經(jīng)干細(xì)胞球分化后，可見典型神經(jīng)元形態(tài)及星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，可判斷此類細(xì)胞仍具有良好的增殖和分化能力。

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）在遺傳病及親子鑒定等方面已廣泛應(yīng)用，但在細(xì)胞培養(yǎng)中，主要檢測基因變異和細(xì)胞交叉污染[14]。通常情況下，每一個(gè) STR 位點(diǎn)會(huì)被 5% ～ 20% 的人們所共有，理論上聯(lián)合應(yīng)用 16 個(gè) STR 位點(diǎn)，其個(gè)體識(shí)別率可達(dá) 99.9999999998%。在細(xì)胞培養(yǎng)過程及 STR 過程中的微量 DNA 污染，會(huì)造成錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。STR 檢測過程中，DNA 樣品提取純化的質(zhì)量、緩沖液的微小差異、離子強(qiáng)度、引物濃度等，甚至不同的熱循環(huán)條件，都會(huì)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。本實(shí)驗(yàn)通過對神經(jīng)干細(xì)胞特殊基因位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，不但檢測了交叉污染情況，也能說明長期培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的 30 個(gè)月時(shí)間內(nèi)，Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358，Penta D、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818，F(xiàn)GA、TPOX、D8S1179、vWA、Amelogenin 位點(diǎn)在不同時(shí)間段均具有相同的基因重復(fù)次數(shù)，可準(zhǔn)確判斷細(xì)胞具有穩(wěn)定的遺傳信息，且無任何交叉污染，各組之間并無遺傳突變。

干細(xì)胞在自我更新、增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面與腫瘤細(xì)胞有著相似的生物學(xué)特征，尤其是在自我更新越頻繁的組織中，干細(xì)胞自我更新越快，腫瘤發(fā)生率越高[15]。因此，在神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)過程中，對其不同階段的癌變可能性檢測十分必要。而對細(xì)胞端粒酶的活性檢測，不僅能滿足以上要求，還能從側(cè)面反應(yīng)出細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）的誕生及應(yīng)用，大大提高了檢測的敏感度，已成為端粒酶活性檢測最常用的方法。端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞的培養(yǎng)、使用細(xì)胞量、RNA 提取及 ELISA 反應(yīng)條件，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中培養(yǎng)至 2、6、12、24 個(gè)月，神經(jīng)干細(xì)胞的端粒酶活性均為陰性，而神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。端粒酶能修復(fù)延長端粒，可以讓端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗，使得細(xì)胞分裂的次數(shù)增加。當(dāng)端粒酶活性不足以抑制端粒長度的縮短，致使細(xì)胞喪失增殖能力[16]。Ostenfeld 等[17]研究表明，人神經(jīng)干細(xì)胞的端粒較短，并隨著細(xì)胞分裂進(jìn)一步縮短，致使神經(jīng)干細(xì)胞不能在體外長期傳代。而腫瘤細(xì)胞端粒酶活性很高，每次腫瘤細(xì)胞分裂后縮短的端粒被端粒酶延長，致使細(xì)胞長期無限增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng) 12 ～ 24 個(gè)月后，端粒酶活性與之前各組并未顯示顯著差異，自我更新、增殖分化能力亦未見異常，可能與神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和傳代的特殊方法有關(guān)，也可能與端粒酶測試方法的敏感度有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.015

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2017-02-03