李海玲++苗紅梅++張海洋++魏其超++段迎輝+汪學德

摘要：芝麻枯萎病是芝麻主要病害之一，由尖孢鐮刀菌芝麻?；颓秩疽?。為探明芝麻枯萎病菌產(chǎn)毒類型，試驗采用高效乙酸乙酯萃取法，對尖孢鐮刀菌株HSFO07021菌液進行了粗毒素提?。徊捎弥袎褐苽渖V儀，首次成功分離了尖孢鐮刀菌芝麻?；?種主要毒素。結構鑒定顯示，尖孢鐮刀菌芝麻?；偷?種毒素分別為鐮刀菌酸、9，10-脫氫鐮刀菌酸和10-羥基鐮刀菌酸。種子處理結果表明，尖孢鐮刀菌芝麻?；彤a(chǎn)生的鐮刀菌酸和9，10-脫氫鐮刀菌酸均能抑制芝麻幼苗的莖葉生長和根部伸長，對幼苗產(chǎn)生毒害；鐮刀菌酸的毒性強于9，10-脫氫鐮刀菌酸。

關鍵詞：芝麻；尖孢鐮刀菌芝麻?；?；鐮刀菌酸；9，10-脫氫鐮刀菌酸；分離

中圖分類號： S435.653文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0082-05

芝麻為胡麻科胡麻屬植物，是世界上最古老的特色油料作物之一，也是我國重要的優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品[1]。芝麻籽粒富含不飽和脂肪酸和維生素E[2-4]，并富含木酚素等多種生物活性物質，對人體健康非常有益。但是在實際生產(chǎn)中，芝麻易受病害、漬澇等因素侵襲，產(chǎn)量與品質均受影響。芝麻枯萎病是由尖孢鐮刀菌芝麻?；停‵usarium oxysporum f. sp. sesami，F(xiàn)OS）侵染引起的1種真菌病害[5-6]。研究表明，尖孢鐮刀菌在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生毒素（例如鐮刀菌酸），對寄主植物有強烈的毒害作用[7-8]。在香蕉枯萎病菌株培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)有鐮刀菌酸（FA）等多種毒素成分存在[8]，鐮刀菌酸可導致香蕉表現(xiàn)枯萎癥狀，而其他毒素成分則在致枯萎過程中起了增效作用，加速了植株枯萎。Wu等研究表明，尖孢鐮刀菌侵染時所產(chǎn)生的鐮刀菌酸能夠引起西瓜的氮素代謝紊亂；此外研究也顯示，枯萎病菌毒素是較為普遍存在的一類毒素，成分復雜，對農(nóng)作物生產(chǎn)和食品安全有重要影響[9]。Smith等從豬飼料、干玉米、高水分谷物、小麥、大麥中均不同程度地檢測出了鐮刀菌酸的存在[10]。近期研究表明，芝麻枯萎病菌亦能產(chǎn)生鐮刀菌毒素（統(tǒng)稱為FOS毒素），主要成分應包括鐮刀菌酸（FA）以及FA-H2、FA+O和FA+O2等3種鐮刀菌酸類似物[11]。但是受毒素提取純化技術的限制，目前尚未獲得各毒素純品；芝麻枯萎病菌各主要毒素的特性如何尚不得而知。以往研究結果顯示，為獲得鐮刀菌毒素，人們多采用活性炭吸附法[12]、乙酸乙酯萃取法[13]從尖孢鐮刀菌濾液中提取。Bani等使用乙酸乙酯萃取法，提取了尖孢鐮刀菌粗毒素；隨后采用硅膠板+乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為8.5 ∶2 ∶1）流動相的分離條件，成功分離到了尖孢鐮刀菌酸[14]。為此，本研究主要探討芝麻枯萎病菌毒素主成分的制備和特性，首次獲得了FOS毒素3個主成分的純品，明確了毒素主成分對芝麻幼苗生長的毒害特點，為下一步開展芝麻枯萎病菌致病機理和防控技術研究奠定了技術和材料基礎。

1材料與方法

1.1病原菌株及保存

選取尖孢鐮刀菌芝麻?；途辏ň幪枺篐SFO07021）開展毒素提取研究。菌株由河南省農(nóng)業(yè)科學院芝麻研究中心病理室保存。

1.2儀器與試劑

毒素提取及分離用儀器設備主要包括：Waters 2695液相色譜儀（Waters公司，美國）、Waters LC150半制備液相色譜（Waters公司，美國）、液質聯(lián)用質譜儀（UPLC-QTOF，xEVO G2，美國）、NICOLET 6700傅利葉紅外光譜儀（賽默飛世爾公司，美國）、500 MHz Bluke核磁共振儀（布魯克公司，德國）、離心機、分液漏斗、凍干機、真空旋轉蒸發(fā)儀、布氏漏斗、真空抽濾機等。鹽酸、乙酸乙酯等試劑均為分析純（國產(chǎn)）。乙腈（TEDIA，America）、乙酸（國產(chǎn)）均為高效液相色譜純度級別，水為純凈水級別。

1.3菌株培養(yǎng)

挑取HSFO07021菌株少量菌絲（-70 ℃保藏），接種在PDA平板培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)4 d。用無菌打孔器沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片3～5個，接入裝有250 mL PD培養(yǎng)液的500 mL三角瓶內(nèi)，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。用滅菌紗布濾除菌絲，收集孢子液，用無菌水將所得孢子液濃度調至107個/mL孢子，作為接菌母液。取1 mL接菌母液，加入100 mL理查德培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，用于毒素提取試驗。5 d取樣1次，用于檢測培養(yǎng)液FA含量，共計45 d。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（煮熟過濾），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL。PD培養(yǎng)液：馬鈴薯150 g（煮熟過濾），葡萄糖20 g，水1 000 mL。理查德培養(yǎng)液：KNO3 10 g，KH2PO4 5 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，F(xiàn)eCl3 0.02 g，蔗糖50 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.4FOS濾液的HPLC檢測

取少量的HSFO07021菌株理查德培養(yǎng)液，2層鏡頭紙過濾，以濾除菌絲；經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后進行液相色譜分析。色譜柱選用sunfireC18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A和B分別為乙腈、0.1%乙酸水溶液。梯度洗脫程序設置：0～12 min，A ∶B=5 ∶95；12～13 min，A相變化范圍為5%～27%，B相變化范圍為95%～73%；13～16 min，A ∶B=27 ∶73；16～17 min，A相變化范圍為27%～10%，B相變化范圍為73%～90%；17～22 min，A ∶B=10 ∶90；22～23 min，A相變化范圍為10%～5%，B相變化范圍為90%～95%；23～25 min，A ∶B=5 ∶95。流速為 1 mL/min，檢測波長為270 nm，進樣量為10 μL。

1.5FOS粗毒素提取

培養(yǎng)45 d后，取一定量的HSFO07021理查德培養(yǎng)液，用2層紗布過濾，以濾除菌絲；4 000 r/min條件下離心15 min，合并上清液，用于粗毒素提取。用2 mol/L鹽酸溶液調制上清液pH值至最佳條件。選用乙酸乙酯（A）與上清液（B）不同配比溶液進行粗毒素提??；分別合并上層有機相和水相。真空旋轉蒸發(fā)上層有機相，以去除乙酸乙酯，獲得FOS粗毒素。對水相進行檢測，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6FOS毒素主成分的分離與純化

采用Waters LC150半制備液相色譜儀對FOS濾液進行分離和純化。洗脫程序參照1.4 FOS濾液的HPLC檢測方法進行。流速為10 mL/min；檢測波長為270 nm；進樣量為 500 μL，特定時間分別對提取物進行收集。將收集到的不同物質溶液分別合并，30 ℃真空旋轉蒸發(fā)，去除部分溶劑后真空凍干。將獲得的物質分別做液質、紅外和核磁共振氫譜分析，確定物質結構。

1.7FOS毒素主要成分對芝麻毒性分析

挑選豫芝11號芝麻種子各500粒，用清水沖洗種子表面5 min。3%次氯酸鈉浸泡種子10 min后，用無菌水沖洗種子3～4次；將消毒后的種子放入裝有10 mL無菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)24 h。挑選露白的芝麻種子，分別接種在加有 5 μg/mL FA或9，10-脫氫FA的MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃、光—暗周期14 h—10 h下培養(yǎng)。每個處理設置3個重復，每個重復接種6粒種子，2周后調查芝麻幼苗及根生長情況，拍照記錄。

2結果與分析

2.1尖孢鐮刀菌芝麻?；团囵B(yǎng)液毒素成分檢測

選取尖孢鐮刀菌芝麻?；虷SFO07021菌株，理查德培養(yǎng)液培養(yǎng)45 d，期間進行孢子濃度檢測（圖1），并對菌液濾液進行液相色譜分析（圖2）。結果顯示，在5～45 d培養(yǎng)過程中，理查德培養(yǎng)液中HSFO07021菌株的孢子數(shù)量在8×106～60×106個/mL范圍，孢子生長量有一定的增長；在25 d時，孢子濃度達到最大值。液相色譜分析表明，在保留時間分別是8.461、18.255、19.770 min時， 菌液中存在3種特異物質，

分別命名為物質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。物質保留時間與朱強賓等報道的物質Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[11]較為一致。

2.2尖孢鐮刀菌芝麻?；投舅刂苽渑c鑒定

根據(jù)上述3種物質的液相色譜峰位置，最終確定尖孢鐮刀菌芝麻?；投舅匚镔|Ⅰ的收集時間為5.328～5.980 min（圖3-a）；物質Ⅱ的收集時間是17.520～17.978 min，物質Ⅲ的收集時間為18.321～18.860 min（圖3-b）。

將收集到的上述3種物質溶液分別合并，30 ℃真空旋轉蒸發(fā)去除部分溶劑后，真空凍干，獲得物質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ純品。其中物質Ⅰ為棕黃色黏稠狀液體，物質Ⅱ為微黃色粉末，物質Ⅲ為白色粉末。以FA標準品為對照，將獲得的3種物質進行結構分析。

2.3毒素主要成分結構分析

采用質譜儀對獲得的粗毒素和各純化分離毒素成分進行分析（表1）。結果顯示，物質Ⅰ的質核比值為196.097 3[M+H]+，218.079 0[M+Na]+；物質Ⅱ的質核比值為 178.086 8[M+H]+；物質Ⅲ的質核比值為180.102 4[M+H]+。3種物質的摩爾質量分別是195.097 3、177.086 8、179.094 6 g/mol，分子式分別為C10H13NO3、C10H11NO2和 C10H13NO2。

因物質Ⅰ獲取量過少、純度較低，我們隨后對物質Ⅱ、Ⅲ開展了傅立葉紅外光譜儀分析。對比結果顯示，F(xiàn)A標品（圖4-a）在2 957.44、2 858.88、1 463.92 cm-1處有吸收峰，結構中存在甲基；物質Ⅱ（圖4-b）在3 079.22～3 004.55、1 639.28、1 535.71、1 309.45 cm-1處有特異的吸收峰，表明分子結構中存在端基烯烴鍵。比較發(fā)現(xiàn)物質Ⅲ（圖4-c）的峰位與FA完全一致，因此可以判定物質Ⅲ與鐮刀菌酸標準品完全相同。

為確定上述3種物質的結構，進一步進行了核磁共振氫譜信息分析（圖5）。

與鐮刀菌酸標準品的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)比對，確定物質Ⅰ結構為10-羥基鐮刀菌酸（10-OH-FA）。該物質常溫下為黏液狀，可能與溶劑殘留較多有關。物質Ⅱ結構為9，10-脫氫FA，純度約98%。物質Ⅲ核磁共振氫譜數(shù)據(jù)與標準品FA數(shù)據(jù)完全相同，再次確定該物質為鐮刀菌酸FA，純度>98%。

根據(jù)上述結果，最終確定上述3種毒素主成分分別為鐮刀菌酸（FA）、9，10-脫氫鐮刀菌酸（9，10-脫氫FA）和10-羥基鐮刀菌酸（10-OH-FA）。結構見圖6。

2.4FOS毒素主要成分的毒性分析

為判定FOS毒素主要成分對芝麻的毒害作用，采用HSFO7021菌液制備的FA和9，10-脫氫FA純品進行了芝麻幼苗處理。由圖7可知，對照中芝麻幼苗處于1對真葉期，根生長正常（圖7-a、圖7-d）。與對照相比，在5 μg/mL FA

和5 μg/mL 9，10-脫氫FA處理2周后，F(xiàn)A處理組植株真葉尚未展開，生長遲緩（圖7-b、圖7-c）；9，10-脫氫FA處理組根伸長緩慢（圖7-e）或尚未長出（圖7-f）。結果表明，F(xiàn)A和9，10-脫氫FA毒素對芝麻有毒害作用；相對于FA，9，10-脫氫FA毒素處理對芝麻莖葉生長和根伸長的抑制程度弱。

3結論與討論

為評價尖孢鐮刀菌芝麻?；彤a(chǎn)生毒素的種類和水平，本研究利用建立的高效乙酸乙酯萃取方法和分離方法，首次從HSFO7021菌液中制備出了鐮刀菌酸、9，10-脫氫鐮刀菌酸和10-羥基鐮刀菌酸等3種FOS毒素，研究結果為后續(xù)的芝麻枯萎病菌致病機理及芝麻抗病機理研究奠定了技術和材料基礎。在鐮刀菌毒素提取方面，目前主要選用活性炭吸附法[12，15]、活性炭吸附萃取法[16]和乙酸乙酯萃取法[13]進行。Lffler等發(fā)現(xiàn)引起百合莖腐病的尖孢鐮刀菌可以產(chǎn)生鐮刀菌酸，并采用反相HPLC法和GC-MS法成功測定了粗毒素中鐮刀菌酸的含量[17]。Amalfitano等建立了鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸（FA-2H）及其甲酯化物的液相快速檢測方法[18]。在毒素分離方面，通用的方法為TLC（thin layer chromatography）法和柱色譜法[14]。但是由于該方法操作繁瑣，且物質獲取量小、成功率低，毒素分離應用受到限制。本研究借助于半制備液相色譜儀，結合液相檢測方法，最終確定用5%乙腈水溶液溶解粗毒素，以改進液相分離方法，從而成功建立了FOS毒素制備及分離方法。與原洗脫程序相比，新方法在毒素分離方面節(jié)省了時間，且樣品分離效率得到顯著提高（數(shù)據(jù)未公開）。

鐮刀菌酸是一種非特異性真菌毒素，可以由許多鐮刀菌屬種類產(chǎn)生，可加速植物的枯萎。除鐮刀菌酸外，亦有學者從鐮刀菌的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)了其他鐮刀菌酸類似物。Cappaso等首次從Fusarium nygamai菌株濾液中發(fā)現(xiàn)并分離出了FA和9，10-脫氫FA甲酯化物。處理后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A甲酯化物可導致番茄葉片變黃并迅速壞死，并能嚴重抑制根的生長[19]。近期朱強賓等研究結果顯示，采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)弱致病力菌株HSFO07021和強致病力菌株HSFO09100，不同菌株形成峰的數(shù)量有顯著差異[11]。檢測發(fā)現(xiàn)HSFO07021菌液有4種峰物質存在。本研究從HSFO07021菌株的理查德培養(yǎng)液濾液中檢測到了10-羥基鐮刀菌酸（物質Ⅰ）、9，10-脫氫鐮刀菌酸（物質Ⅱ）和鐮刀菌酸（物質Ⅲ）等3種主成分（圖2），純品收集時間分別為5.328～5.980 min、17.520～17.978 min和 18.321～18.860 min（圖2）。結構檢測進一步表明，以上3種物質分別對應了朱強賓等預測的物質Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[11]。研究首

次確定，尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株產(chǎn)生的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸2種毒素均對芝麻幼苗生長發(fā)育有抑制作用，且毒害水平有一定差異（圖7）。Bani等通過葉片穿刺試驗，證實了FA和9，10-脫氫FA對豌豆葉均表現(xiàn)出了高毒害活性[14]。Stipanovic開展了鐮刀菌酸、吡啶甲酸及其類似物對棉花子葉的生物測定試驗，研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌酸甲酯化物的毒性最高[20]。為明確芝麻枯萎病菌致病機理，下一步我們將深入開展FA及其類似物的毒害機理研究，以最終實現(xiàn)對芝麻枯萎病害的高效防控。

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