袁文婭++孫振宇++梁丹++時(shí)曉偉++陳靜++張梅茹++馬占鴻++劉秀峰

摘要：為了解貴州省小麥條銹菌群體的遺傳多樣性，本研究采用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記（AFLP）對(duì)其進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：貴州省6個(gè)縣市分離到的128個(gè)小麥條銹菌單孢子堆分離物中共獲得32個(gè)AFLP基因型，沒有檢測(cè)到頻率占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的AFLP基因型，其中1個(gè)AFLP基因型（zy6）頻率（0.195）較高，AFLP基因型頻率介于0.050～0.100的有3個(gè)，其余28個(gè)AFLP基因型的頻率均低于0.050。香農(nóng)系數(shù)及Φpt方法均顯示亞群體間遺傳差異不明顯；Mantel test顯示小麥條銹菌貴州群體遺傳差異程度與地理距離無關(guān)；最大簡約樹步長評(píng)估結(jié)果顯示小麥條銹菌貴州群體自由重組的可能性較低。表明，貴州省小麥條銹菌群體具有豐富的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞：小麥條銹菌；群體遺傳結(jié)構(gòu)；AFLP標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S435.121.4+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）06-0095-06

AbstractThe population genetic diversity of wheat stripe rust （Puccinia striiformis f. sp. Tritici） in Guizhou Province was analyzed by amplified fragment length polymorphism （AFLP）. The results showed that 32 AFLP genotypes were obtained from 128 isolates collected from 6 counties in Guizhou Province. No predominant genotype was identified. In which， 1 genotype，zy6，had the highest frequency of 0.195， 3 genotypes had the frequency between 0.050～0.100， and the frequency of the other 28 genotypes was less than 0.050. Shannon coefficient and Φpt statistics results showed that the genetic differentiation among 6 counties was not significant. Mantel test suggested that there was no significant correlation between genetic differentiation and geographical distances. The most parsimonious tree length results showed that the possibility of free recombination for population of Puccinia striiformis f. sp. tritici in Guizhou was very lower. The results indicated that the genetic diversity of P. striiformis was rich in Guizhou Province.

KeywordsPuccinia striiformis f. sp. tritici； Population genetic structure； AFLP marker

貴州省地處云貴高原，毗鄰云南越夏區(qū)。海拔300～2 400 m地帶均有小麥種植，不同海拔地區(qū)小麥生長時(shí)期重疊，加之播種下茬作物時(shí)常不翻耕保留著大量自生麥苗，致使田間周年都有麥苗[1]。夏季低溫，具有獨(dú)特的環(huán)境條件，從理論上推測(cè)具備小麥條銹菌（Puccinia striiformis f.sp tritici）越夏條件。小麥條銹菌在貴州境內(nèi)能否安全越夏長期以來并不清楚，直到2006年證實(shí)小麥條銹菌在赫章等地海拔1 700 m以上地區(qū)能夠安全越夏，引起秋苗發(fā)病[2]。2006年11月農(nóng)業(yè)部印發(fā)的《小麥條銹病中長期治理指導(dǎo)意見》指出，貴州等地的低山、河谷、山壩是我國小麥條銹菌冬繁區(qū)之一，也是當(dāng)?shù)睾土餍袇^(qū)小麥條銹病春季流行的重要菌源地。小麥條銹菌在貴州地區(qū)既能越夏也能越冬，在一定海拔范圍內(nèi)在當(dāng)?shù)啬軌蛲瓿芍苣暄h(huán)，非常適合小麥條銹菌產(chǎn)生遺傳變異。目前貴州菌源與周邊省份的菌源傳播關(guān)系及其對(duì)我國小麥條銹病發(fā)生流行的影響等研究資料稀少。貴州地區(qū)小麥條銹菌群體作為西南流行區(qū)系的重要組成，了解其群體遺傳結(jié)構(gòu)顯然具有重要意義。本研究從貴州省6個(gè)縣市分離出128個(gè)小麥條銹菌單孢子堆分離物，通過AFLP標(biāo)記和重組信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期為了解小麥條銹病的傳播途徑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小麥條銹菌標(biāo)樣采集于貴州省6個(gè)縣市，這些地區(qū)基本覆蓋了貴州省東北、西北、西南以及貴州中部。樣本具體信息見表1。

1.2試驗(yàn)方法

小麥條銹菌單孢子堆基因組DNA提取、AFLP體系和反應(yīng)條件采用Enjalbert等[3]報(bào)道的方法，略有修改。

1.3數(shù)據(jù)分析

同一對(duì)AFLP引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，屬于同一位點(diǎn)的產(chǎn)物。AFLP條帶在兩個(gè)以上供試小麥條銹菌分離物共有的作為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶的有和無分別記作1和0。排除無法準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)的帶，然后構(gòu)建多態(tài)性條帶二進(jìn)制原始數(shù)據(jù)矩陣。

1.3.1貴州小麥條銹菌群體和亞群體的AFLP基因型調(diào)查每個(gè)縣市采集到的小麥條銹菌分離物看作一個(gè)亞群體，貴州省標(biāo)樣共計(jì)分為6個(gè)亞群體。采用MULTILOCUS 1.3軟件[4]計(jì)算各亞群體及貴州小麥條銹菌群體的不同AFLP基因型頻率。

1.3.2貴州小麥條銹菌亞群體內(nèi)的遺傳多樣性分析用Nei 氏多樣性系數(shù)（Neis diversity index）、Nei 氏無偏多樣性系數(shù)（Neis unbiased diversity index）、香農(nóng)系數(shù)（Shannons information index）以及多態(tài)位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic loci）評(píng)估貴州小麥條銹菌6個(gè)亞群體內(nèi)的多樣性。

1.3.3貴州小麥條銹菌亞群體間的遺傳分化比較φpt類似于F統(tǒng)計(jì)，可用于評(píng)估遺傳結(jié)構(gòu)，但其不需要假設(shè)可直接對(duì)顯性標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析[5]。Fst和φpt兩個(gè)參數(shù)用于評(píng)估貴州小麥條銹菌亞群體間的遺傳變異。同時(shí)采用GENALEX 6.0軟件[6]中的分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）評(píng)估貴州各亞群體間的遺傳差異。

1.3.4貴州小麥條銹菌遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析根據(jù)各采樣地點(diǎn)的經(jīng)緯度計(jì)算地理矩陣，根據(jù)Nei 氏遺傳距離計(jì)算遺傳矩陣，利用GENALEX 6.0中的Mantel test方法計(jì)算貴州地區(qū)小麥條銹菌各亞群體遺傳距離與地理距離的相關(guān)性[3] ，同時(shí)對(duì)兩個(gè)矩陣相關(guān)系數(shù)的顯著性進(jìn)行1 000次permutation自舉檢驗(yàn)，評(píng)估貴州小麥條銹菌各亞群體遺傳結(jié)構(gòu)是否具有地理隔離現(xiàn)象（isolation-by-distance）。該相關(guān)性檢測(cè)中的無效假設(shè)是地理距離矩陣和遺傳距離矩陣間沒有相關(guān)性，即各亞群體間遺傳距離不隨地理距離的改變而改變。Mantel test 產(chǎn)生的相關(guān)系數(shù)范圍在 -1和 +1之間，如果各亞群體間遺傳距離和地理距離不相關(guān)，則真實(shí)進(jìn)化值應(yīng)在自舉檢測(cè)的相關(guān)系數(shù)范圍之內(nèi)。

1.3.5貴州小麥條銹菌群體重組信號(hào)檢測(cè)采用連鎖不平衡系數(shù)（rd）計(jì)算連鎖不平衡時(shí)不依賴于所用位點(diǎn)個(gè)數(shù)，可提高不同研究者間結(jié)果比對(duì)的可行性[4]。利用rd對(duì)貴州地區(qū)小麥條銹菌各亞群體間是否有重組現(xiàn)象進(jìn)行檢驗(yàn)。應(yīng)用MULTILOCUS 1.3軟件計(jì)算貴州各亞群體間的rd，同時(shí)進(jìn)行1 000次permutation自舉檢驗(yàn)。該檢驗(yàn)中無效假設(shè)是群體間沒有連鎖不平衡，可以自由重組。如果貴州各亞群體間的連鎖不平衡系數(shù)值偏離無效假設(shè)的數(shù)據(jù)分布范圍，則表明各亞群體間不能自由重組。同時(shí)利用最大簡約樹步長評(píng)估法（parsimony tree length permutation test， PTLPT）檢測(cè)貴州地區(qū)小麥條銹菌群體是否有重組信號(hào)。PTLPT的運(yùn)算在PAUP 4.0 β 10 中進(jìn)行[7]。

2結(jié)果與分析

2.1貴州小麥條銹菌群體和亞群體的AFLP基因型

貴州地區(qū)128個(gè)小麥條銹菌分離物中共獲得32個(gè)AFLP基因型，群體的AFLP基因型多態(tài)性頻率為0.250。各AFLP基因型個(gè)數(shù)及其分布見表2。如表2所示，貴州小麥條銹菌群體沒有檢測(cè)到頻率占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的AFLP基因型，在遵義縣南白鎮(zhèn)獲得的分離物的基因型（zy6）頻率占有一定優(yōu)勢(shì)（頻率為0.195），基因型頻率介于0.050～0.100的有3個(gè)（xy2、xy1、px1），其余28個(gè)AFLP基因型的頻率均低于0.050。

2.2貴州小麥條銹菌亞群體內(nèi)的遺傳多樣性

香農(nóng)系數(shù)、Nei 氏多樣性系數(shù)、Nei 氏無偏系數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率這幾個(gè)參數(shù)都是通過計(jì)算群體內(nèi)的各對(duì)個(gè)體間距離后，得出一個(gè)衡量該群體遺傳差異的平均數(shù)。其中，香農(nóng)系數(shù)計(jì)算方法更側(cè)重于存在條帶的權(quán)重，Nei 氏多樣性系數(shù)更關(guān)注于所比較個(gè)體的相似性，Nei 氏無偏系數(shù)與Nei 氏多樣性系數(shù)相似，但更適合于在群體研究數(shù)量少時(shí)采用。多態(tài)性位點(diǎn)百分率不能確定各條帶在頻率上的均勻程度，且受到樣本大小和條帶總數(shù)的影響，它只是衡量群體遺傳多態(tài)性的一個(gè)粗略估計(jì)值，但它計(jì)算簡單直觀，能夠反映一定的遺傳多樣性程度，在研究中得到了廣泛應(yīng)用。由表3可知， 盡管這幾個(gè)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)側(cè)重點(diǎn)有少許差異，但結(jié)果均顯示貴州小麥條銹菌各亞群體內(nèi)都存在較豐富的遺傳多樣性。

2.3貴州小麥條銹菌亞群體間的遺傳變異

由表4可知，將AFLP 基因型數(shù)據(jù)作為共顯性（codominant）的雙等位基因基因型數(shù)據(jù)，用φpt參數(shù)衡量亞群體兩兩之間的遺傳差異性。利用φpt值推斷，除開陽縣-松桃縣間的φpt值稍高（φpt=0.301）外，其它亞群體兩兩間φpt值都很小，顯示貴州省小麥銹菌6個(gè)亞群體兩兩之間的遺傳差異不明顯。

本研究根據(jù)小麥條銹菌的特點(diǎn)選用歐氏距離平方計(jì)算和矯正基因型之間的進(jìn)化距離，矯正后再進(jìn)行分子方差分析，AMOVA結(jié)果（表5）表明，89%的變異來源于亞群體之內(nèi)。

這些結(jié)果顯示貴州小麥條銹菌群體和6個(gè)亞群體間都存在著一定遺傳分化。

2.4貴州小麥條銹菌遺傳距離與地理距離的相關(guān)性

圖1結(jié)果顯示，貴州群體的遺傳距離和地理距離的相關(guān)系數(shù)為0.11，在1 000次假設(shè)的相關(guān)系數(shù)分布范圍內(nèi)，表明小麥條銹菌貴州群體遺傳差異程度與地理距離無關(guān)。

2.5貴州小麥條銹菌群體重組信號(hào)檢測(cè)

rd值計(jì)算結(jié)果顯示，rd值明顯偏離無效假設(shè)的自由交配群體的值（rd=0.032， P<0.001），因此拒絕無效假設(shè)，表明小麥條銹菌貴州群體自由重組的可能性較低。圖2結(jié)果顯示，PTLPT構(gòu)建的貴州群體最大簡約樹步長（165步）明顯短于無〖CM（21〗效假設(shè)的自由重組的簡約樹步長范圍，所以拒絕無效假設(shè)。連鎖不平衡系數(shù)rd和PTLPT結(jié)果均表明貴州小麥條銹菌群體自由重組的可能性較低。

3討論

貴州全省貫穿我國南北走向和東北-西南走向兩組山脈交匯的云貴高原，地理環(huán)境復(fù)雜，地勢(shì)起伏較大，種植小麥品種繁雜。本研究采樣地點(diǎn)涵蓋了松桃、興義、遵義等6個(gè)縣市，代表黔東北、黔西南、黔中不同地理區(qū)域，西南部的盤縣與云南省的富源縣接壤，而東北部的松桃縣與湖南省接壤，又結(jié)合了南亞熱帶等貴州小麥種植的主要?dú)夂驇?。鑒定的標(biāo)樣采自20余個(gè)小麥品種共128份，具較好的地域代表性、氣候代表性及寄主品種代表性。

總體上比較，小麥條銹菌貴州群體的各基因型頻率相對(duì)均衡，沒有頻率非常高的優(yōu)勢(shì)基因型。貴州小麥條銹菌群體的基因型中，只有zy6基因型的頻率占有一定優(yōu)勢(shì)（頻率為0.195），但明顯低于小麥條銹菌云南群體中的qj3基因型頻率[8]。zy6基因型在遵義縣檢測(cè)到，但其出現(xiàn)頻率在遵義縣比較低，而在開陽縣檢測(cè)到該基因型的分離物較多，暗示小麥條銹菌遵義群體和開陽群體間有較高的基因型交流。與湖南接壤的松桃縣檢測(cè)到的5個(gè)基因型頻率基本相當(dāng)，沒有優(yōu)勢(shì)的AFLP基因型。西北部的赫章縣各個(gè)基因型的頻率也比較均衡，沒有優(yōu)勢(shì)基因型或者頻率非常低的基因型。Mantel test檢驗(yàn)結(jié)果表明貴州小麥條銹菌群體遺傳差異程度與地理距離無關(guān)，暗示貴州各亞群體間存在著基因型交流。與此一致，對(duì)貴州小麥條銹菌群體進(jìn)行的分子方差分析結(jié)果顯示，貴州群體中變異仍然主要來自于群體內(nèi)部，種群間變異較小，只占遺傳總變異的11%。小麥條銹菌貴州群體沒有發(fā)現(xiàn)重組信號(hào)，可將其看作克隆繁殖方式。與北美[9]、西北歐[10]、法國[11]、地中海[12] 、澳大利亞1979—2006年的小麥條銹菌群體[13]的繁殖方式相同?？寺》敝撤绞绞沟眉纳m合度高的個(gè)體得以迅速有效增長，這樣的群體能夠保持適合度高的個(gè)體迅速侵染寄主[13]。

美國Pst-130[14]和中國CY32小種[15]的基因組序列為研究小麥條銹菌提供了新的工具。利用CY32小種的基因組序列已經(jīng)篩選出20個(gè)具有多態(tài)性的SSR引物，比利用表達(dá)序列標(biāo)簽篩選的SSR引物具有更高的多態(tài)性[16]。若將本研究中的各AFLP基因型分離物進(jìn)行重測(cè)序或某一時(shí)刻的轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)測(cè)序所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析，可能會(huì)對(duì)貴州地區(qū)小麥條銹菌越夏菌源與本地和周邊地區(qū)小麥發(fā)病的關(guān)系、與我國西南云貴川小麥條銹菌菌源關(guān)系以及西南地區(qū)小麥條銹菌越夏、越冬后對(duì)我國小麥條銹病發(fā)生流行的影響等有更深入認(rèn)識(shí)。

4小結(jié)

貴州小麥條銹菌群體的變異主要來源于亞群體之內(nèi)，亞群體間的遺傳差異不明顯，群體遺傳差異程度與地理距離不相關(guān)，貴州小麥條銹菌群體自由重組的可能性較低。結(jié)果表明貴州小麥條銹菌群體具有豐富的遺傳多樣性。

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