陳海蘭++蒙西南++趙尉丹+付遠妨+韋雅妮++胡庭俊

摘要：通過觀察雞血藤總黃酮乙酸乙酯部位（FEA）預(yù)處理和后處理對大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激RAW264.7細胞所致氧化應(yīng)激的影響，探討其抗應(yīng)激活性。試驗將細胞分為空白對照組、LPS刺激組、LPS+陽性藥物組（維生素C）、LPS+不同濃度FEA組（25、50、100、200 μg/mL）。試驗1的細胞先用藥物預(yù)處理12 h，再用LPS進行刺激；試驗2則先用LPS刺激2 h后，再用藥物進行處理。分別采用Griess法和熒光探針法檢測NO分泌和活性氧（ROS）水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EA預(yù)處理和后處理均能顯著抑制LPS刺激引起的NO和ROS水平的升高（P<0.05），且后處理效果更明顯。因此，F(xiàn)EA具有良好的抗氧化應(yīng)激活性，且作為治療藥物比作為預(yù)防藥物效果更佳。

關(guān)鍵詞：雞血藤總黃酮；乙酸乙酯部位；脂多糖；氧化應(yīng)激；免疫細胞

中圖分類號： R285.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0154-03

近年來，我國規(guī)?；B(yǎng)殖迅猛發(fā)展，在給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來革命性變化的同時，畜禽應(yīng)激綜合征的問題也開始顯現(xiàn)。飼養(yǎng)管理、環(huán)境變化、飼料營養(yǎng)、免疫治療和運輸?shù)染鶗箘游锂a(chǎn)生應(yīng)激，引起氧化損傷[1]。大量研究表明，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致動物采食量下降、生長發(fā)育和抗病力降低、死亡率增高，并顯著降低畜產(chǎn)品品質(zhì)[1]。因此，如何預(yù)防或降低規(guī)?；B(yǎng)殖中畜禽的應(yīng)激反應(yīng)具有重要意義。

雞血藤為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤莖，分布于廣西、云南、廣東、貴州、福建等地區(qū)，主產(chǎn)于廣西，以廣西產(chǎn)者為道地藥材[2]。黃酮類化合物是雞血藤的主要活性成分，主要包括異黃酮類、異黃烷類、二氫黃酮類、花青素類、查爾酮類等[3-4]。雞血藤總黃酮可依次采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑進行萃取分離，研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物中黃酮化合物的含量最高[5]。雞血藤具有活血補血、調(diào)經(jīng)止痛、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[6-9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤總黃酮具有很強的自由基清除作用，可有效抑制Fenton體系誘導(dǎo)的大鼠心、肝、腎丙二醛（MDA）生成，抑制H2O2誘發(fā)的大鼠紅細胞氧化溶血，通過清除·OH、O2-及H2O2發(fā)揮抗氧化作用。雞血藤黃酮的強抗氧能力，使它在消除氧化應(yīng)激、增強機體免疫力、提高抗病能力方面有很大的應(yīng)用潛能。然而，目前國內(nèi)外對雞血藤黃酮抗氧化能力的研究多集中在雞血藤的提取物上，并以體外清除自由基能力檢測為主，而對雞血藤進一步純化產(chǎn)物及在細胞水平上的研究還比較少。

本試驗采用乙醇提取法從廣西產(chǎn)雞血藤中得到雞血藤總黃酮，通過有機溶劑萃取法對其進行初步分離，經(jīng)濃縮干燥后得到雞血藤總黃酮乙酸乙酯部位（FEA），然后對FEA的細胞毒性及其預(yù)處理、后處理對大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激RAW264.7細胞所致氧化應(yīng)激的影響，探討其細胞安全性及抗應(yīng)激活性，為雞血藤的進一步開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗細胞小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

1.1.2藥品與試劑雞血藤飲片，購自南寧市中堯路中藥材市場，產(chǎn)地為廣西崇左市，經(jīng)廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實驗室鑒定為雞血藤正品。藥材飲片經(jīng)粉碎成中細粉后（過4號篩），采用乙醇提取法，以50%乙醇溶液為溶劑，在 1 g ∶30 mL 料液比和80 ℃條件下提取3 h。提取液經(jīng)過濾、濃縮、初步純化后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，并對乙酸乙酯萃取液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑得到棕黃色粉末，即為雞血藤黃酮乙酸乙酯部位（FEA）。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、維生素C（VC）、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、大腸桿菌脂多糖（LPS）、亞硝酸鈉（NaNO2）、萘乙烯二胺和對氨基苯磺酸，均購自美國Sigma公司，胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)液、青鏈霉素（PS），均購自Gibco公司。

1.2試驗內(nèi)容與方法

1.2.1FEA的細胞毒性研究將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以1×105個/mL的濃度接種于96孔板中，100 μL/孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，棄去上清液，每孔加入 90 μL 新鮮培養(yǎng)液和10 μL不同濃度的FEA溶液，使其終濃度為50、100、200、400、800 μg/mL。同時設(shè)對照組，加入 90 μL 新鮮培養(yǎng)液和10 μL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。每個處理設(shè)4個重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去含藥培養(yǎng)液，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 mL MTT儲存液（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h后，每孔加入100 μL MTT結(jié)晶溶解液[10%十二烷基硫酸鈉（SDS），10 mmol/L HCl]，37 ℃孵育過夜，使紫色結(jié)晶充分溶解，用多功能酶標儀檢測D595 nm，并根據(jù)以下公式計算細胞相對活性：

細胞相對活性=D試驗-D空白1D對照-D空白×100%。

1.2.2FEA預(yù)處理對LPS刺激免疫細胞氧化應(yīng)激的作用取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以1×105 個/mL的濃度接種于96孔板中，100 μL/孔，并分為對照組、LPS組、VC100組、FEA25組、FEA50組、FEA100組和FEA200組，每個處理組設(shè)4個重復(fù)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，棄去上清液，對照組每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL PBS，VC100組每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL 1 000 μg/mL VC溶液，F(xiàn)EA25～FEA200組每孔分別加入100 μL終濃度為25、50、100、200 μg/mL 的FEA溶液。藥物處理12 h后，棄去上清液，除對照組外，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS溶液。刺激2 h后，棄去含LPS培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液（100 μL/孔）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，檢測上清液中NO濃度及細胞中活性氧（reactive oxygen， 簡稱ROS）水平。

1.2.3FEA后處理對LPS刺激免疫細胞氧化應(yīng)激的作用取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以1×105 個/mL的濃度接種于96孔板中，100 μL/孔，分組方式同“1.2.2”節(jié)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，棄去上清液，除對照組外，每孔加入終濃度為1 μg/mL的LPS溶液。刺激2 h后，棄去上清液，對照組每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL PBS，VC100組每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL 1 000 μg/mL VC溶液，F(xiàn)EA25～FEA200組每孔分別加入100 μL終濃度為25、50、100、200 μg/mL的FEA溶液。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，檢測上清液中NO濃度及細胞中ROS水平。

1.2.4NO濃度的檢測稱取6.9 mg NaNO2加入100 mL超純水中溶解，配成1 mmol/L的儲存液。用NaNO2儲存液配制濃度為100、80、60、40、20、0 μmol/L的標準稀釋液，各取 100 μL，加入100 μL Griess試劑（等體積混合的0.1%萘乙烯二胺和1%對氨基苯磺酸），振蕩，室溫避光反應(yīng)10 min，于多功能酶標儀上檢測D550 nm，并以NaNO2濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線。

取100 μL細胞上清液，加入100 μL Griess試劑測定D550 nm作對照，并根據(jù)NaNO2標準曲線計算NO濃度。

1.2.5ROS水平的檢測棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞3次，每孔加入50 μL 10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37 ℃、5% CO2孵育30 min，每10 min輕輕搖勻1次。孵育結(jié)束后，棄上清液，用PBS洗滌3次，于多功能酶標儀激發(fā)波長488、525 nm處檢測熒光強度。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法，進行LSD組間比較，結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示。

2結(jié)果與分析

2.1細胞毒性作用研究

用不同濃度的FEA處理RAW264.7細胞后，利用MTT法檢測細胞活性以分析FEA的細胞毒性作用。由圖1可見，當(dāng)FEA濃度≤200 μg/mL 時，細胞存活率均接近對照組；隨著FEA濃度的增大，細胞活性逐漸下降，當(dāng)FEA濃度 ≥400 μg/mL 時，細胞活性顯著或極顯著低于對照組。因此，F(xiàn)EA的安全濃度范圍為0～200 μg/mL，在此范圍內(nèi)對RAW264.7細胞的生長無不良影響。

2.2FEA預(yù)處理對LPS刺激免疫細胞氧化應(yīng)激的作用

為了探討FEA對氧化應(yīng)激的預(yù)防作用，RAW264.7細胞先用系列濃度的FEA處理12 h，然后用LPS刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，再對NO分泌水平和ROS水平進行分析。由圖2可知，LPS刺激4 h后，NO分泌水平有所升高，但是與對照組相比差異不顯著；與模型組（LPS）比較，F(xiàn)EA預(yù)處理可以降低NO分泌水平，且在25、200 μg/mL時，差異極顯著（P<001）。從圖3可以看出，LPS刺激后，RAW264.7細胞內(nèi)的ROS水平顯著升高（P<0.05），而FEA預(yù)處理則可以顯著降低ROS水平，在FEA濃度為100 μg/mL時差異極顯著（P<0.01）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)EA預(yù)處理對于預(yù)防LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有一定的保護作用。

2.3FEA對LPS刺激免疫細胞氧化應(yīng)激的作用

進一步研究FEA對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞氧化應(yīng)激

的治療作用。與預(yù)防試驗不同的是，本試驗先用LPS刺激RAW264.7細胞建立氧化應(yīng)激模型，然后用不同濃度的FEA處理細胞，通過檢測NO、ROS水平的變化，分析其抗氧化應(yīng)激作用。由圖4、圖5可知，LPS刺激RAW264.7細胞后，NO、ROS水平均極顯著升高（P<0.01），表明免疫細胞氧化應(yīng)激模型已成功建立。相比于模型組，經(jīng)VC或25～200 μg/mL的FEA處理后，NO水平均極顯著下降（P<0.01），且較高濃度的FEA（50～200 μg/mL）可同時顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）下調(diào)ROS水平。因此，F(xiàn)EA后處理對于LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激具有良好的抑制作用，效果與對照藥物VC相當(dāng)。

3討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激是指機體遭受各種有害刺激時，機體內(nèi)的活潑分子如活性氧自由基（reactive oxygen free radicals）產(chǎn)生并堆積，超過了動物機體對過氧化物的清除能力，致使機體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[10]?；钚匝跏呛醒醴肿拥淖杂苫?，包括超氧陰離子（ O-2· ）、過氧化氫（H2O2）、次氯酸離子（OCl-）和一氧化氮（NO）。ROS含有的不成對電子使其具有很強的反應(yīng)活性，極易攻擊DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子，造成機體組織的氧化損傷，加速機體的衰老，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致各種慢性疾病的發(fā)生[11-12]。當(dāng)機體受到刺激時，細胞內(nèi)成分轉(zhuǎn)移至細胞膜的內(nèi)表面，形成具有NADPH氧化酶活性的完全活性酶復(fù)合物，進而催化ROS的生成[13]。脂多糖是介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征的主要啟動因子，它可激活單核細胞和巨噬細胞，引起NO和炎性細胞因子的合成與釋放，進而導(dǎo)致機體一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。

本試驗中，首先通過MTT法研究了FEA的細胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)其細胞毒性較低，在≤200 μg/mL范圍內(nèi)對RAW264.7細胞的生長無明顯不良影響。然后，通過預(yù)防試驗和治療試驗探討了FEA的抗氧化應(yīng)激活性。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激RAW264.7細胞后，NO、ROS水平明顯上升，提示氧化應(yīng)激的發(fā)生。FEA預(yù)處理和后處理，基本能不同程度抑制LPS刺激引起的NO和ROS產(chǎn)生，表明FEA能夠改善RAW264.7細胞氧化應(yīng)激損傷，與黃酮類化合物較強的自由基清除能力和抗氧化能力相關(guān)，并與黃酮類化合物可通過抑制炎癥因子（NO、TNF-α等）的釋放降低細胞氧化損傷的報道[16-17]相一致。另外，相比于藥物預(yù)處理（預(yù)防試驗），先造成氧化應(yīng)激再用藥物處理（治療試驗），F(xiàn)EA的作用更加明顯。治療試驗中，NO、ROS水平均顯著或極顯著低于LPS刺激組（P<0.05或P<0.01），表明在抗應(yīng)激反應(yīng)中，F(xiàn)EA更適宜作為治療藥物使用。

綜上所述，本試驗先通過MTT法檢測了FEA的細胞毒性，然后通過分析FEA預(yù)處理或后處理對LPS刺激RAW264.7細胞NO、ROS分泌水平的影響，探討了其抗氧化應(yīng)激作用。試驗觀察到FEA在0～200 μg/mL濃度內(nèi)對RAW264.7細胞的生長無明顯不良影響，能顯著或極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且后處理比預(yù)處理細胞對LPS誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用更明顯，表明FEA更適合作為治療藥物用于抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。

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