徐瀟穎，劉 柱，梁晶晶，陳萬勤，羅金文

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052）

全自動固相萃取-高效液相串聯(lián)質(zhì)譜測定分析水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物

徐瀟穎，劉 柱，梁晶晶，陳萬勤，羅金文*

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052）

建立水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物的全自動固相萃取-高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，采用全自動固相萃取儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的凈化方式，使前處理操作具有簡單、快速、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。并對目前研究中常見的3種定量分析方法進行比較，發(fā)現(xiàn)采用同位素內(nèi)標法在0.1～10 ng/mL線性范圍內(nèi)對孔雀石綠、結晶紫、隱色孔雀石綠和隱色結晶紫進行定量分析，相關系數(shù)均大于0.999；在空白樣品中進行0.5、1.5、4.0 μg/kg 3組不同水平的加標試驗，平均回收率在88.8%～103.5%之間，相對標準偏差RSD（n=6）在1.32%～3.62%之間。相比于外標法和雙同位素內(nèi)標定量法，此方法結果準確、重現(xiàn)性佳，更適合水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物的殘留測定分析。

孔雀石綠；結晶紫；隱色結晶紫；隱色孔雀石綠；同位素內(nèi)標；全自動固相萃取

0 引言

孔雀石綠（MG）和結晶紫（CV）是人工合成的三苯甲烷類堿性工業(yè)染料，最早被應用于紡織工業(yè)，后因其抗菌效果好、價格低廉被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[1-4]。三苯甲烷類化合物具有高毒、高殘留和三致（致癌、致畸、致突變）等危害，而且孔雀石綠（MG）和結晶紫（CV）經(jīng)生物體代謝后會產(chǎn)生危害性更強的隱色孔雀石綠（LMG）和隱色結晶紫（LCV）[5]。因而歐盟、美國FDA等宣布禁止其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用[6-7]。2005年歐盟在我國出口水產(chǎn)品中檢出三苯甲烷類藥物殘留，給我國水產(chǎn)品出口帶來不利影響[8]。所以，為滿足進出口檢測要求，確保水產(chǎn)品的安全性，建立準確可靠的定量定性方法迫在眉睫。

目前，國內(nèi)外對孔雀石綠、結晶紫和其代謝產(chǎn)物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[9]、分光光度法[10]、高效液相色譜法（HPLC）[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）[15-17]。酶免疫法一般用于大批量用品的快速篩選；分光光度法由于靈敏度不高，準確性差，在復雜樣品基質(zhì)中應用較少；液相色譜法無法將孔雀石綠、結晶紫和它們的代謝產(chǎn)物進行分別定量，需通過PbO2氧化柱，將隱色孔雀石綠和隱色結晶紫轉(zhuǎn)化為其對應物質(zhì)后再進行測定，因而無法實現(xiàn)孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物的同時測定；液相色譜-質(zhì)譜法雖能滿足定性要求，但在定量檢測中準確度方面仍有欠缺；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具備靈敏度高、特異性強等優(yōu)點逐漸成為孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物測定的主流方法，但對于檢測結果采用外標法、內(nèi)標法還是按GB/T 19857—2005的方式進行定量，目前還未見綜合比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚：市售。

孔雀石綠（MG）、結晶紫（CV）、隱色孔雀石綠（LMG）、隱色結晶紫（LCV）購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，它們分別對應的同位素內(nèi)標購自WITEGA（純度均大于98%）。

標準儲備溶液的配制：準確稱取MG、CV、LMG、LCV、D5-MG、D6-LMG、D6-CV與D6-LCV標準品，用乙腈溶解并稀釋成100 μg/mL的標準儲備液，-18℃避光保存條件下可穩(wěn)定3個月；乙腈、甲醇為色譜醇（Merck試劑）；試驗用水為Millipore超純水；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Gradient超純水儀：法國 Millipore；Fotector plus全自動固相萃取儀：美國Reeko；臺式離心機：美國Thermo Fisher；快速多樣品自動勻漿機：美國 Pro Scientific；液相色譜儀：日本 Shimadzu；三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國 SCIEX。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

3.5 宣傳推介，拓寬銷路 積極運作，盡快注冊“彬州梨”地理標志證明商標；參加各類展會并在上海、廣州等城市舉辦彬州梨專題推介會；邀請農(nóng)林衛(wèi)視、咸陽電視臺等來彬拍攝 “彬州梨”專題節(jié)目，在網(wǎng)絡、電視和其他新媒體上推介宣傳，重塑“彬州梨”品牌形象；利用彬州梨走上湖南衛(wèi)視“天天向上”欄目的良好效應，整合現(xiàn)有彬州梨網(wǎng)絡銷售渠道，與中國郵政等快遞公司深度合作，統(tǒng)一標準、統(tǒng)一貨源、統(tǒng)一銷售，讓彬州梨走向全國。

精確稱取5.0 g（精確至0.000 1 g）已混勻的樣品于50 mL離心管中，加入混合同位素內(nèi)標工作液，加入8 mL乙腈，超聲振蕩提取2 min，8 000 r/min勻漿提取30 s，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液移至25 mL比色管中；用玻棒搗碎離心管中的沉淀，8 mL乙腈重復提取1次，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，搖勻備用。

1.3.2 凈化

精確移取2.0 mL樣品溶液加至已活化（使用前用5 mL乙腈活化）的中性氧化鋁柱上，3 mL乙腈洗脫兩次，收集洗脫液于10 mL試管中，35℃下氮氣吹至近干，加入2.0 mL初始流動相，漩渦溶解復溶，0.22 μm微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

1.4.1 液相色譜條件

表1 色譜分離梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution program

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描；掃描方式：多重反應監(jiān)測；電離電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣流速：30 L/min；碰撞氣流量：5 L/min；電源 ；化合物定性離子對、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

2 結果與分析

2.1 樣品處理條件的優(yōu)化

在前處理過程中，采用乙腈進行提取，由于樣品基質(zhì)較復雜，因此需采用中性氧化鋁柱對提取液進行凈化，除去一些與被測組分相似的干擾物和色素等雜質(zhì)。在凈化過程中，對回收率與乙腈洗脫次數(shù)之間的關系進行研究，結果如圖1所示，表明孔雀石綠、結晶紫和它們的代謝產(chǎn)物隨洗脫次數(shù)的增加回收率呈上升趨勢，但二次洗脫后，回收率數(shù)值差異較小，基于試驗效率及研究成本的考慮，采用2次洗脫。

圖1 4種組分在中性氧化鋁柱上的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of 4 components on Alumina-N column

傳統(tǒng)的過柱凈化過程存在效率低、過柱流速不易控制以及操作過程易引起人為誤差，因此本試驗采用全自動固相萃取儀進行凈化富集，進行智能軟件設定后，可同時自動完成多樣品的凈化富集，大大縮短了前處理時間，有效提高檢測精度和檢測效率，凈化程序見表3。

按照本實驗優(yōu)化后的洗脫程序?qū)?組不同規(guī)格的中性氧化鋁柱進行選擇，結果見表4，發(fā)現(xiàn)不同柱填充量引起了孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物的回收率差異，故選用1 cc/30 mg的中性氧化鋁進行凈化。

表3 全自動固相萃取儀洗脫條件Table 3 Elution parameters of all automatic solid phase extraction apparatus

表4 不同規(guī)格中性氧化鋁柱回收率結果Table 4 Recovery rates of Alumina-N columns with different specifications

2.2 色譜分離條件的選擇

分別選用甲醇、乙腈作為流動相的有機相，實驗發(fā)現(xiàn)孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物具有較強的非極性，在洗脫過程中出現(xiàn)不同程度拖尾現(xiàn)象，故采用乙腈作為有機相分離效果更好。將水相中5 mmol/L乙酸銨濃度配制為10 mmol/L可增加被測定組分的離子化效率，提高相應靈敏度。同時本試驗采用梯度洗脫減少基質(zhì)影響。

選用Waters Atlantis T3柱（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）進行分離，能有效地在5 min內(nèi)完成4種化合物的分離，且5.0 μm的內(nèi)徑可以減少拖尾現(xiàn)象，使峰形具有更好的對稱性。

2.3 孔雀石綠、結晶紫、隱色孔雀石綠、隱色結晶紫及對應內(nèi)標物的標準溶液離子色譜圖

采用試驗優(yōu)化條件后，孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物（10 ng/mL）的標準溶液離子色譜圖如圖2所示；同位素內(nèi)標D5-MG、D6-LMG、D6-CV與D6-LCV的標準溶液離子色譜圖如圖3所示。

2.4 3種不同定量方式的標準曲線的繪制及回收率結果

圖2 混合標準樣品的離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatograms of mixed standards

圖3 孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物的儀器信噪比（加標量0.1 μg/kg）Fig.3 Signal-to-noise ratio of 4 components

在進行樣品前處理條件優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物在凈化過程中的回收率存在一定差異，因此在配制標準曲線時采用基質(zhì)加標的方式，稱取樣品后加入適量的混合標準儲備液和混合內(nèi)標標準溶液，進行提取凈化后至質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的系列工作液，以儀器響應的峰面積Y對應質(zhì)量濃度X（ng/mL）進行線性回歸，分別采用外標法、內(nèi)標法以及GB/T 19857—2005的方式進行定量分析，回歸方程及相關系數(shù)見表5，結果表明當采用外標法進行定量分析時，孔雀石綠的相關系數(shù)偏低；GB/T 19857—2005法中結晶紫以氘代孔雀石綠，隱色結晶紫以氘代隱色孔雀石綠進行定量，由于結晶紫與孔雀石綠的分子結構上存在一定差異，導致過柱回收率有所差別，因此采用以氘代孔雀石綠對結晶紫進行定量分析造成相關系數(shù)較低；當采用內(nèi)標法進行定量時4種被測物質(zhì)的線性關系良好，相關系數(shù)R2≥0.999。

選取不含待測物的空白魚肉樣品為基質(zhì)，進行0.5、1.5、4.0 μg/kg 3個水平的標準添加回收試驗，每個水平進行6次重復試驗，采用外標法、內(nèi)標法以及GB/T 19857—2005的方式進行定量分析，回收率和精密度數(shù)據(jù)見表6。結果表明，外標法測定中孔雀石綠精密度差，回收率不穩(wěn)定；而結晶紫在采用外標法及GB/T 19857—2005法進行定量分析過程中都存在回收率低的現(xiàn)象；隱色孔雀石綠和隱色結晶紫在采用不同方法定量時，具有較好的回收率，精密度較高，該現(xiàn)象與兩者較為穩(wěn)定的化學性質(zhì)有關。3種不同的定量方法中，內(nèi)標法對孔雀石綠、結晶紫、隱色孔雀石綠、隱色結晶紫的平均加標回收率分別在88.8%～90.5%、99.5%～ 100.5%、96.8%～103.5%、97.7%～100.6%之間，相對標準偏差均小于3.62%。說明本方法準確度高、重復性好。

表5 3種不同定量方式的標準曲線及相關系數(shù)Table 5 Standard curves and correlation factions of three different quantitative methods

表6 3種不同定量方式的計算不同加標水平的回收率（n=6）Table 6 Recovery rates and RSD of fortified samples by three different quantitative methods(n=6)

2.5 方法檢出限試驗

通過在陰性樣品中添加標準物質(zhì)的方法考察靈敏度。在規(guī)定的取樣質(zhì)量下，定容體積為1.0 mL，按照3倍信噪比計，MG、CV、LMG、LCV的檢出限均為0.1 μg/kg；當在被測樣品中添加水平為0.1 μg/kg時，信噪比均大于3，表明孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物均可達到檢出限，如圖3所示。

3 結論

本試驗采用全自動固相萃取儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的過柱凈化，大大提高了前處理效率，實現(xiàn)過柱流速可控性，大幅減少了操作過程中引起的誤差。在此基礎上，分別采用外標法、內(nèi)標法以及GB/T 19857—2005法對孔雀石綠、結晶紫及其代謝產(chǎn)物進行定量分析，發(fā)現(xiàn)采用外標法時，孔雀石綠在不同加標水平的回收率大于110%，且相對標準偏差在8.6% ～10.2%之間，精密度較差；而GB/T 19857—2005法中采用氘代孔雀石綠對結晶紫進行定量，由于結晶紫與孔雀石綠在分子結構上的存在差異，過柱凈化過程中回收率不同，所以該法中結晶紫的不同水平加標回收率在73.6%～76.4%之間，相對標準偏差均大于5%；當采用內(nèi)標法時，可有效避免因操作過程中待測物質(zhì)的損失而造成回收率偏低的現(xiàn)象，消除機制對測定結果的影響，3組不同水平的加標試驗，平均回收率在88.8%～103.5%之間，相對標準偏差在1.32%～3.62%范圍內(nèi)，達到了結果準確可靠、回收率穩(wěn)定、精密度好的實驗目標。

圖3 孔雀石綠、結晶紫、隱色孔雀石綠、隱色結晶紫的同位素內(nèi)標離子色譜圖Fig 3.Quantitative ion chromatograms of isotope internal standards

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DETERMINATION AND ANALYSIS OF MALACHITE GREEN，CRYSTAL VIOLET AND THEIR METABOLITES RESIDUES IN AQUATIC PRODUCTS BY SPE-LC-MS/MS

XU Xiaoying，LIU Zhu，LIANG Jingjing，CHEN Wanqin，LUO Jinwen
（Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310052，China）

Malachite green(MG)and crystal violet(CV)are the synthetic triphenylmethane basic dyes，which are the compounds with high toxicity，high residue and carcinogenic，teratogenic，mutagenic and other hazards.An automatic-SPE-LC-MS/MS method was established for simultaneous determination of malachite green，crystal violet and their metabolites residues in aquatic products in the present study.Instead of traditional method of purifying，automatic solid phase extraction(SPE)enabled the pretreatment process had the advantages of rapid，accurate and good reproducibility.Meanwhile，three common quantitative analytical methods were also compared. The results showed that good linear relationships were obtained in the range of 0.1～10.0 ng/mL for malachite green，crystal violet and their metabolites analysis using isotope internal standard method and the correlation coefficients R2were all higher than 0.999.The average recovery rates of blank samples were from 88.8%to 103.5%with the standard levels of 0.5，1.5 and 4.0 μg/kg and the relative standard deviations(RSD)were varied from 1.32%to 3.62%（n=6）.Compared with external standard method and two-isotopic standard method，this method showed good repeatability and accuracy and was more suitable for the analysis of malachite green，crystal violet and their metabolites residues.

malachite green；crystal violet；leucomalachite green；leucocrystal violet；isotope internal standard；automatic-SPE

TS201.2

B

1673-2383(2017)01-0081-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170222.1117.032.html

網(wǎng)絡出版時間：2017-2-22 11:17:04

2016-05-06

浙江省科技計劃項目（2015C37054）；浙江省科技廳重大項目（2014C02001）

徐瀟穎（1989—），女，浙江金華人，助工，研究方向為食品安全與分析技術。

*通信作者