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      生物制品中牛病毒性腹瀉病毒RT—PCR及套式 RT—PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

      2017-06-30 08:06:22顧蓓蓓王妍鱈李雙潔盧勁曄
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年8期
      關(guān)鍵詞:疫苗

      顧蓓蓓++王妍鱈++李雙潔++盧勁曄++苗晉鋒

      摘要:為建立生物制品中牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)污染的檢測方法,根據(jù)GenBank公布的BVDV序列,分別設(shè)計了普通PCR和套式PCR的特異性引物,建立了檢測BVDV的普通PCR和套式PCR檢測方法。結(jié)果表明,該方法可以快速檢測出生物制品中的BVDV污染,為生物制品中BVDV的快速、低含量檢測提供了簡單快速的檢測方法。

      關(guān)鍵詞:牛血清;疫苗;牛病毒性腹瀉病毒;套式RT-PCR

      中圖分類號: R914;S858.235.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2017)08-0030-03

      牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的,以發(fā)熱、白細(xì)胞減少、胃腸道黏膜糜爛潰瘍、腹瀉及懷孕母牛不孕、流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病[1]。牛病毒性腹瀉呈世界性分布,在養(yǎng)牛發(fā)達(dá)國家也廣泛存在,給畜牧業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬,與豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)同屬,具有抗原相關(guān)性,豬也可感染BVDV,感染后癥狀和病理變化與豬瘟類似,此病引起許多國家的關(guān)注,尤其是豬瘟已經(jīng)被消滅或控制的國家和地區(qū)。

      近年來,國內(nèi)研究人員多次從發(fā)病豬群中分離到BVDV,證實了該病在我國一直存在。一般認(rèn)為豬感染BVDV的傳染源為污染了BVDV的豬瘟活疫苗。據(jù)調(diào)查,我國豬瘟疫苗質(zhì)量控制問題突出,BVDV污染嚴(yán)重。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所對國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的不同批次豬瘟疫苗半成品及成品檢測結(jié)果顯示,兩者的BVDV陽性率分別達(dá)20.7%、22.2%。疫苗生產(chǎn)中感染牛病毒性腹瀉病毒是因為在細(xì)胞培養(yǎng)時使用了被BVDV污染的犢牛血清造成的,而這種感染又不易被發(fā)現(xiàn),使用這種感染的血清用于生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞受到污染,損失巨大[2-3]。近年來,多地檢驗檢疫部門在進(jìn)口牛血清中檢測出BVDV。目前針對牛血清及疫苗中BVDV的檢測標(biāo)準(zhǔn)缺失,因此建立特異性的BVDV檢測方法至關(guān)重要。本研究根據(jù)GenBank公布的BVDV序列,分別設(shè)計了普通PCR和套式PCR的特異性引物,建立了檢測BVDV的普通PCR和套式PCR檢測方法,以期為牛病毒性腹瀉/黏膜病的臨床快速診斷提供理論依據(jù)。

      1材料與方法

      1.1主要試劑及儀器

      牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬瘟病毒(CSFV)、牛腎細(xì)胞MDBK、傳染性牛鼻氣管炎病毒由筆者所在實驗室保存。TRIzol購自Invitrogen公司,Takara PCR Mix、凝膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

      主要儀器:SmartSpecTM Plus核酸濃度測定儀、梯度PCR儀、GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、臺式高速低溫離心機(jī)(eppendorph)。

      1.2病毒基因組RNA的提取

      將BVDV接種于MDBK單層細(xì)胞,設(shè)空白對照,待細(xì)胞出現(xiàn)典型的空泡病變后,收獲病毒,用Trizol試劑盒提取病毒基因組及對照細(xì)胞的RNA。

      1.3RT-PCR反應(yīng)

      1.3.1RT-PCR反應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株的全序列,設(shè)計合成引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下:WS-BVDV-F:5′-CTT AGC GAA GGC CGA AAA GAG-3′;WS-BVDV-R:5′-CTC CAT GTG CCA TGT ACA GCA G-3′。

      用隨機(jī)引物同時對樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,建立樣品的cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:Takara PCR Mix 12.5 μL,cDNA 2 μL,10 μmol/L 上游、下游引物各1 μL,加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min,擴(kuò)增反應(yīng)條帶為312 bp。

      1.3.2套式RT-PCR反應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株的全序列,選擇BVDV保守性較強(qiáng)的5′非編碼區(qū)域,設(shè)計合成2對特異性引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下:BVDV-1 F:5′-TCAGCGAAGGCCGAAAAGAGG-3′;BVDV-1 R:5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGAG-3′;BVDV-1 Fn:5′-CAGTGGCGAGTTCGTTGGATG-3′;BVDV-1 Rn:5′-GGCCTCTGCAGCATCCTATCAG-3′。

      用隨機(jī)引物同時對樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,建立樣品的cDNA。第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:TaKaRa PCR Mix 12.5 μL,cDNA 2 μL,上游、下游引物BVDV-1F、BVDV-1R(10 μmol/L)各1 μL,加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min,擴(kuò)增反應(yīng)條帶為309 bp。

      第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板為第1輪PCR產(chǎn)物,反應(yīng)體系:TaKaRa PCR Mix 12.5 μL,第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物 1 μL,20 μmol/L上游、下游引物各1 μL,加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min,擴(kuò)增反應(yīng)條帶為197 bp。

      1.4PCR特異性試驗

      分別提取BVDV、CSFV、傳染性牛鼻氣管炎病毒、MDBK 正常細(xì)胞的RNA,用已建立的2種方法進(jìn)行擴(kuò)增,驗證所建方法的特異性。

      1.5檢測方法的初步應(yīng)用

      利用所建的套式RT-PCR方法檢測血清、疫苗等生物制品,同時對陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定,進(jìn)行序列分析。

      2結(jié)果與分析

      2.1擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

      PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳,普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于312 bp,套式PCR第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物位于309 bp(圖1),第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物在197 bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶,與預(yù)期大小相符(圖2)。

      2.2特異性試驗

      利用設(shè)計的普通PCR引物對牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物位于312 bp,豬瘟病毒、MDBK細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒均未擴(kuò)增出片段(圖3)。利用設(shè)計的套式PCR第1輪引物對牛病毒性腹瀉病毒擴(kuò)增除了309 bp的目的基因片段,測序結(jié)果與BVDV毒株序列一致,而豬瘟病毒、MDBK 細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒均未能擴(kuò)增出片段(圖4)。取第1輪PCR產(chǎn)物各1 μL為模板,利用第2輪引物進(jìn)行擴(kuò)增,在位于197 bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶,與預(yù)期大小相符,測序鑒定結(jié)果與BVDV序列一致,而豬瘟病毒、MDBK細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒均未擴(kuò)增出片段(圖5)。

      2.3檢測方法的應(yīng)用

      應(yīng)用本研究建立的BVDV普通RT-PCR和套式 RT-PCR 檢測方法,檢測來自不同批次的牛血清和疫苗制品各6份,共計12份樣品,檢測結(jié)果表明,本研究建立的方法能夠檢測出生物制品中污染BVDV的情況,且套式PCR的檢測結(jié)果更為靈敏、準(zhǔn)確(圖6、圖7)。

      3結(jié)論與討論

      小牛血清是生物制品制造過程中不可或缺的原材料,其安全性備受關(guān)注。研究表明,細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品中BVDV

      核酸物質(zhì)污染基本上是由于使用了含有BVDV核酸物質(zhì)的牛血清引起的。因此在使用牛血清前,尤其是在用于制造人或動物疫苗等生物制品時,應(yīng)嚴(yán)格檢測其是否被BVDV污染[4]?!稓W盟生物制品生產(chǎn)牛血清使用指南》要求用細(xì)胞培養(yǎng)法和免疫熒光抗體法確認(rèn)牛血清病毒的感染性[5]?!吨袊幍洹啡扛戒浺矊π律Q鍣z測提出了相同的技術(shù)要求。雖然各國對于牛血清的生產(chǎn)均有嚴(yán)格的技術(shù)規(guī)范,但由于檢測技術(shù)存在局限性,市場上還是有部分牛血清存在BVDV污染現(xiàn)象[6]。近2年,我國2次在進(jìn)口小牛血清中檢測到BVDV,發(fā)布了2次風(fēng)險預(yù)警,先后禁止新西蘭、澳大利亞的相關(guān)產(chǎn)品入境。由于BVDV和CSFV存在抗原交叉性,帶有BVDV抗原的血清不能用來培養(yǎng)CSFV,而應(yīng)用BVDV

      污染的豬瘟疫苗免疫豬只可能導(dǎo)致其感染BVDV,引起類似于非典型豬瘟的發(fā)生。因此科研單位和生物制品企業(yè)應(yīng)該加強(qiáng)對其使用的小牛血清的BVDV檢測。

      目前,BVDV的檢測方法有病毒分離技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、病毒中和試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等[7]。與病毒分離技術(shù)、病毒中和試驗等方法相比,RT-PCR技術(shù)具有快速高效且特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究建立了BVDV的RT-PCR檢測方法,同時根據(jù)BVDV 5′端非編碼區(qū)設(shè)計2對引物,建立了比常規(guī)PCR靈敏度更高的套式RT-PCR方法,為生物制品中微量的BVDV污染提供了一種更加特異、敏感的方法。本方法臨床應(yīng)用結(jié)果顯示,在隨機(jī)抽檢的疫苗和血清樣品中均能檢測到被BVDV污染的樣品,且套式PCR的檢測靈敏度優(yōu)于普通PCR,表明上述2種方法均能用于檢測生物制品中BVDV污染。

      參考文獻(xiàn):

      [1]祖立闖,王金良,李嬌,等. 牛病毒性腹瀉病毒套式RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報,2010,30(12):1598-1601,1605.

      [2]Peterhans E,Bachofen C,Stalder H,et al. Cytopathic bovine viral diarrhea viruses (BVDV):emerging pestiviruses doomed to extinction[J]. Veterinary Research,2010,41(6):44.

      [3]陶潔,廖金虎,張倩,等. 豬感染牛病毒性腹瀉病毒研究進(jìn)展[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2014,36(5):410-413.

      [4]祖立闖,魏鳳,苗立中,等. 應(yīng)用套式RT-PCR檢測豬瘟制品中牛病毒性腹瀉病毒污染的研究[J]. 養(yǎng)豬,2011(6):97-100.

      [5]The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal product(CPMP/BWP/1793/02) [M]. London:EMEA,2003:5-7.

      [6]王競晗,李素,何文瑞,等. 進(jìn)口胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒的分離及鑒定[J]. 中國生物制品學(xué)雜志,2016,29(3):308-311.

      [7]張寧,秦建華,趙博偉,等. 牛病毒性腹瀉-黏膜病診斷方法研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(2):93-97.

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