劉 曼，施 敏，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

離子液體雙水相萃取-HPLC分析紅酒中的痕量氯酚類物質(zhì)

劉 曼，施 敏，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

建立親水性離子液體[C4MIM]BF4與無機鹽(NH4)2SO4形成的離子液體雙水相萃取富集紅酒樣品中6 種痕量氯酚類物質(zhì)的方法。通過考察離子液體和鹽的種類、pH值、離子液體和鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對氯酚萃取率和富集倍數(shù)的影響，確定萃取氯酚的最優(yōu)條件。在最佳萃取條件下，6 種氯酚的線性范圍為20～200 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)到0.999，6 種氯酚的檢出限在3.68～12.16 μg/L之間。對實際紅酒樣品進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率為87.73%～103.44%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.33%～6.35%之間。該法操作簡單、迅速、綠色且具有較高的萃取效率。

離子液體；雙水相；氯酚；紅酒；高效液相色譜

氯酚類化合物是指在苯酚的苯環(huán)上連有不同數(shù)目氯原子的一類具有毒性、難降解的環(huán)境激素。由于其抑菌特性而作為木材防腐劑、殺菌劑、除草劑和防銹劑等在化工和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[1]。但氯酚是高毒性化合物，具有雌激素、致突變以及致癌的作用，可經(jīng)眼睛和皮膚接觸、膳食攝入等進(jìn)入人體，對人類健康和環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅，已被美國國家環(huán)境保護(hù)局列為優(yōu)先控制污染物[2]。有文獻(xiàn)報道，在環(huán)境水樣[3]甚至一些食品如紅酒[4]、蜂蜜[2]中檢測到了痕量氯酚。目前，氯酚類物質(zhì)的檢測方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。而由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，在測定氯酚類物質(zhì)含量之前需進(jìn)行樣品前處理，前處理的方法主要有溶劑萃取、固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、液液微萃取[2]等，但這些方法大多會使用到有機溶劑，存在污染。因此，尋求一種綠色且簡單、迅速的檢測方法成為亟待解決的問題。

離子液體是指在室溫或接近室溫條件下呈液態(tài)，由有機陽離子和有機或無機陰離子組成的鹽，又稱室溫離子液體、低溫熔融鹽或室溫熔融鹽[5-6]。由于其具有不揮發(fā)、不易燃、毒性小、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，對許多無機物和有機物有獨特的溶解性， 且陰陽離子種類多使其具有廣泛的可調(diào)性[7-10]等獨特的優(yōu)點，在有機合成、電化學(xué)、化學(xué)分離等方面引起了人們廣泛的興趣。尤其是近年來與普通雙水相體系結(jié)合形成離子液體雙水相體系后，既利用了離子液體和雙水相體系較之于兩相有機溶劑體系毒性小等的優(yōu)點，又克服了離子液體黏度大、普通雙水相體系成相慢和易乳化的缺點，使得離子液體雙水相體系成為研究的熱點。

離 子液體雙水相是繼普通雙水相體系后，于2002年由Dupont等[3]發(fā)現(xiàn)，Gutowski等[12]提出的可用于萃取分離、分析前處理的體系，通常是由離子液體、鹽和水組成的兩相系統(tǒng)。離子液體雙水相萃取與傳統(tǒng)的兩相溶劑系統(tǒng)和雙水相系統(tǒng)萃取類似，是根據(jù)物質(zhì)在離子液體相和無機鹽相中分配系數(shù)的差異從而達(dá)到與其他物質(zhì)分離的效果。此體系除具有傳統(tǒng)雙水相具有的優(yōu)點外，能夠更好地控制乳化現(xiàn)象，且離子液體可以回收。目前，離子液體雙水相體系在食品和環(huán)境中痕量有害物質(zhì)的富集和分析前處理方面得到廣泛應(yīng)用。如通過離子液體雙水相萃取富集蜂蜜、牛奶等食品和環(huán)境水樣中的抗生素[13-16]、飲料和糖果等中的染料和色素[17-19]、牛奶和茶飲料等中的農(nóng)獸藥殘留[20-21]、香精香料中的抗氧化劑[22]、人體體液中的有毒有害物質(zhì)[23]等，這些研究都表明，離子液體雙水相萃取較傳統(tǒng)的利用液液萃取、液液微萃取、固相萃取、固相微萃取等分析前處理方法操作簡單、高效，且可避免有機溶劑等的使用，萃取后可直接取樣檢測，因此在對食品樣品和環(huán)境等的分析前處理方面有廣泛的應(yīng)用前景。

本實驗主要研究離子液體[C4MIM]Cl、[C4MIM]BF4與不同種類的無機鹽形成的離子液體雙水相體系對紅酒中的氯酚類物質(zhì)富集的效果，通過研究離子液體和鹽的種類、pH值、離子液體和鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對氯酚萃取率和富集倍數(shù)的影響，最終確定最優(yōu)的離子液體雙水相體系，并對實際的紅酒樣品進(jìn)行分析檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酒 市購；6 種氯酚標(biāo)準(zhǔn)品：2-氯酚（2-chlorophenol，2-CP）、4-氯酚（4-chlorophenol，4-CP）、2,4-二氯酚（2,4-dichlorophenol，2,4-DCP）、2,6-二氯酚（2,6-dichlorophenol，2,6-DCP）、2,4,5-三氯酚（2,4,5-trichlorophenol，2,4,5-TCP）、2,4,6-三氯酚（2,4,6-trichlorophenol，2,4,6-TCP） 美國Sigma公司；氯化-1-丁基-3-甲基咪唑（[C4MIM]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4MIM]BF4） 上海成捷化學(xué)有限公司；乙腈、磷酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；無水乙醇（分析純） 北京化工廠；所有用鹽均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀（配有四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、Chem Station色譜工作站）美國安捷倫科技有限公司；TP-214電子分析天平 美國Denver公司；QL-901渦旋振蕩器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為0.5%磷酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～4 min，25% A；4～6 min，25%～30% A；6～20 min，30% A，回至初始25% A平衡8 min；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；檢測波長215 nm。

1.3.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱量2-CP、4-CP、2,4-DCP、2,6-DCP、2,4,5-TCP、2,4,6-TCP，用乙醇溶解并用容量瓶定容至10 mL，配制成0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，存放于4 ℃冰箱。實驗時用體積分?jǐn)?shù)12.5%乙醇溶液稀釋至0.5 mg/L作為氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

紅酒樣品的配制：紅酒經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，于4 ℃冰箱存放。

1.3.3 離子液體雙水 相萃取

在10 mL的離心管中放入一定量的鹽、離子液體和氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液或紅酒樣品，渦旋振蕩使其充分溶解，放入高速離心機中使其快速分相，取出含氯酚的少量離子液體相進(jìn)行高效液相色譜分析檢測。

1.3.4 定量分析

氯酚在雙水相中的萃取效果通過萃取率（E）和富集倍數(shù)（F）描述[24]。按公式（1）、（2）計算：

式中：Vt、Ct為萃取后上相體積/mL和氯酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V、C分別為加入的標(biāo)準(zhǔn)工作液體積/mL和氯酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子液體的選擇

考察了[C4MIM]Cl、[C4MIM]BF4兩種離子液體與K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、Na2CO37 種無機鹽的成相能力。其中，[C4MIM]Cl可以與K2HPO4形成雙水相，[C4MIM]BF4可以與Na2HPO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、Na2CO3形成雙水相。

[C4MIM]Cl可以與K2HPO4形成雙水相，但由于紅酒樣品呈酸性，[C4MIM]Cl與K2HPO4形成的雙水相體系由于鹽的存在呈堿性，會與紅酒樣品發(fā)生顏色反應(yīng)。并且研究[C4MIM]BF4與鹽形成的雙水相對氯酚的萃取效果得出，[C4MIM]BF4與一些鹽形成的雙水相與紅酒樣品不會發(fā)生顏色反應(yīng)，并能夠有效地對氯酚進(jìn)行富集，因此，選擇[C4MIM]BF4作為萃取氯酚的離子液體。

2.2 無機鹽的選擇

Na2HPO4、Na2CO3溶液呈堿性，與[C4MIM]BF4形成的雙水相體系仍會與紅酒樣品發(fā)生顏色反應(yīng)。因此，選用[C4MIM]BF4與NaH2PO4、(NH4)2SO4、Na2SO43種無機鹽形成的雙水相體系，比較其對氯酚的萃取性能。結(jié)果表明，在[C4MIM]BF4量少的情況下，即使NaH2PO4和Na2SO4達(dá)到溶解度，也不能形成雙水相，提高[C4MIM]BF4的量，雖然能夠形成雙水相，但是氯酚在[C4MIM]BF4與NaH2PO4形成的雙水相體系中富集倍數(shù)低，在[C4MIM]BF4與Na2SO4形成的雙水相體系中氯酚分配在兩相，達(dá)不到富集痕量氯酚的效果。[C4MIM]BF4與(NH4)2SO4形成的雙水相體系通過調(diào)節(jié)[C4MIM]BF4和(NH4)2SO4的量能夠使氯酚完全富集在一相，且能夠達(dá)到較高的富集倍數(shù)。因此，選用(NH4)2SO4作為與[C4MIM]BF4形成離子液體雙水相富集氯酚的無機鹽。

2.3 雙水相相圖的繪制

通過濁點滴定法[11]測定[C4MIM]BF4-(NH4)2SO4體系的雙水相相圖。由于大多的紅酒樣品中有12.5%乙醇，乙醇對雙水相的成相有影響，因此，雙水相相圖的測定選用體積分?jǐn)?shù)12.5%乙醇溶液。將一定量的[C4MIM]BF4-乙醇溶液加入試管中，逐步滴加已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4-乙醇溶液，直至溶液恰好變渾濁；再逐步滴加12.5%乙醇溶液至恰好變澄清。再滴加(NH4)2SO4溶液使其剛好變渾濁，如此反復(fù)操作。通過稱重法測量滴加的(NH4)2SO4溶液和乙醇溶液的質(zhì)量，計算在濁點時的[C4MIM]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖1所示。通過所繪制的雙水相相圖，在優(yōu)化條件下，可以直接以相圖為參考，選取能夠形成雙水相的合適體系，考察其對氯酚的萃取效率和富集倍數(shù)。

圖1 [C1 [C4MIM]BFIM]BF4-(NH-(NH4)2SOSO4體系的雙結(jié)線Fig.1 Bimodal curves for [C4MIM]BF4-(NH4)2SO4ILATPS system

2.4 pH值的選擇

溶液的pH值是影響萃取效率的一個重要因素，特別是當(dāng)所萃取的物質(zhì)為弱酸或弱堿性的物質(zhì)時，溶液的酸堿性會影響萃取物在溶液中的存在形式，因此，調(diào)節(jié)溶液的pH值可以使萃取物呈現(xiàn)不同的狀態(tài)從而改變萃取物在溶液中的溶解度，使萃取物更易在萃取溶劑中存在，以達(dá)到萃取的目的。氯酚是一種弱酸，在溶液呈堿性條件下，羥基上氧的電子云向苯環(huán)移動，容易電離出H+而呈現(xiàn)酸性，改變了氯酚的狀態(tài)，但在溶液呈酸性時，可抑制氯酚的電離，使氯酚仍舊以中性分子的形式存在[1]，不改變其性質(zhì)和狀態(tài)，利于氯酚的萃取。通過測定從市場上購買的3 種紅酒樣品的pH值，范圍 在2.89～3.54之間，呈酸性，且文獻(xiàn)[7,26]報道的對氯酚類物質(zhì)富集的最優(yōu)pH值大都在3.0～4.5之間。因此，在優(yōu)化離子液體雙水相條件時，為減少對紅酒樣品的前處理，所選取的氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液的pH值定為3.00。

2.5 雙水相體系的優(yōu)化

2.5.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖2 (NH4)2SSOO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取率的影響Fig.2 Effects of (NH4)2SO4concentration on extraction efficiency

為考察(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對氯酚萃取效果的影響，根據(jù)所繪制的雙水相相圖，選擇[C4MIM]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、能夠形成雙水相的不同(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系對氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液中的氯酚進(jìn)行富集、高效液相色譜檢測，如圖2所示。在[C4MIM]BF4一定的情況下，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，氯酚會逐漸富集到[C4MIM] BF4相，達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4時，氯酚完全富集到一相，因此可得出，較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4利于氯酚的富集。

2.5.2 離子液體用量的影響

表1 離子液體用量對萃取率和富集倍數(shù)的影響Table1 Effects of ionic liquid concentration on extraction efficiency and enrichment factor

為能對紅酒樣品中痕量氯酚進(jìn)行分析檢測，需要選擇能夠?qū)⒙确油耆患叫◇w積上相的體系，即萃取率高、且上下相體積比（Vt/Vb）小的體系。2.5.1節(jié)結(jié)果表明，較高的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)利于氯酚的萃取，且根據(jù)雙水相體系的性質(zhì)，上相富含離子液體，下相富含鹽，離子液體量減少、鹽量增多會使雙水相體系的上下相體積比減少。因此根據(jù)繪制的[C4MIM]BF4與(NH4)2SO4雙水相體系的相圖，選擇[C4MIM]BF4少且(NH4)2SO4多的體系，比較其對氯酚的萃取性能，如表1所示。8 個體系對氯酚的萃取率都能達(dá)到較高、即能夠?qū)⒙确痈患揭幌?，但從富集倍?shù)來看，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% [C4MIM]BF4、32% (NH4)2SO4、66%氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液的體系對6 種氯酚富集倍數(shù)達(dá)到32.14～34.84，是所選取體系中富集倍數(shù)最高的。因此，選取該體系作為最優(yōu)體系，研究其對實際紅酒樣品中氯酚的檢測。

2.6 方法學(xué)驗證結(jié)果

將0.5 mg/L氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液作為母液，用12.5%乙醇溶液配制一系列不同質(zhì)量濃度的氯酚工作液，在所優(yōu)化的實驗條件下富集、高效液相色譜檢測，以所測得峰面積為縱坐標(biāo)、各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示，2-CP、4-CP、2,4-DCP、2,6-DCP、2,4,5-TCP、2,4,6-TCP的線性范圍為20～200 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999；以3 倍信噪比計算出6 種氯酚的方法檢出限（limit of detection，LOD）為3.68～12.16 μg/L，以10 倍信噪比計算出6 種氯酚的定量限（limit of quantity，LOQ）為12.27～40.53 μg/L。

表2 6 種氯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線、LOD、LOQ和富集倍數(shù)Table2 Regression equations, LODs, LOQs and enrichment factors for six chlorophenols

表3 加標(biāo)回收率、精密度和實際樣品分析Table3 Recovery and precision of six chlorophenols in spiked samples and analytical results for chlorophenol contents of real samples

取紅酒樣品，按照優(yōu)化的實驗方法測定6 種氯酚含量。根據(jù)所測定的值，在紅酒樣品中加入不同質(zhì)量濃度的6 種氯酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化實驗條件下，測定其加標(biāo)后的質(zhì)量濃度，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5），如表3所示。精密度通過日內(nèi)精密度和日間精密度評價[14]。日內(nèi)精密度是指相同的實驗條件下一天內(nèi)連續(xù)5 次分析加標(biāo)樣品，計算RSD；日間精密度是連續(xù)5 d分析加標(biāo)樣品，計算RSD，測得4 種氯酚的日內(nèi)精密度和日間精密度分別在0.22%～6.77%、0.37～7.89%之間，結(jié)果證明該方法的靈敏度較高、精密度較好，可滿足分析的要求。

如圖3所示，從空白紅酒經(jīng)富集后的色譜圖B和6 種氯酚混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖D比較來看，空白紅酒經(jīng)過富集后，在2-CP、4-CP出峰時間有物質(zhì)被檢出，通過對這2 個峰進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)這2 種物質(zhì)為紅酒本身的基質(zhì)，但由于其與2-CP、4-CP出峰時間吻合，對2-CP、4-CP的定量有干擾，因此計算加標(biāo)回收率、精密度和對實際樣品定量時，只考慮其他4 種氯酚。經(jīng)過計算，得到4 種氯酚的回收率為87.73%～103.44%，RSD為0.33%～6.35%。

圖3 紅酒樣品中氯酚的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of chlorophenols in red wine

2.7 實際樣品的分析

將購買的3 種紅酒經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，按照所優(yōu)化的實驗條件對紅酒樣品進(jìn)行氯酚富集，測定結(jié)果見表3，色譜圖見圖3。由于紅酒樣品中的氯酚為痕量物質(zhì)，因此無法通過直接檢測被檢出。經(jīng)過離子液體雙水相富集后，有一種紅酒樣品中檢測出含有10.9 μg/L的2,4-DCP。紅酒中氯酚主要來源與軟木塞的殺菌處理以及木桶的漂白和殺菌處理[26]。

3 結(jié) 論

建立了[C4MIM]BF4-(NH4)2SO4離子液體雙水相體系快速萃取紅酒中氯酚類物質(zhì)的方法，該法對氯酚的富集倍數(shù)高、重復(fù)性好、樣品用量低，且在紅酒不經(jīng)過其他任何前處理的情況下，能夠直接用優(yōu)化的雙水相體系萃取富集紅酒中的氯酚類物質(zhì)、高效液相色譜分析檢測，與其他大多采用固相萃取[27]、固相微萃取[28-29]、液液微萃取[26]等檢測紅酒中氯酚類物質(zhì)的方法相比，該法前處理步驟少、操作簡單易行、且避免了有機溶劑等物質(zhì)的使用。該法也可廣泛用于其他食品樣品中痕量有毒有害物質(zhì)的檢測。

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Determination of Trace Chlorophenols in Red Wine by Ionic Liquid Aqueous Two-Phase Extraction Coupled to HPLC

LIU Man, SHI Min, CAO Xueli*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

An extraction method based on an aqueous two-phase system consisting of the hydrophilic ionic liquid [C4MIM] BF4and the inorganic salt (NH4)2SO4for the simultaneous determination of six chlorophenols in red wine by high performance liquid chromatography (HPLC) was established. The extraction efficiency and enrichment factor were found to be influenced by the types and concentrations of salts and ionic liquids, as well as pH value, and these parameters were investigated to determine the optimal conditions for extracting chlorophenols. Under the optimal conditions, the linear ranges of six chlorophenols were 20-200 μg/L with correlation coefficients (R2) of 0.999, and the limits of detection (LODs) were in the range of 3.68-12.16 μg/L. This method was successfully applied to analyze six chlorophenols in real red wine samples with spiked recoveries ranging from 87.73% to 103.44% and relative standard deviation (RSD) ranging from 0.33% to 6.35%. This method is simple, rapid, environmentally friendly and efficient.

ionic liquid; aqueous two-phase system; chlorophenols; red wine; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201712040

TS262.6

A

1002-6630（2017）12-0260-06

劉曼, 施敏, 曹學(xué)麗. 離子液體雙水相萃取-HPLC分析紅酒中的痕量氯酚類物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 260-265.

10.7506/spkx1002-6630-201712040. http：//www.spkx.net.cn

LIU Man, SHI Min, CAO Xueli. Determination of trace chlorophenols in red wine by ionic liquid aqueous two-phase extraction coupled to HPLC[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 260-265. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712040. http：//www.spkx.net.cn

2016-09-07

北京市自然科學(xué)基金重點項目（KZ201410011016）

劉曼（1992—），女，碩士研究生，研究方向為生物分離工程。E-mail：jmpliu@163.com

*通信作者：曹學(xué)麗（1967—），女，教授，博士，研究方向為生物分離與分析。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn