袁 野，韓亞萍,馬斯晗

(東北林業(yè)大學(xué))

0 引言

自1960年激光問世以來(lái)，受到了衛(wèi)星通信、醫(yī)療、植物學(xué)等領(lǐng)域的青睞.1966年匈牙利科學(xué)家Mester首次發(fā)現(xiàn)弱激光具有生物效應(yīng)[1]，因此激光在生物學(xué)各方面的研究得到了廣泛關(guān)注和探索，如激光微生物突變株誘變修復(fù)、細(xì)胞損傷及修復(fù)、提高酶的活性以及增強(qiáng)植物的抗氧化性等[2-5].其中在植物生理生化和誘變育種領(lǐng)域，常用的激光器為He-Ne激光器、CO2激光器、紅寶石激光器等[6]，按激光脈沖寬度可分為納秒、皮秒、飛秒激光器等.飛秒激光器的瞬時(shí)功率高、穿透性強(qiáng)、脈沖寬度超短，單脈沖作用時(shí)間與生物化學(xué)反應(yīng)時(shí)間相同[7]，能在生物大分子間發(fā)生干涉衍射[8].擬南芥因植株個(gè)體小、生長(zhǎng)周期短、基因組小等特點(diǎn)，已被廣泛用于激光生物學(xué)研究.該文利用飛秒激光輻照擬南芥種子，統(tǒng)計(jì)其種子萌發(fā)率，測(cè)量幼苗根長(zhǎng)、鮮重，葉綠素、可溶性糖、過氧化氫酶、丙二醛的含量[9-11].篩選出飛秒激光輻照擬南芥的最佳實(shí)驗(yàn)條件，為深入研究飛秒激光對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)理提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為哥倫比亞野生型擬南芥種子.

1.2 方法

1.2.1 處理設(shè)置

該研究選用鈦寶石飛秒激光器，其參數(shù)為：波長(zhǎng)800nm、頻率1 kHz、擴(kuò)束后光斑直徑5 mm.用清水浸泡擬南芥種子3 h，隨后避光存入4℃冰箱進(jìn)行春化.實(shí)驗(yàn)采用不同輻照條件的飛秒激光照射擬南芥種子正反兩面，共設(shè)置對(duì)照組(CK)和實(shí)驗(yàn)組共26組，每組輻照40粒種子，各組輻照條件見表1.

表1 各實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置情況 mW

1.2.2 種子的培養(yǎng)

將處理后的各組種子用1%次氯酸鈉溶液浸泡滅菌2 min，隨后用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗，并將其點(diǎn)播在MS培養(yǎng)基上[12].在溫度(21～23℃)、濕度(60%～70%)、光照強(qiáng)度(5000～6000lx)的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擬南芥種子，其光照周期為16h光照和8h黑暗.待生長(zhǎng)8 d后，每組隨機(jī)選取20棵幼苗，移栽至黑土∶蛭石=1∶1的營(yíng)養(yǎng)土中栽培,保持土壤濕潤(rùn).

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)

從MS培養(yǎng)基放入光照培養(yǎng)箱的第2 d開始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，統(tǒng)計(jì)周期為24 h，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d，以種子露白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[13].發(fā)芽率公式如下：

發(fā)芽率(Gr)=(前7天種子萌發(fā)數(shù)/點(diǎn)播種子總數(shù))×100%

(1)

擬南芥種子經(jīng)8 d的MS培養(yǎng)后，每組隨機(jī)選取20株幼苗進(jìn)行根長(zhǎng)、鮮重的測(cè)量.

1.3.2 生理生化指標(biāo)

培養(yǎng)5周后測(cè)定葉綠素、可溶性糖、過氧化氫酶的含量，經(jīng)5天的旱處理后測(cè)量丙二醛含量，具體測(cè)量方法如下：

葉綠素含量的測(cè)定采用乙醇法[14].將0.05g葉片、石英砂、95%乙醇放入研缽中研磨至組織變白，過濾定容后得到葉綠素提取液，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)為470nm、649nm、665nm的吸光度，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量，如公式(2)～(5)：

ca=13.95A665nm-6.88A649nm

(2)

cb=24.96A649nm-7.32A665nm

(3)

cT=ca+cb

(4)

葉綠素含量(mg/g)=

(5)

可溶性糖含量的測(cè)定采用恩酮比色法[14].將0.05g葉片放入80%乙醇中沸水浴加熱30min，經(jīng)活性炭褪色后離心過濾后得到提取液.在提取液中加入蒽酮試劑10min后測(cè)量625nm處的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)蔗糖濃曲線測(cè)得蔗糖濃度，含量計(jì)算如公式(6)：

(6)

過氧化氫酶活性的測(cè)定采用紫外吸收法[14].將0.05g葉片和pH為7.8的磷酸緩沖液放入研缽中研磨成漿，經(jīng)離心過濾后提取粗酶液.在粗酶液中加入0.3mL的0.1mol/L過氧化氫，每分鐘測(cè)一次240nm下吸光度，共測(cè)4次，酶活性計(jì)算如公式(7)：

(7)

丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[15].將0.05g葉片加入石英砂和pH為7.8的磷酸緩沖液研磨成漿，經(jīng)離心過濾后的上清液為丙二醛提取液.在提取液中加入2mL的5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸沸水浴加熱10min，測(cè)量450nm、532nm、600nm波長(zhǎng)下的吸光度，丙二醛含量計(jì)算如公式(8)、(9)：

cMDA=6.45(A532nm-A600nm)-0.56Anm

(8)

(9)

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量三次，取平均值，使用Excel 2007與Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算與圖表的繪制.

2 結(jié)果與分析

2.1 飛秒激光對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響

由圖1可知,藍(lán)綠色區(qū)域表示促進(jìn)種子的萌發(fā)，橘紅色區(qū)域表示抑制種子的萌發(fā).綠色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組為C4(200 mW,30s)、D3(225 mW,20s)，平均發(fā)芽率高達(dá)96.3%，與CK組相比提高了11.3%，此區(qū)域?yàn)榇龠M(jìn)種子萌發(fā)的最佳實(shí)驗(yàn)條件.藍(lán)色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組平均發(fā)芽率為90.7%，與CK組相比提高了5.7%，此區(qū)域的飛秒激光能刺激種子的萌發(fā).橘色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組為E3(275mW,20s)、E4(275mW,30s)，平均發(fā)芽率為72.5%，與CK組相比下降了7.5%，此區(qū)域開始抑制種子萌發(fā).紅色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組為E5(275 mW,40s)，此時(shí)發(fā)芽率為57.5%，與CK組相比下降了27.5%，此區(qū)域?qū)ΨN子萌發(fā)起到了明顯的抑制作用.綜上所述，試驗(yàn)條件除E5(275 mW,40s)外的飛秒激光對(duì)擬南芥種子萌發(fā)均起促進(jìn)作用.

圖1 飛秒激光作用下擬南芥種子發(fā)芽率的變化

2.2 飛秒激光對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的影響

由圖2可知，縱坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)組與CK組根長(zhǎng)的差值，不同顏色表示不同的差值范圍.藍(lán)綠色區(qū)域表示起促根部生長(zhǎng)，橘紅色區(qū)域表示抑制根部生長(zhǎng).綠色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組為B1(175 mW,4s)、B2(175 mW,12s)、C1(200 mW,4s)、D1(225 mW,4s)，平均根長(zhǎng)為22.61mm，與CK組(20.22mm)相比提高了11.8%，此區(qū)域?yàn)榇龠M(jìn)根部發(fā)育的最佳實(shí)驗(yàn)條件范圍.藍(lán)色區(qū)域?qū)嶒?yàn)條件集中在輻照功率(150～275 mW)、輻照時(shí)間(4～12s)的范圍，平均根長(zhǎng)為21.54mm，與CK組相比提高了6.5%，此區(qū)域根長(zhǎng)的促進(jìn)作用減弱.橘色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)條件集中于輻照功率(150～275 mW)、輻照時(shí)間(20～30s)，平均根長(zhǎng)為19.51mm，與CK組相比下降了3.6%，此區(qū)域表現(xiàn)為抑制作用.紅色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)條件為輻照功率(150～275 mW)、輻照時(shí)間(30～40s)，平均根長(zhǎng)為15.51mm，與CK組相比下降了23.3%，此區(qū)域嚴(yán)重影響根部發(fā)育.綜上所述，輻照功率150～275 mW、輻照時(shí)間4～12 s的飛秒激光輻照能促進(jìn)根部發(fā)育，輻照時(shí)間變長(zhǎng)時(shí)促進(jìn)作用減弱，輻照時(shí)間達(dá)到20s后抑制作用越來(lái)越明顯.

圖2 飛秒激光作用下擬南芥根長(zhǎng)的變化

2.3 飛秒激光對(duì)擬南芥鮮重的影響

由圖3可知，藍(lán)綠色區(qū)域表示促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，橘紅色區(qū)域表示抑制幼苗生長(zhǎng).綠色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組別為B2(175 mW,12s)、C2(200 mW,12s)、D1(225 mW,4s)、E1(275 mW,4s)，平均鮮重為1.434mg，與CK組相比提高了59.3%，此區(qū)域?yàn)榇龠M(jìn)幼苗生長(zhǎng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件范圍.藍(lán)色區(qū)域?qū)嶒?yàn)條件集中在輻照功率(150～275 mW)、輻照時(shí)間(4～20s)的范圍，平均鮮重為1.125 mg，與CK組相比提高了25%，此區(qū)域促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的作用減弱.橘色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)條件為輻照功率(150～200 mW)、輻照時(shí)間(30～40 s)，平均鮮重為0.652 mg，與CK組相比下降了27.6%，此區(qū)域表現(xiàn)為抑制作用.紅色區(qū)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)條件為輻照功率(225～275 mW)、輻照時(shí)間(30～40 s)，平均鮮重為0.373 mg，與CK組相比下降了58.6%，此區(qū)域嚴(yán)重影響幼苗生長(zhǎng).綜上所述，輻照功率150～275 mW、輻照時(shí)間4～20 s的飛秒激光輻照能提高幼苗的鮮重，輻照時(shí)間達(dá)到30s后抑制作用明顯.

圖3 飛秒激光作用下擬南芥鮮重的變化

2.4 飛秒激光對(duì)擬南芥葉綠素含量的影響

葉綠素是一種光合色素，它可以反映出葉片的生長(zhǎng)發(fā)育情況.由圖4可知，在輻照功率175 mW的條件下，葉綠素含量隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其葉綠素含量平均值為1.24mg/g，與CK組(1.11mg/g)相比提高了11.7%，其中B2～B4的實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)作用明顯.在輻照功率150、200、225 mW的條件下，葉綠素含量隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，其葉綠素含量平均值依次為1.078、0.957、1.048mg/g，與CK組相比分別下降了2.73%、13.7%、5.39%，此時(shí)表現(xiàn)為較弱的抑制作用.在輻照功率275 mW的條件下，葉綠素含量隨時(shí)間的增加而未發(fā)生明顯改變，其葉綠素含量平均值為0.741 mg/g，與CK組相比降低了33.1%，此時(shí)體現(xiàn)為完全抑制作用.綜上所述，輻照功率175 mW、輻照時(shí)間12～30 s的飛秒激光能顯著提高葉綠素含量，最佳實(shí)驗(yàn)組為B3(175 mW，20 s).

圖4 飛秒激光作用下芥葉綠素含量的變化

2.5 飛秒激光對(duì)擬南芥可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物代謝的主要產(chǎn)物之一，主要影響了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性.由圖5可知，當(dāng)輻照功率(150～225 mW)一定，輻照時(shí)間為0～40 s時(shí)，可溶性糖含量隨輻照時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì).各輻照功率(150～225 mW)下的可溶性糖含量平均值依次為12.06、13.34、12.47、13.15 μg/g，與CK組相比分別上升了13.2、25.1%、16.9%、23.4%.當(dāng)輻照功率150～ 225 mW、輻照時(shí)間12～20 s時(shí)，可溶性糖含量均值為14.38 μg/g，與CK組相比上升了34.9%，此區(qū)域的實(shí)驗(yàn)條件的促進(jìn)作用最明顯.在輻照功率275 mW、輻照時(shí)間0～40s的條件下，隨輻照時(shí)間的增加可溶性糖含量先減少后增加，此時(shí)其平均值為9.9 μg/g，與CK組(10.66μg/g)相比下降了13.9%，抑制作用明顯.綜上所述，輻照功率150～225 mW、輻照時(shí)間12～20 s的飛秒激光能顯著提高可溶性糖含量，最佳實(shí)驗(yàn)組為B3(175 mW，20s).

圖5 飛秒激光作用下擬南芥葉片可溶性糖含量的變化

2.6 飛秒激光對(duì)擬南芥過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶能清除植物體內(nèi)H2O2，具有一定的保護(hù)效應(yīng).由圖6可知，在輻照功率150～275 mW時(shí)，過氧化氫酶活隨輻照時(shí)間的增加均表現(xiàn)為先增加后減少再增加的趨勢(shì)，并且最佳輻照時(shí)間為12s.在輻照功率(150～275 mW)下，酶活均值依次為18.3、17.0、12.8、12.4、15.5U/(g·min)，即輻照功率150～175 mW的飛秒激光能提高過氧化氫酶活性.在輻照功率150～175 mW、輻照時(shí)間4～12 s時(shí)，其活性均值為20.0U/(g·min)，與CK組(16.5U/(g.min))相比提高了21.2%.雖然實(shí)驗(yàn)B2(175 mW，12s)為過氧化氫酶活性最高的實(shí)驗(yàn)組，但從輻照功率的總體趨勢(shì)上看A2(150 mW，12 s)應(yīng)為最佳實(shí)驗(yàn)組.綜上所述，輻照功率150～175 mW、輻照時(shí)間4～12 s的飛秒激光能顯著提高過氧化氫酶活性，其中最佳實(shí)驗(yàn)組為A2(150 mW，12 s).

圖6 飛秒激光作用下擬南芥葉片 過氧化氫酶活性的變化

2.7 飛秒激光對(duì)擬南芥丙二醛含量的影響

丙二醛是植物膜脂過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，能夠反映出植物受傷害的程度.由圖7可知，當(dāng)輻照功率為150 mW、輻照時(shí)間4～40 s時(shí)，隨時(shí)間的增加丙二醛含量先減少后無(wú)明顯變化，且各組丙二醛含量均低于CK組(0.041μg/g)，平均值為0.034μg/g，與CK組相比下降了18.6%，此功率的飛秒激光能提高膜脂的抗氧化能力.當(dāng)輻照功率175～275 mW、輻照時(shí)間4～40 s時(shí)，輻照時(shí)間越長(zhǎng)丙二醛含量越高.其中功率150、175 mW的各組丙二醛含量均低于CK組，此時(shí)其含量平均值依次為0.037、0.04μg/g，與CK組相比分別下降了18.5%和9.7%.綜上所述，輻照功率150～175 mW、輻照時(shí)間4～40 s的飛秒激光能對(duì)擬南芥葉片起到保護(hù)作用，最佳輻照組為B4(175 mW，4s).

圖7 飛秒激光作用下擬南芥葉片丙二醛含量的變化

3 討論

該實(shí)驗(yàn)研究表明，輻照功率150～275 mW、輻照時(shí)間4～20 s的飛秒激光能提高種子發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)及鮮重，促進(jìn)了擬南芥種子的生長(zhǎng)與分化.輻照功率175 mW、輻照時(shí)間12～30 s的飛秒激光能顯著提高葉綠素含量，提高了幼苗對(duì)光能的利用率，利于ATP和有機(jī)物的積累.輻照功率175～225 mW、輻照時(shí)間12～20 s的飛秒激光促進(jìn)了可溶性糖的合成，增強(qiáng)了對(duì)滲透壓的調(diào)控，提高了植物抗逆性.輻照功率150～175 mW、輻照時(shí)間4～12 s的飛秒激光能提高過氧化氫酶的活性，提升了清除過氧化氫的能力，增強(qiáng)了自身的保護(hù)作用.經(jīng)干旱處理后，輻照功率150～175 mW、輻照時(shí)間4～40s的飛秒激光能降低丙二醛含量，防止葉片內(nèi)自由基誘發(fā)膜脂過氧化，對(duì)細(xì)胞膜起保護(hù)作用.綜上所述，在輻照功率175 mW、輻照時(shí)間12s的條件下，飛秒激光不僅能提高擬南芥種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)，還能提高植物的光合作用與抗逆性.

激光生物效應(yīng)可分為熱效應(yīng)、光效應(yīng)、電磁效應(yīng)和壓力效應(yīng)[16].熱效應(yīng)是指生物分子吸收紅外線后使其溫度升高的效應(yīng).而飛秒激光的單脈沖時(shí)間極短，激光沉積時(shí)間短于能量轉(zhuǎn)移時(shí)間，所以排除了激光生物熱效應(yīng)的影響.光效應(yīng)是指生物的分子吸收光子后激發(fā)的光化學(xué)反應(yīng)[17-18].生物組織中的碳鏈和膚鏈分子鍵的維持能量為3.4 MeV[19]，波長(zhǎng)800nm的飛秒激光器光子能量為1.55MeV，若雙光子吸收的能量為3.1MeV仍然不能使生物分子發(fā)生光化學(xué)效應(yīng)，所以排除了激光生物光效應(yīng)的影響.電磁效應(yīng)表現(xiàn)為激光的電磁場(chǎng)與生物組織的相互作用[20]，而電場(chǎng)強(qiáng)度與激光的功率密度相關(guān)，最佳條件的飛秒激光功率密度為9 mW/mm2，無(wú)法干擾生物分子自身的庫(kù)倫場(chǎng)，形成不了激光生物電磁效應(yīng).壓力效應(yīng)是光壓作用生物分子產(chǎn)生的效應(yīng).當(dāng)大量光子長(zhǎng)時(shí)間作用時(shí)，飛秒激光會(huì)在生物分子內(nèi)部形成一個(gè)穩(wěn)定的光壓.光壓計(jì)算公式為P=I(1+R)/c(式中I為光強(qiáng)，R為能量反射率，c為光速)，光壓與激光強(qiáng)度有關(guān)，光子作用時(shí)間與輻照時(shí)間相關(guān)，激光生物機(jī)械效應(yīng)同時(shí)受二者共同作用，而且輻照功率存在最佳值，隨著輻照時(shí)間的增加存在積累效應(yīng)，當(dāng)超過一定的輻照劑量時(shí)產(chǎn)生抑制作用.此理論與該文各項(xiàng)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不謀而合.

綜上可知，輻照條件為功率175 mW、時(shí)間12 s的飛秒激光能促進(jìn)擬南芥種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，飛秒激光對(duì)擬南芥的促進(jìn)作用與光壓有關(guān)，并且存在積累效應(yīng).

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Mester E.The use of the laser beam in therapy[J].Orvosi Hetilap,1966,107(22):1012-1016.

[2] 張巖,胡軍,郭長(zhǎng)虹,等.植物谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào) , 2007,23 (4) :76-79.

[3] 姜曉燕,高麗美,李永峰,等.He-Ne激光對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射擬南芥抗氧化系統(tǒng)的損傷修復(fù)[J].光子學(xué)報(bào),2011,40(5):712-717.

[4] Wu M, Grahn E, Eriksson L A. Strid Computational Evidence for the Role of Arabidopsis thaliana UVR8 as UV-B Photoreceptor and Identification of Its Chromophore Amino Acids[J]. Journal of chemical information and modeling, 2011, 51(6):1287-1295.

[5] Kaiserli E, Jenkins G I. UV-B promotes rapid nuclear translocation of the Arabidopsis UV-B-specific signaling component UVR8 and activates its function in the nucleus[J]. The Plant Cell Online, 2007, 19(8):2662-2673.

[6] 馮光文,成浩,徐輝,等.激光誘變技術(shù)在生物育種中的應(yīng)用[J].激光與光電子學(xué)進(jìn)展,2007,44(5):56-61.

[7] 李海偉,陳云琳,黃笛,等.飛秒激光誘變微生物技術(shù)及其機(jī)理的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2011,30(4):824-829.

[8] 王亞偉,劉瑩,卜敏,等.飛秒激光與生物組織作用原理及其應(yīng)用[J].激光與紅外，2008,38(1)-10.

[9] 劉櫻,劉玫,關(guān)旸.東北龍膽與莕菜種子至種苗發(fā)育過程的研究[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2002,18(5):73-76.

[10]李曉陽(yáng) 陳慧澤 韓榕,等.He-Ne激光處理對(duì)擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)特性的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2012,32(1):131-135.

[12] 侍福梅,王超.紫外線-B輻射引起擬南芥內(nèi)源H2O2增加及細(xì)胞死亡[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(3):231-233.

[13] 謝陽(yáng)姣,何志鵬 ,林偉,等.漢桃樹種子發(fā)芽影響因素研究[J].種子,2012,31(2):108-110.

[14] 蔡永萍.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2014.

[15] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京:高等教育出版社，2000.

[16] 陳懷軍,吳俊林.激光處理植物種子產(chǎn)生的效應(yīng)概述[M].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(3):587-589.

[17] 康錫惠,劉梅清.光化學(xué)原理與應(yīng)用[M].天津大學(xué)出版社,1995.

[18] Kreslavski VD， Shmarev AN， Lyubimov VY，et al.Response of photosynthetic apparatus in Arabidopsis thaliana L. mutant deficient in phytochrome A and B to UV-B[J]. Photosynthetica , 2017:1-9.

[19] 李正佳.激光生物醫(yī)學(xué)工程基礎(chǔ)[M].北京：國(guó)防工業(yè)出版社,2007.

[20] 魏靜霞.生物電磁效應(yīng)及其在睡眠障礙治療中的應(yīng)用[D].河北科技大學(xué),2013.