王鵬飛++王月華++胡子瀅++趙傳志++陳萬鈞++王詠梅

摘要：花生是我國重要的經(jīng)濟作物，野生花生（Arachis duranensis）有著許多栽培種花生尚缺乏的性狀，是栽培種花生品種改良不可缺少的優(yōu)異種質(zhì)源或基因源。植物中，WRKY基因與抗病密切相關(guān)。本試驗鑒定并克隆了野生花生AdWRKY37基因，并對其基因及蛋白序列進行了生物信息學分析。結(jié)果顯示，AdWRKY37含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域；順式調(diào)控元件分析顯示，AdWRKY37啟動子含有水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic，JA）誘導元件。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，野生花生AdWRKY37基因在受到青枯病菌液脅迫誘導后表達量升高，且經(jīng)過水楊酸與茉莉酸處理后表達量也顯著上升。以上結(jié)果說明野生花生AdWRKY37基因可能與青枯病耐受相關(guān)。

關(guān)鍵詞：WRKY；野生花生；青枯病；水楊酸；茉莉酸

中圖分類號：S565.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）06-0001-06

AbstractPeanut （Arachis hypogaea L.） is one of the most important economic crops in China. Wild peanuts have many good traits which are lacking in cultivated peanut varieties. Wild peanuts are indispensable germplasm resources as well as genetic resources for improving cultivated peanut varieties. It has been demonstrated that WRKY family transcription factors are involved in various disease resistance in plant. In our study， AdWRKY37， which belongs to WRKY family， was cloned and identified from wild peanut. Furthermore， bioinformatics approach was performed to analyze its gene and protein sequences. The results showed that AdWRKY37 protein contained NBS-LRR domain. Besides， salicylic acid（SA）- and jasmonic acid （JA）-induced elements were also identified in the promoter sequence of AdWRKY37.The expression analysis using qRT-PCR method revealed that the gene expression amount of AdWRKY37 obviously increased under the induction of Ralstonia solanacearum as well as SA and JA treatments. All the results indicated that AdWRKY37 in wild peanuts might participate in resisting to Ralstonia solanacearum.

KeywordsWRKY； Wild peanut； Ralstonia solanacearum； Salicylic acid； Jasmonic acid

花生是我國重要的經(jīng)濟作物，是榨油、食品加工、化工等領(lǐng)域的重要原料。我國花生不僅種植面積廣，產(chǎn)量也久居高位，為經(jīng)濟發(fā)展作出巨大貢獻。然而很多病害如青枯病、葉斑病、銹病、莖腐病、根腐病等對花生種植業(yè)影響巨大并且危害日趨嚴重，已經(jīng)成為限制我國花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[2]。與栽培種花生不同，野生花生在長期的自然選擇過程中積累了許多優(yōu)良的抗病性狀及抗病基因，抗病能力強。因此，可以對野生種花生進行深入研究，挖掘其優(yōu)良抗病基因，并通過雜交、轉(zhuǎn)基因等手段改良栽培種的抗病性[2]。

目前已知植物中的抗病基因根據(jù)其保守序列不同可被分為5類：NBS-LRR（核苷酸結(jié)合位點-亮氨酸重復區(qū)蛋白）型、eLRR-TM（胞外亮氨酸重復區(qū)-跨膜區(qū)域蛋白）型、eLRR-TM-pkinase（胞外富亮氨酸重復區(qū)-跨膜區(qū)域-激酶）型、STK（絲氨酸/蘇氨酸激酶）型和其他型[3，4]。其中，NBS-LRR類是植物體內(nèi)主要的抗病基因。NBS-LRR基因編碼的蛋白為核苷酸結(jié)合蛋白與富亮氨酸受體蛋白，這種蛋白目前被證實與植物抗病相關(guān)[4]。NBS-LRR蛋白含有一個NBS（核苷酸結(jié)合位點）結(jié)構(gòu)域和一個LRR（亮氨酸重復區(qū)）結(jié)構(gòu)域[5]。NBS-LRR蛋白家族中，NBS結(jié)構(gòu)域相對保守，而LRR多樣性較高，也是識別不同病原體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)多樣性與病原菌的多樣性有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NBS-LRR基因按其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)可分為TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR兩類[7]。

水楊酸和茉莉酸是植物中重要的信號分子，與植物響應(yīng)病原菌入侵和抗病密切相關(guān)。水楊酸參與植物對病原菌入侵的響應(yīng)，進而誘發(fā)植物的系統(tǒng)獲得性抗病性（SAR）[8，9]。而茉莉酸可參與植物對病原菌與昆蟲入侵的響應(yīng)，進而引發(fā)植物的誘導系統(tǒng)性抗病性（ISR）[9，10]。研究表明，當植物遭到病原菌入侵后，體內(nèi)的水楊酸和茉莉酸等信號分子將引起一系列的信號轉(zhuǎn)導，從而激活抗病相關(guān)基因的表達[9，10]。

研究證明，很多WRKY家族基因參與植物的抗病、抗逆等生理活動，對植物體抵抗生物脅迫與非生物脅迫具有重要作用[11]。擬南芥中的RRS1基因即為WRKY家族中的一員，其還含有NBS和LRR結(jié)構(gòu)域，在擬南芥的抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12]。WRKY蛋白含有至少60個氨基酸的高度保守結(jié)構(gòu)域，該家族的每個成員在WRKY結(jié)構(gòu)域的N-端都有一段WRKYGQK基序，因而被稱為WRKY蛋白。WRKY蛋白家族是一種轉(zhuǎn)錄因子家族，其中每個成員都可與啟動子上的W-box順式調(diào)控元件特異結(jié)合，影響基因的表達[13]。每個WRKY家族成員都含有一個或兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，在靠近WRKY結(jié)構(gòu)域的位置含有鋅指結(jié)構(gòu)。按含有WRKY結(jié)構(gòu)域的個數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)，可將WRKY家族分為三大組：第一組含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2-H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）鋅指結(jié)構(gòu)，第二組含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2-H2 （C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）鋅指結(jié)構(gòu)，第三組含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2-HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）鋅指結(jié)構(gòu)[14，15]。

野生花生（Arachis duranensis）是栽培種花生的祖先之一。本試驗擬從野生花生中克隆出WRKY家族成員AdWRKY37基因，并利用生物信息學方法分析其序列結(jié)構(gòu)特征，并通過熒光定量PCR檢測AdWRKY37基因在受到青枯病脅迫、茉莉酸和水楊酸處理后的表達變化情況，以研究其在花生抗病過程中的作用。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

試驗材料：野生花生（Arachis duranensis）的帶葉片枝條、青枯病原菌。

試劑：pMD18-T載體、DH5α大腸桿菌感受態(tài)、水楊酸、茉莉酸，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，Plasmid Mini KitⅠ購自O(shè)MEGA BIO-TEK公司，T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶購自Fermentas 公司，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自羅氏試劑公司，LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2試驗方法

1.2.1野生花生處理將野生花生枝條分別插入青枯病菌液、水楊酸（0.1 mmol/L） 以及茉莉酸 （0.1 mmol/L） 溶液中進行處理。分別取青枯病菌液處理6、12、24 h，水楊酸及茉莉酸處理12、24 h的野生花生枝條葉片，液氮速凍，-80°C保存。以不做任何處理的花生葉片為對照。

1.2.2總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用CTAB法提取樣品總RNA。在液氮中充分研磨樣本，將研好的組織迅速轉(zhuǎn)移至含有700 μL預熱（65℃）的CTAB提取液的EP管中，立即劇烈渦旋振蕩30 s，混勻；65℃水浴2～5 min，期間劇烈渦旋振蕩3～5次，稍微冷卻后加入等體積的氯仿/水飽和酚渦旋振蕩1 min，混勻，4℃、12 000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液至一新的EP管中，加入等體積的氯仿渦旋振蕩1 min，混勻，4℃、12 000 r/min離心15 min；將上清轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入等體積異丙醇，4℃過夜沉淀；4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清。用75%乙醇洗沉淀，晾干，加30～50 μL DEPC-H2O溶解沉淀。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.3AdWRKY37基因cDNA全長序列的克隆從野生花生數(shù)據(jù)庫（https：//peanutbase.org/）中通過比對鑒定得到一個WRKY基因，命名為AdWRKY37。根據(jù)該基因序列設(shè)計引物：AdWRKY37F：5′-CTTGTTGCTTGGACGTTTCA-3′；AdWRKY37R：5′-GAATCTGGAGGACCGAATTATAGTA-3′。PCR反應(yīng)體系（40 μL）：2 μL的cDNA模板，5 U/μL Pfu高保真DNA聚合酶0.4 μL，5×Buffer 8 μL， 2.5 mmol/L dNTP 3.2 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 24.4 μL。 PCR反應(yīng)程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，33個循環(huán)；72℃后延伸7 min；保存溫度為4℃。

1.2.4AdWRKY37基因啟動子分析根據(jù)野生花生A基因組序列，鑒定得出AdWRKY37基因的啟動子序列（起始密碼子上游2 000 bp），通過在線軟件PlantCARE對其啟動子順式元件進行分析。

1.2.5AdWRKY37蛋白分析利用在線軟件ExPASy對AdWRKY37基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析，SubLoc對其亞細胞定位進行分析，SignalP判斷其是否含有信號肽；通過Pfam在線軟件對其所含結(jié)構(gòu)域進行預測，SWISS-MODEL對其蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測。

1.2.6系統(tǒng)發(fā)育分析利用MEGA 6軟件將NCBI中搜索到的水稻、大豆、擬南芥等物種中的WRKY蛋白序列構(gòu)建進化樹。表1顯示了各物種WRKY的信息。

1.2.7AdWRKY37基因的表達分析利用qRT-PCR方法檢測花生葉片經(jīng)青枯病脅迫6、12、24 h及水楊酸和茉莉酸處理12、24 h時AdWRKY37基因的表達量。以花生Actin基因為內(nèi)參，AdWRKY37基因的引物為AdWRKY37qF： 5′-TTATTGCTTCTCCATCTC-3′、 AdWRKY37qR：5′-TTGATTACCGTTAGTTCTT-3′。采用FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）試劑盒，按說明書操作。利用ABI 7500實時定量PCR儀進行反應(yīng)，兩步法反應(yīng)程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火及延伸30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)CT值用2-△△CT法分析AdWRKY37基因的表達量。

2結(jié)果與分析

2.1AdWRKY37基因克隆及啟動子分析

從野生花生數(shù)據(jù)庫（https：//peanutbase.org/）中鑒定得到一個WRKY基因（ID：Aradu.HD2AV；基因組位置：chr10：6，533，508-6，537，329 ），經(jīng)克隆得到長度為3 477 bp的序列，將其命名為AdWRKY37基因。取該基因起始密碼子上游2 000 bp的啟動子序列，利用在線軟件PlantCARE進行分析，結(jié)果顯示，AdWRKY37基因啟動子含茉莉酸、水楊酸、生長素等多種植物激素誘導表達元件，以及胚乳特異性表達、光響應(yīng)、熱響應(yīng)元件（表2）。

2.2AdWRKY37蛋白的理化性質(zhì)分析

經(jīng)在線軟件ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，AdWRKY37由1 158個氨基酸構(gòu)成，分子量為131.79 kD，理論等電點為6.82。在氨基酸組成方面，亮氨酸（Leu）含量最高，占全部氨基酸含量的14.3%，其次含量較多的分別是Ser（9.2%）、Lys（7.2%）、Glu（6.6%）、Ile（6.1%）、Asp（5.9%）。帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為139，帶負電荷的氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)為144。該蛋白親水氨基酸與疏水氨基酸分布均勻且疏水氨基酸多于親水氨基酸，氨基酸親水性平均系數(shù)為-0.270（圖1）。

由SubLoc亞細胞定位分析，AdWRKY37位于細胞核的預期準確度為74%，可靠性指數(shù)RI=2。由SignalP在線軟件分析，AdWRKY37不含信號肽。

2.3AdWRKY37蛋白結(jié)構(gòu)分析

Pfam在線軟件分析顯示，AdWRKY37含有WRKY、NBS、LRR保守結(jié)構(gòu)域，位置分別是3 241—3 411、673—1 356、1 495—2 154 bp。此外，AdWRKY37還含有一個鋅指結(jié)構(gòu)C2-H2（C-X4-C-X23-H-X1-H），屬于WRKY家族的第二組。利用SWISS-MODEL在線軟件，預測了AdWRKY37的三級結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

2.4進化樹分析

從NCBI中收集大豆、水稻、擬南芥等WRKY家族基因，利用MEGA 6軟件對這些序列進行進化樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示，AdWRKY37基因與擬南芥AtWRKY52基因親緣關(guān)系較近（圖3）。擬南芥AtWRKY52基因又名RRS1，與AdWRKY37類似，其編碼蛋白含有NBS、LRR和WRKY結(jié)構(gòu)域。前人研究顯示，AtWRKY52基因可以提高擬南芥對青枯病脅迫的耐受，并且受水楊酸誘導表達[12]。

2.5AdWRKY37基因的表達分析

實時定量PCR結(jié)果顯示，AdWRKY37基因在正常花生葉中是不表達的，受青枯病脅迫6 h后，表達量明顯升高，說明AdWRKY37基因受青枯病菌誘導表達。此外，AdWRKY37基因的表達受水楊酸誘導，水楊酸處理后，AdWRKY37基因表達量顯著升高，且隨著處理時間延長而增加。茉莉酸處理后，AdWRKY37基因表達量也上調(diào)（圖4）。

3討論

AdWRKY37是包含NBS-LRR結(jié)構(gòu)域的基因，其氨基酸組成中有大量的亮氨酸。SubLoc亞細胞定位分析顯示，AdWRKY37定位于細胞核的預期準確度為74%。AdWRKY37含一個WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)C2-H2（C-X4-C-X23-H-X1-H），屬于WRKY家族的第二組。通過進化樹分析可以發(fā)現(xiàn)，AdWRKY37基因與擬南芥RRS1有較近的親緣關(guān)系，且兩者的蛋白三級結(jié)構(gòu)也非常相近，又同時擁有NBS、LRR和WRKY三個結(jié)構(gòu)域。因此，AdWRKY37基因功能可能與RRS1功能相近。目前的研究顯示，擬南芥RRS1基因與抗青枯病相關(guān)[12]，因此我們初步判斷AdWRKY37基因可能參與野生花生抗青枯病的生物過程。病原菌入侵會激發(fā)茉莉酸和水楊酸等激素信號途徑，并調(diào)控下游抗病基因的表達。啟動子分析顯示，AdWRKY37基因啟動子中含茉莉酸、水楊酸等多種植物激素誘導表達元件，而外源水楊酸和茉莉酸處理可以誘導野生花生AdWRKY37基因的表達，說明該基因可能響應(yīng)這些激素信號或受這些激素信號途徑的影響，推測與野生花生的抗病機制相關(guān)。而青枯病菌液對野生花生的直接處理導致AdWRKY37基因表達上調(diào)，進一步說明了AdWRKY37基因可能參與野生花生抗青枯病的生物過程。

參考文獻：

[1]張新友.挖掘利用近緣野生種質(zhì)加強花生種質(zhì)創(chuàng)新[J].作物雜志，2012（6）： 6-7.

[2]游春平，傅瑩，韓靜君，等.我國花生病害的種類及其防治措施[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22（1）： 97-101.

[3]陳高，徐鳳花，單世華，等. 花生抗病基因分離克隆研究進展[J].生物技術(shù)通訊，2009，20（2）：279-281.

[4]王友紅，張鵬飛，陳建群. 植物抗病基因及其作用機理[J].植物學通報，2005，22（1）： 92-99.

[5]Hulbert S H， Webb C A ， Smith S M， et al. Resistance gene complexes： evolution and utilization[J]. Annual Review of Phytopathology， 2001， 39：285-312.

[6]Parniske M， Hammond-Kosack K E， Golstein C， et al. Novel disease resistance specificities result from sequence exchange between tandemly repeated genes at the Cf-4/9 locus of tomato[J]. Cell， 1997，91（6）：821-832.

[7]Meyers B C， Kozik A， Griego A， et al. Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2003， 15（4）：809-834.

[8]Alvarez M E. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance[J]. Plant Mol. Biol.， 2000， 44： 429-442.

[9]陸雯，潘璐琪，王雪艷.水楊酸及茉莉酸介導植物抗病性的研究進展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2013， 41（10）： 40-43.

[10]Vergne E， Grand X， Ballini E， et al. Preformed expression of defense is a hallmark of partial resistance to rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae [J]. BMC Plant Biol.， 2010， 10： 206.

[11]張娟. WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能研究進展[J].西北植物學報，2009，29（10）：2137-2145.

[12]Deslandes L， Olivier J， Hirsch J， et al. Resistance to Ralstonia solanacearum in Arabidopsis thaliana is conferred by the recessive RRS1-R gene， a member of a novel family of resistance genes[J]. PNAS， 2002，99（4）：2404-2409.

[13]宋鈺.四個植物WRKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能初探[D]. 北京：中國科學院研究生院，2008.

[14]Eulgem T， Rushton P J， Robatzek S， et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J].Trends in Plant Science，2000，5（5）： 199-206.

[15]王娜，張振葆，黃鳳珠，等.WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物非生物脅迫應(yīng)答的研究進展[J].核農(nóng)學報，2014，28（10）：1819-1827.