馬 鑫, 高 卉, 張俊會, 王 平, 薛泉宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.長安大學(xué)地球科學(xué)與資源學(xué)院,陜西西安 710054)

3株原油降解細菌鑒定及其降解和驅(qū)油特性研究

馬 鑫1, 高 卉1, 張俊會1, 王 平2, 薛泉宏1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.長安大學(xué)地球科學(xué)與資源學(xué)院,陜西西安 710054)

篩選可提高原油采收率的細菌,進而考察其降解、發(fā)酵及增油性質(zhì)。以原油為唯一碳源,采用稀釋平板法分離增油菌株;通過觀察原油平板上的菌落生長狀況、發(fā)酵瓶中原油性質(zhì)變化篩選具有增油潛力的菌株;通過菌落與細胞形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析鑒定菌株;利用氣相色譜法、柱層析等方法分析菌株對原油化學(xué)組成的影響;并采用室內(nèi)模擬試驗研究供試菌株發(fā)酵液的驅(qū)油效果。結(jié)果表明:從分離自原油及油污土壤的17株細菌中篩選出3株有增油潛力的細菌,經(jīng)鑒定分別為Dietziacerrcidiphylli(X10)、Micrococcusyunnanensis(X19)及Pseudomonasaeruginosa(X22);3株細菌作用后原油化學(xué)成分產(chǎn)生了顯著變化,X19對瀝青的降解率高達到65.7%,X10對膠質(zhì)、芳香烴的降解分別達到84.4%、32.15%,烷烴類成分均有不同程度的增加;X22可合成糖脂類表面活性物質(zhì);Pseudomonasaeruginosa發(fā)酵液在模擬試驗中的驅(qū)油率較水驅(qū)提高了33.5%,且在低滲及非均質(zhì)模擬介質(zhì)中驅(qū)油效率較高;篩選得到的3株細菌中均有較好的增油潛力,其中Pseudomonasaeruginosa在室內(nèi)模擬試驗中驅(qū)油效果較好,適宜于微生物增油技術(shù)的研究和應(yīng)用。

微生物強化采油; 石油; 細菌; 生物表面活性物質(zhì)

微生物強化采油(MERO)是利用微生物及其代謝產(chǎn)物增產(chǎn)原油的一項綜合性采油技術(shù)[1-2],通過菌體降解與菌體封堵,生物表面活性物質(zhì)、生物聚合物、有機酸及氣體等代謝產(chǎn)物,改變原油流度、巖石表面潤濕性及毛細管阻力效應(yīng)提高原油采收率[3-5]。位于陜甘寧盆地的延長油田還鮮見微生物增油研究[6]。延長油田長2段平均孔隙度13%～14%,平均滲透率(10～13)×10-3μm2,具有較強的非均質(zhì)性,屬低滲低產(chǎn)油田[7-8]。延長油田主要采油區(qū)總采收率約為10%～15%,處于較低水平[9]。筆者以延長油田長2段井油及原油污染土壤為分離源,對分離篩選到的增油細菌進行分類鑒定,通過對原油降解、發(fā)酵液表面活性及室內(nèi)模擬驅(qū)油試驗評價其增油潛力。

1 材料與方法

1.1 材 料

分離源樣品:采自陜北延長油田長2段井油和油井旁油污土壤。

原油濾紙:濾紙剪至培養(yǎng)皿大小,蘸滿原油后,121 ℃滅菌30 min。

分離培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂粉10.0 g,水1 000 mL,121 ℃滅菌30 min。倒皿,待培養(yǎng)基凝固后將滅菌原油濾紙緊貼在培養(yǎng)基表面。

菌種純化及保藏培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[10]。

初篩培養(yǎng)基:KNO35.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,水1 000 mL,pH值中性,瓊脂粉 10.0 g,原油 20.0 g,121 ℃滅菌30 min,充分搖勻后倒皿。

復(fù)篩培養(yǎng)基:(NH4)2SO41.0g,NaNO32.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO42.0 g,水1 000 mL,pH值中性,原油 20.0 g,121 ℃滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米漿(含水率70%)20.0 g,葡萄糖10.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,水 1000 mL,121 ℃滅菌30 min。

苯酚-硫酸顯色劑:3.0 g苯酚和5.0 mL濃硫酸溶于95 mL乙醇。

氣相色譜儀:型號為Trace GC Ultra,Thermo Finnigan公司生產(chǎn)。工作條件:色譜柱為DB-Wax,30 m×0.25 mm×0.25 μm;檢測器為FID氫火焰離子檢測器;柱溫40 ℃,保留2 min,程序升溫,以6 ℃/min的速率升溫到240 ℃,停留8 min;進樣口溫度230 ℃,分流進樣,分流比20∶1,進樣量1 μL;載氣N2流速1.0 mL/min,H2流速35 mL/min,空氣流速350 mL/min。

1.2 試驗方法

1.2.1 增油細菌分離純化

稱10.0 g含原油污泥加入裝90 mL無菌水(含30粒玻璃珠)的250 mL三角瓶中,手搖振蕩15 min,即得1×10-1濃度菌懸液,靜置30 s,吸取1 mL上部懸液加入到9 mL無菌水中,連續(xù)稀釋至1×10-3;吸取0.05 mL菌懸液采用涂布法將3個濃度的菌懸液分別接入分離培養(yǎng)基表面的滅菌原油濾紙上。37 ℃,培養(yǎng)7 d,挑取直徑較大且有透明斑的單菌落,采用稀釋平皿法純化,即獲得能在原油污染土壤中生長的細菌;取0.1 mL原油直接涂布在分離培養(yǎng)基表面的滅菌原油濾紙上,后續(xù)步驟同原油污泥,即獲得能在原油中生長、具有驅(qū)油潛力的細菌。純化菌株均保存于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面。

1.2.2 菌株初篩與復(fù)篩

將分離純化后的菌株接入到初篩培養(yǎng)基中,觀察在初篩培養(yǎng)基上的生長狀況;選取生長較好的菌株接入復(fù)篩培養(yǎng)基中,37 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng)10 d,測定乳化液穩(wěn)定時間、原油在瓶壁上的附著性、培養(yǎng)液水相表面活性及pH。其中乳化液穩(wěn)定時間指將油水共存的發(fā)酵液充分搖勻后靜置并開始計時,記錄至油、水清晰分層所需時間,用該值表示原油的乳化程度;原油在瓶壁上的附著性通過觀察原油在瓶壁上的附著量及瓶壁的透明度確定;水相表面活性采用排油圈法[6]測定。綜合以上結(jié)果選取生長快、對原油乳化能力強、原油在瓶壁上附著少及培養(yǎng)液水相表面活性強的菌株進行后續(xù)試驗。

1.2.3 菌株鑒定

菌株形態(tài)特征及生理生化特性:根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]和《伯杰細菌鑒定手冊》[12]對篩選到的菌株進行菌落、細胞形態(tài)特征觀察及生理生化特性測定。

16S rDNA序列分析:采用苯酚-氯仿抽提法提取細菌總DNA,然后以基因組總DNA為模板,選用細菌通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′和1541R: 5′-AAGGAGGTGATCC AGCCG-CA-3′擴增其16S rDNA基因。PCR反應(yīng)體系為10×Buffer 5 μL,dNTPs 4.0 μL,正向引物與反向引物各2 μL,Taq酶(5 μL/L)0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán);最后72 ℃繼續(xù)延伸10 min。擴增產(chǎn)物用8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送南京金斯瑞公司測序。測序結(jié)果通過Blast程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行相似度搜索,找出同源性較高的菌株序列,采用Mega 4.0.2軟件中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株對原油的降解

原油中烴、膠質(zhì)及瀝青含量測定(氧化鋁柱層析法[13])。

(1)樣品制備:接種環(huán)挑取3環(huán)菌體,接種到裝有200 mL復(fù)篩培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,以不接菌的處理為對照CK,37 ℃,120 r/min振蕩培養(yǎng)10 d,靜置至油水分層抽取上層原油即可。

(2)測定方法:中性Al2O3、無水Na2SO4在120 ℃下活化2 h,干燥備用;脫脂棉用氯仿抽提至不發(fā)熒光后晾干備用。層析玻璃柱長30 cm,內(nèi)徑1 cm,采用勻漿填裝法裝柱:稱取0.80 g脫脂棉塞入層析柱底部,稱取25.00 g干燥Al2O3,加正己烷混勻后,邊振動邊填入柱中,在柱上端Al2O3表面覆蓋1.00 g無水Na2SO4以防流動相沖壞柱床。層析柱垂直固定后,下方置一接受瓶。稱取2.000 g步驟(1) 制備的經(jīng)細菌降解處理的原油樣品,加入40 mL正己烷搖勻使其充分溶解,以每次5 mL上柱,上柱期間分3次用5 mL正己烷沖洗層析柱,上柱結(jié)束后再用5 mL正己烷沖洗3次,此段份即為烷烴;待烷烴段不再有液體析出時更換接受瓶,用60 mL正己烷/二氯甲烷(3/1,體積比)混合液沖洗至基本無色,此段份即為芳香烴;待芳香烴段不再有液體析出時,更換接受瓶,40 mL無水乙醇沖洗至基本無色,此段份為膠質(zhì);剩余在層析柱內(nèi)的組分在40 ℃烘干后稱重,則作為瀝青質(zhì)及未知組分。各組分70 ℃水浴蒸發(fā)至恒重,稱取殘留量并計算出各組分的含量,單位為g/100g。測定重復(fù)3次。

原油中部分可氣化烴相對含量測定(氣相色譜法)。

(1)樣品制備:接種環(huán)挑取3環(huán)菌體接種到含100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,以不接菌的處理為對照CK,37 ℃,120 r/min振蕩培養(yǎng)10 d,加入40 mL正己烷搖勻萃取,抽取5 mL有機相備用。

(2)測定:采用氣相色譜法分析可在230 ℃氣化的烴類。將相同保留時間出現(xiàn)的組分視作同一組分,不同保留時間出現(xiàn)的組分視作不同組分;將各組分的峰面積作為該組分的相對含量。根據(jù)式(1) 計算對照與處理原油中某組分相對含量變化(P):

(1)

式中,Sf及SCK分別為發(fā)酵處理原油中某組分的峰面積及對照樣品中相同組分的峰面積。

1.2.5 發(fā)酵液細菌數(shù)量及表面活性測定

細菌生長曲線與表面活性曲線測定。參考程麗娟等[10]方法,用比濁法測定供試細菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上的生長曲線;用排油圈法測定供試細菌在該培養(yǎng)基上不同時間發(fā)酵液的表面活性,用雷磁PHS-3D型pH計測定發(fā)酵液水相pH值。

表面活性測定。采用排油圈法。取一口徑為20 cm的塑料盆,加水近滿,靜置后在水面中央逐滴加入5滴0#柴油,柴油在水面擴散形成一層油膜,在油膜中心滴入1滴發(fā)酵液,油膜被擠向四周形成一排油圈,直尺測定排油圈的直徑D,以不加發(fā)酵液處理為對照CK。重復(fù)3次。

含表面活性物質(zhì)發(fā)酵液制備。將100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基置于500 mL三角瓶中,滅菌后接入供試菌株,37 ℃、120 r/min培養(yǎng)4 d,定性濾紙過濾除去殘渣,濾液于4 ℃保存,用于模擬驅(qū)油試驗及其表面活性測定與表面活性物質(zhì)定性分析。

面活性物質(zhì)提取以及定性分析[14]。取制備的含表面活性物質(zhì)的發(fā)酵濾液100 mL,8 000 r/min離心5 min除去菌體,收集上清液,用6 mol/L HCl調(diào)pH值至2,出現(xiàn)絮狀沉淀,4 ℃靜置過夜。4 000 r/min離心5 min,倒掉上清液,離心管底部沉淀即為生物表面活性物質(zhì)粗制品。將其進行薄層層析[15](TLC),展開劑為氯仿/甲醇/水(65/15/2,體積比),噴苯酚-硫酸顯色劑,110 ℃顯色10 min,若顯棕色,則為糖脂類生物表面活性物質(zhì)。

1.2.6 發(fā)酵液模擬驅(qū)油

裝置如圖1所示,模擬裝置包括長L為200 mm、內(nèi)徑d為15 mm標有刻度的玻璃管,收集瓶,真空泵及負壓瓶。玻璃管內(nèi)填充不同粒徑砂粒,形成不同孔徑的微孔砂芯柱,以模擬低滲、高滲及非均質(zhì)油層。

圖1 驅(qū)油裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of oil displacement model

微孔砂芯柱準備。河砂用自來水反復(fù)沖洗至水清澈時烘干,篩分得到粒徑為0.15～0.25 mm細砂及0.25～1.00 mm粗砂;向玻璃管中填充細砂、粗砂制備微孔砂芯柱,分別模擬低滲、高滲油層。裝柱時每次填砂厚度1 cm,用玻璃棒夯實后繼續(xù)填充,直至砂芯柱高度達14 cm。用粗、細砂相間填充法制備微孔砂芯柱,以模擬非均質(zhì)油層;粗、細砂填充厚度均為3.5 cm,玻璃棒夯實方法同均質(zhì)砂芯柱。填充完畢稱重法測得填入的砂重ms;用原油充填砂芯柱砂?？障吨溜柡秃笾糜?5 ℃老化24 h。微孔砂芯柱外加泡沫保溫層,以維持驅(qū)油過程在37 ℃恒溫條件下進行。

用微孔砂芯柱模擬含油地層,砂芯柱用原油飽和后進行水驅(qū),以水驅(qū)之后砂柱內(nèi)保留的附著態(tài)原油代表難采出原油。以含表面活性物質(zhì)的細菌發(fā)酵液為驅(qū)油劑,通過真空泵使微孔砂芯柱下端負壓瓶內(nèi)形成負壓,使驅(qū)油劑與微孔砂芯柱砂粒表面的附著態(tài)原油作用,隨同驅(qū)油劑流入收集瓶。

驅(qū)油過程如下:①加熱水驅(qū)用水、發(fā)酵液及微孔砂芯柱至37 ℃;②水驅(qū):在用原油飽和的砂芯柱上端加10 mL自來水,柱下端接負壓瓶內(nèi)的收集瓶,保持負壓瓶與砂芯柱間密封,啟動真空泵形成0.03 MPa負壓,使水通過微孔砂柱時,驅(qū)除砂芯柱砂粒間微孔中多余原油,收集驅(qū)出的原油m1;③發(fā)酵液驅(qū):在水驅(qū)后的砂芯柱上端加10 mL制備的含表面活性物質(zhì)的發(fā)酵液,更換負壓瓶中的收集瓶,再次啟動真空泵形成0.03 MPa負壓,使發(fā)酵液通過砂芯柱,驅(qū)除砂芯柱砂粒表面附著原油,收集驅(qū)出油m2。

驅(qū)出原油置冰箱4 ℃靜置分層,收集已成固態(tài)的原油稱重,分別計算砂芯柱附著原油量及驅(qū)油率。以上試驗均重復(fù)3次。

(2)

mR=mA-m2,

(3)

w=m2/mA.

(4)

式中,ms、m1及mA分別為測得的驅(qū)油管中砂質(zhì)量、水驅(qū)時的產(chǎn)油質(zhì)量及計算得到的附著油質(zhì)量;ρo=0.80 g/mL和ρs=2.53 g/cm3,分別為實際測定的原油密度和砂柱密度;d、h分別為玻璃管內(nèi)徑1.5 cm、砂柱高度14 cm;m2、mR分別為驅(qū)油處理產(chǎn)油量、計算得到的驅(qū)油處理后的殘留油量;w為計算得到的驅(qū)油率。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株鑒定

從供試原油及井口油污土壤中共分離到17株細菌,其中有3株細菌在分離篩選培養(yǎng)基上生長良好(圖2)。

圖2 3株供試細菌在初篩培養(yǎng)基的菌落Fig.2 Colony of bacteria tested in medium of first screening

根據(jù)圖3中菌落形態(tài)、圖4中細胞形態(tài)特征、表1中生理生化特性,依據(jù)16S rDNA序列分析得到供試菌株的系統(tǒng)進化樹圖5與表2結(jié)果,3株入選細菌X10、X19 及X22分別為Dietziacerrcidiphylli(D.cerrcidiphylli)、Micrococcusyunnanensis(Mic.yunnanensis)及Pseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa),3株菌與其對應(yīng)參比菌株的同源性分別為99.93%、99.71%和99.93%。

圖3 3株供試細菌的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of bacteria strains tested

圖4 3株供試細菌的細胞形態(tài)Fig.4 Cell morphology of bacteria strains tested

表1 3株細菌形態(tài)特征及生理生化特征Table 1 Morphological and physiological-biochemical characters of bacteria strains tested

注:“+”為陽性;“-”為陰性。

圖5 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的3株供試細菌的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree showing relationships among reference strains and tested strains based on 16S rDNA

表2 3株供試細菌的16S rDNA序列的Blast結(jié)果Table 2 Blast result of tested bacteria strains 16S rDNA

表2 3株供試細菌的16S rDNA序列的Blast結(jié)果Table 2 Blast result of tested bacteria strains 16S rDNA

待鑒定菌株編號NCBI登錄號參比菌株名稱NCBI登錄號同源性/%鑒定結(jié)果X10KJ782614DietziacercidiphylliEU37584699.93D.cercidiphylliX19KJ782615MicrococcusyunnanmensisFJ21435599.71Mic.yunnanmensisX22KJ782616PseudomonasaeruginosaZ7665199.93P.aeruginosa

2.2 原油降解特性

2.2.1 原油烴類、膠質(zhì)及瀝青含量

從表3中可見,用3株細菌處理能大幅度降低原油中芳香烴、膠質(zhì)、瀝青及未知組分含量,其中,原油中的芳香烴含量較對照減少17.7%～32.1%(P<0.05);膠質(zhì)含量減少42.2%～84.4%,但僅D.cercidiphylli與對照的差異達到顯著水平(P<0.05);瀝青質(zhì)及其他大分子組分含量降低30.5%～65.7%(P<0.05)。同時使原油中的烷烴類物質(zhì)含量增加2.3%～11.0%,但僅Mic.yunnanensis與對照的差異達到顯著水平(P<0.05)。

表3 3株供試細菌處理原油中烴類、膠質(zhì)及瀝青含量Table 3 Content of hydrocarbon, gums and bitumen in oil after degradation by tested bacteria

注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 原油中230 ℃可氣化烴含量

從圖6、表4可見,與對照相比,3株細菌處理對原油中在230 ℃可氣化烴組分的相對含量有明顯影響。從表4可知,D.cerrcidiphylli和P.aeruginosa處理后23種可氣化烴組分中分別有18種和13種組分的相對含量較對照減少,減少幅度分別為0.4%～12.6%和1.8%～39.1%,平均減少6.3%和17.7%;Mic.yunnanensis處理后原油中23種可氣化烴較對照增加9.7%～52.0%,平均增加35.1%。在測定條件下,其中保留時間為19.788 min的烴組分在D.cercidiphylli處理中未檢出,在Mic.yunnanmensis及P.aeruginosa處理中較對照分別提高35.4%及8.1%;而Mic.yunnanmensis處理中檢出的新增組分保留時間為23.413 min,但該組分在本測定條件下在對照及其余細菌處理中均未檢出。

圖6 3株細菌處理原油組分氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of oil after degradation by tested bacteria

表4 3株供試細菌處理原油中23種可氣化組分相對含量Table 4 Relative content of vaporizable component in oil after degradation by tested bacteria

2.3 驅(qū)油特性

2.3.1 原油乳化性及附著性

由表5及圖7可知,供試細菌均能提高原油在油水共存體系中的乳化性。其中,Mic.yunnanmensis及P.aeruginosa處理的乳化層穩(wěn)定時間較對照分別增加809.6%及1 179.5%;均能有效降低原油在瓶壁上的附著性。P.aeruginosa、D.cercidiphylli的排油圈直徑分別達37、24 mm,較對照分別提高270.0%、140.0%,即P.aeruginosa合成的表面活性物質(zhì)較多或活性較強;D.cercidiphylli次之,Mic.yunnanmensis與對照差異不大,推測該菌不產(chǎn)表面活性物質(zhì)。

表5 3株細菌的乳化性、表面活性及其處理原油的附著性Table 5 Emulsification, surface activity and adhesive property for bacteria strains tested

注:附著性中“+++”、“++”、“+”及“-”分別表示瓶壁附著油量大量、少量、輕微及幾乎無黏壁。

圖7 供試細菌對原油附著性及乳化性影響Fig.7 Effect of tested bacteria on adhesion of oil

2.3.2P.aeruginosa發(fā)酵液的表面活性及pH值

從表5及圖7可知,在供試3株細菌中,P.aeruginosa的排油圈直徑最大,乳化液穩(wěn)定時間最長,處理后原油在瓶壁附著最少。從圖8中可見,P.aeruginosa培養(yǎng)8 h開始進入對數(shù)生長期,至24 h進入生長平衡期;從發(fā)酵液排油圈直徑變化曲線可知,0～48 h內(nèi),P.aeruginosa繁殖與表面活性物質(zhì)合成基本同步。從圖8還可見,0～12 h,pH值上升較快,達到8.48,而排油圈直徑增加緩慢,變化在4.0～6.7 mm之間;12～16 h pH值快速下降,而排油圈直徑由6.7 mm升高到27.1 mm;16～48 h,pH值維持在7.77～7.92,而排油圈直徑則由27.1 mm緩慢增加到39.7 mm,即發(fā)酵液pH值與表面活性無關(guān)。由TLC分析結(jié)果可知,P.aeruginosa產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)用苯酚-硫酸顯色劑顯色時呈棕色,Rf=0.81。結(jié)合已有文獻[16-17]推知,P.aeruginosa產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)為糖脂類。

圖8 P.aeruginosa生長曲線及發(fā)酵液表面活性、pH值變化曲線Fig.8 Growth curve, surface activity and pH of P.aeruginosa in liquid fermentation

2.3.3 P.aeruginosa發(fā)酵液的驅(qū)油作用

從表6可知,P.aeruginosa發(fā)酵液的驅(qū)油率為20.14%,較水驅(qū)增加33.5%;驅(qū)油量較水驅(qū)提高35.1%。

表6 P.aeruginosa發(fā)酵液的驅(qū)油率Table 6 Oil displacement efficiency of P.aeruginosa fermentation liquid

注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

從圖9、表7中看出,在模擬不同滲透性地層環(huán)境的驅(qū)油試驗中,P.aeruginosa發(fā)酵液的驅(qū)油率存在差異:該菌發(fā)酵液在低滲、非均質(zhì)模擬地層的驅(qū)油率分別為20.14%、20.62%,顯著高于高滲地層的16.35%(P<0.05)。

注:圖中同一組內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表7 P.aeruginosa發(fā)酵液對不同模擬地層的驅(qū)油率Table 7 Oil displacement efficiency of P.aeruginosa fermentation liquid in different oil layer

注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖9 P.aeruginosa發(fā)酵液對不同模擬地層的驅(qū)油率Fig.9 Oil displacement efficiency of P.aeruginosa fermentation liquid in different oil layer

3 討 論

經(jīng)鑒定,分離篩選獲得的細菌Dietziacerrcidiphylli由李杰[18]等從云南連香樹根系表面最先分離并報道。該屬由 Rainey等[19]建立,共有13個種。已發(fā)現(xiàn)該屬某些菌種具有降解石油污染物[20-21]、反硝化[22]及產(chǎn)表面活性物質(zhì)[23]的能力。Mic.yunnanensis被趙國真等[24]從云南酸棗根系表面分離并報道，已在海洋沉積物[25-26]及石油污染土壤[27]中發(fā)現(xiàn)該菌。但目前未見上述2株細菌的驅(qū)油研究報道。

上述2株細菌對膠質(zhì)、瀝青質(zhì)有良好的降解作用,有望用于提高稠油采收率研究。P.aeruginosa由Schroeter[28]發(fā)現(xiàn),關(guān)于該菌的研究主要集中于石油污染物降解[29-30]、表面活性物質(zhì)性質(zhì)[31-32]及培養(yǎng)基優(yōu)化[33]。本文中研究了P.aeruginosa發(fā)酵液的表面活性、對原油膠質(zhì)、瀝青等成分的影響及其在不同模擬地層上的驅(qū)油效果,為該菌在礦場上的驅(qū)油潛力評價提供了新的試驗依據(jù)。

膠質(zhì)的基本組成單元為多個芳香環(huán)系為核心的稠環(huán)結(jié)構(gòu)。瀝青質(zhì)是膠質(zhì)的縮合物,其基本結(jié)構(gòu)是以多個稠環(huán)結(jié)構(gòu)為核心,周圍連接的若干芳香環(huán)和環(huán)烷環(huán)上都帶有若干個長度不一的正構(gòu)烷基側(cè)鏈復(fù)合結(jié)構(gòu),其中還含有各種含硫、氮、氧基團[34]。膠質(zhì)相對分子質(zhì)量較低,瀝青質(zhì)具有較高相對分子質(zhì)量。

3株細菌處理后,原油中的膠質(zhì)、瀝青質(zhì)及芳香烴含量大幅度下降,表明供試細菌可分泌能打開稠環(huán)化合物中芳香環(huán)系、環(huán)烷環(huán)系等單體之間化學(xué)鍵的酶類,可將瀝青質(zhì)降解為膠質(zhì),然后逐級降解為芳香烴、烷烴及最終的CO2和水。鄭承綱[35]和郭萬奎等[36]的研究也得到類似結(jié)果。

在3株細菌處理后的原油中,在230 ℃可氣化烴與對照也存在明顯差異。23種組分明顯改變:D.cerrcidiphylli和P.aeruginosa處理后,在23種可氣化烴組分中分別有18種和13種組分的含量分別較對照分別減少0.4%～12.6%和1.8%～39.1%。可將這些減少的組分視為菌體生長代謝中已以碳源能源的形式被細胞利用;Mic.yunnanensis處理原油中23種可氣化組分相對含量較對照增加9.7%～52.0%,可將這些增加的組分視為原油中膠質(zhì)、瀝青質(zhì)等大分子的降解產(chǎn)物。該菌處理原油中可氣化組分增加的現(xiàn)象可能與其對瀝青質(zhì)等大分子的降解能力最強(較對照減少65.7%)有關(guān)。該菌處理后,原油中烷烴增幅最大(較對照增加11.0%,P<0.05),形成的可氣化組分含量較高。由此可知,即使細菌生長繁殖中以碳源能源形式消耗了較多可氣化烴類,但殘留的可氣化烴類含量仍高于對照。

Mic.yunnanensis及P.aeruginosa作用后原油的附著性明顯降低。其主要原因有二:一是細菌生長繁殖過程中產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)等代謝產(chǎn)物改變了瓶壁表面潤濕性;表面活性物質(zhì)的乳化作用形成了O/W型乳化液。二者均可降低原油在瓶壁上的附著性。P.aeruginosa發(fā)酵液排油圈直徑最大,支持了該推論。二是細菌對原油化學(xué)成分的改變。如Mic.yunnanensis及P.aeruginosa處理后膠質(zhì)含量較對照分別減少了42.2%及45.1%,瀝青質(zhì)等組分含量較對照分別減少了65.7%及43.4%。重質(zhì)組分含量大幅度減少,增加了原油流動性并降低了其附著性。

Mic.yunnanensis及P.aeruginosa作用后原油的乳化性大幅度提高。乳化效果取決于油的組成、水及分散體系中表面活性物質(zhì)性質(zhì)。本研究中未發(fā)現(xiàn)Mic.yunnanensis產(chǎn)表面活性物質(zhì),但該菌具有較強的乳化效果,可能與其對原油較強的分解作用、原油組成發(fā)生較大改變有關(guān)。另外,該菌處理后原油中23種可氣化烴較對照平均增加35.0%,膠質(zhì)、瀝青質(zhì)分別減少42.2%、65.7%,導(dǎo)致原油組成改變,引起乳化性大幅度改善。D.cerrcidiphylli處理乳化性較差,其主要原因與該菌僅產(chǎn)生少量表面活性物質(zhì)有關(guān),其次,也可能與原油中膠質(zhì)大幅度減少(較對照減少84.4%)有關(guān)，因為原油中的膠質(zhì)也有乳化作用[37]。P.aeruginosa合成的表面活性物質(zhì)的排油圈直徑最大,其乳化作用最強。

P.aeruginosa在液體發(fā)酵中合成的表面活性物質(zhì)為糖脂;該菌在細菌培養(yǎng)基中的生長曲線和表面活性曲線吻合,細胞生長繁殖與表面活性物質(zhì)合成基本同步。

P.aeruginosa發(fā)酵液具有良好的驅(qū)油效果。在模擬的低滲地層處理中,其驅(qū)油率較水驅(qū)提高33.5%;對低滲、非均質(zhì)模擬地層的驅(qū)油率高于模擬的高滲地層。其原因在于本研究進行驅(qū)油試驗時加入發(fā)酵液后直接啟動真空泵形成負壓,發(fā)酵液通過微孔砂芯柱時將砂粒上附著的原油驅(qū)出,發(fā)酵液與砂粒上附著的原油作用時間極短,其中的表面活性物質(zhì)等組分與原油無充足的作用時間,導(dǎo)致驅(qū)油效果可能未達到最佳,也導(dǎo)致低滲、非均質(zhì)模擬地層驅(qū)油率高于高滲地層的反?，F(xiàn)象出現(xiàn)。在低滲、非均質(zhì)模擬地層試驗中,發(fā)酵液流速慢,發(fā)酵液與原油接觸時間較長,其中的表面活性物質(zhì)等成分與原油作用較充分;在模擬高滲地層中,砂粒間空隙度大,發(fā)酵液流速快,發(fā)酵液與原油接觸時間短、表面活性物質(zhì)與原油作用不充分。即上述反?，F(xiàn)象出現(xiàn)的根本原因在于發(fā)酵液與原油的作用時間。如果用發(fā)酵液充滿微孔砂芯柱空隙,使其與砂粒表面的原油充分接觸并在模擬油藏溫度下作用較長時間,推測驅(qū)油率將會更高。

篩選得到的3株細菌均能明顯改變原油的理化性質(zhì),具有較高的驅(qū)油潛力。其中P.aeruginosa產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)對原油的乳化及附著性影響大,具有較強的實際增油潛力;Mic.yunnanensis對原油中膠質(zhì)、瀝青等成分的降解能力強,在提高稠油采收率及石油污染物降解方面的應(yīng)用價值可能更大。

4 結(jié)束語

從陜北延長油田井油以及原油污染土壤中篩選出3株具有較好驅(qū)油潛力的細菌。結(jié)合形態(tài)與生理生化特征及16S rDNA序列分析對其進行鑒定,3株細菌分別為D.cercidiphylli,Mic.yunnanmensis及P.aeruginosa。其中Mic.yunnanmensis對原油的乳化性、附著性及原油中膠質(zhì)與瀝青降解作用強;P.aeruginosa能產(chǎn)生糖脂類生物表面活性物質(zhì),在模擬驅(qū)油試驗中,對低滲、非均質(zhì)模擬地層的驅(qū)油率較高,可用于延長低滲油田的微生物增油技術(shù)研究與應(yīng)用

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(編輯 劉為清)

Identification of 3 strains of crude oil degradation bacteria and its characteristics of degradation and oil-displacement

MA Xin1, GAO Hui1, ZHANG Junhui1, WANG Ping2, XUE Quanhong1

(1.CollegeofNaturalResourceandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China; 2.CollegeofEarthScienceandResources,ChanganUniversity,Xian710054,China)

The bacteria for microbial enhanced oil recovery (MEOR) were screened, and then the characteristics of degradation, fermentation and oil-displacement of the bacteria were investigated in this study. One crude oil as the sole carbon source was used to isolate the crude oil degrading strains by improved dilution-plate method. The bacteria strains with MEOR potential were screened through observing the change of bacteria colony growth in the plates and crude oil properties in fermentation flask. Then the strains were identified through the colony and cell morphology, physiological-biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis. Also, the influences of strains on the chemical composition of crude oil were analyzed by using the gas chromatography and alumina column chromatography. Meanwhile, the oil displacement efficiency of the fermentation broth after bacteria fermentation was studied using the indoor simulation experiment. It is found that 3 strains with enhanced oil recovery potential of the 17 bacteria strains, which were isolated from the crude oil and oily soil, were screened for the follow-up tests, which were identified asDietziacerrcidiphylli(X10),Micrococcusyunnanensis(X19) andPseudomonasaeruginosa(X22), respectively. The 3 strains of bacteria significantly change the chemical composition of crude oil. The asphaltene degradation rate of X19 reaches as high as 65.7%. The degradation of resin and aromatic hydrocarbon of X10 reaches 84.4% and 32.15%, respectively. And the saturated hydrocarbon of X10, X19 and X22 is increased at different levels. It is also found that glycolipid surfactant could be produced by X22. The fermentation broth of X22 shows that its oil replacement efficiency is 33.5% higher than water in the indoor simulation experiment, and the oil replacement efficiency is high in the low permeability or heterogeneous simulation medium. It is concluded that the 3 strains of bacteria have good potential of oil replacement, especiallyPseudomonasaeruginosawith the excellent performance in the indoor simulation experiment, which is good for the study and application of MEOR.

microbial enhanced oil recovery (MEOR); petroleum; bacteria; bio-surfactant

2016-11-03

國家科技支撐計劃項目(2012BAD14B11)；陜西博秦生物工程有限公司微生物增油項目

馬鑫(1988-)，男，博士研究生，研究方向為微生物采油。E-mail: maxin4561@163.com。

薛泉宏(1957-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為微生物生態(tài)與資源利用。E-mail: xuequanhong@163.com。

1673-5005(2017)02-0163-12

10.3969/j.issn.1673-5005.2017.02.020

Q 939.97; TE 357.9

A

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