超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜測定蜂蜜中甲硝唑殘留

馬曉年++李文廷++歐利華++梁志堅+++段海波

甲硝唑具有廣譜抗厭氧菌和抗原蟲的作用，主要用于預防和治療厭氧菌引起的感染。蜂蜜營養(yǎng)豐富，是人類重要的滋補食品，由于諸多原因，蜂蜜中可能存在甲硝唑的殘留，給消費者帶來潛在的危害。

目前，國內(nèi)外采用的檢測甲硝唑殘留的方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用和液質(zhì)聯(lián)用。本方法采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法對蜂蜜中的甲硝唑殘留進行測定，取得滿意結(jié)果。

實驗部分

試劑與儀器。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源和大氣壓化學源（美國AB公司）；BEH C18柱（Waters公司）；實驗用水為二次蒸餾水；甲醇、乙腈、乙酸乙酯為色譜純，濃氨水、濃鹽酸為分析純；甲硝唑標準物質(zhì)（Dr.Ehrenstorfer）；甲硝唑-D4同位素內(nèi)標（Dr.Ehrenstorfer）；蜂蜜（超市）。

分析條件。色譜柱：Waters BEH C18柱（1.7?m，2.1mm×100mm）；流動相：0.05%氨水：乙腈梯度洗脫；流速0.4mL/min；進樣量：20?L。掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測（MRM）；離子化電壓：5500V；噴霧器壓力：40psi；氣簾氣壓力：35psi；輔助氣流速：40?L/min；離子源溫度：450℃；去簇電壓（DP）：52V。

樣品處理。（1）樣品提取。稱取蜂蜜5.00g于50mL離心管中，分別加入100?L 20ng/mL D4-甲硝唑應用液，加水10mL，混勻溶解，再加入10 mL乙酸乙酯，渦旋提取2min，1000rpm離心2min，吸取上層乙酸乙酯相5mL入10mL試管，50℃氮氣吹干后，加入0.1mL甲醇溶解，再加入1.9mL 40mmol/L鹽酸溶液，超聲溶解1min，轉(zhuǎn)入2mL離心管，12000rpm離心2min，上清液待凈化。

（2）樣品凈化。依次用5mL甲醇、5mL水、5mL 40mmol/L鹽酸溶液活化平衡MCS固相萃取柱，然后轉(zhuǎn)移上述上清液至MCS柱內(nèi)，待樣品過柱后，用5mL水淋洗除去雜質(zhì)，再用5mL甲醇淋洗除雜質(zhì)，真空抽干后用5mL 5%氨化甲醇洗脫，收集于10mL具塞試管內(nèi)，得洗脫液；洗脫液在50℃下用氮氣吹干，先加入0.1mL甲醇超聲溶解殘留物，再加入0.9mL 10%甲醇/水溶液混勻，過0.22?m濾膜后待LC-MS/MS分析。

結(jié)果與討論

質(zhì)譜條件的選擇。在流動注射狀態(tài)下將甲硝唑和D4-甲硝唑的標準溶液注入離子源中，在正離子和負離子的檢測方式下進行母離子全掃描，并確定母離子質(zhì)量數(shù)，結(jié)果表明甲硝唑在正離子模式下產(chǎn)生最強峰。以目標化合物的準分子離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的目標化合物的二級質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使得子離子在保證分辨率的條件下靈敏度最佳。

色譜條件優(yōu)化。為了有利于色譜峰的分離，消除樣品雜質(zhì)對目標物的干擾，本方法采用乙腈-0.05%的氨水溶液為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離和檢測效果。檢測開始時，流動相中乙腈-0.05%的氨水的體積比為10：90，并保持0.5min；0.5～2.0min，乙腈的比例由10%線性上升至90%，保持此比例1min，這部分主要是因為乙腈在流動相中所占比例，決定甲硝唑的保留時間、峰形和測定的靈敏度；3.0～3.5min， 乙腈的比例由90%線性下降至10%，并保持1.5min。實驗表明，在此梯度條件下，甲硝唑與雜質(zhì)達到完全分離。

樣品提取溶劑的選擇。甲硝唑易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑。有研究選用乙酸乙酯作為提取溶劑，乙酸乙酯提取雜質(zhì)多，提取顏色較深，但乙酸乙酯提取率高，因此本實驗選用乙酸乙酯提取樣品中的甲硝唑，氮氣吹干。

方法的線性關(guān)系。將甲硝唑和D4-甲硝唑制備成含甲硝唑0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0ng/mL，含D4-甲硝唑2.0ng/mL的混合標準溶液直接進樣。以含量對峰面積的比值繪制標準曲線。結(jié)果見表1。

回收率及精密度實驗。準確稱取空白樣品9份，每份5.00g，共3組，分別在蜂蜜空白樣品中添加0.5、2.0、5.0ng甲硝唑， D4-甲硝唑含量與標準曲線相同。按供試品溶液制備方法制備后進行測定，結(jié)果見表2。結(jié)果可見，不同濃度平均加標回收率88%～94.3%，平均相對標準偏差為5.5%～7.6%。圖2為加標樣品中MRM色譜圖。

應用本方法檢測了5個地州不同產(chǎn)地蜂蜜共36件，甲硝唑檢出35件，檢出率高達97.22%。實驗結(jié)果表明，在蜂蜜中甲硝唑的濫用問題非常嚴重，應引起足夠的關(guān)注，加大監(jiān)管力度。本方法具有很高的選擇性和靈敏度，容易操作，適用于日常檢驗，可為甲硝唑污染監(jiān)測工作提供依據(jù)。