馬大勇++蔡舒婷+++張斐姝+++高強+++馬克信+++韓振蘊

[摘要] 目的 觀察參知健腦膠囊單次灌胃對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響。 方法 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠，共4項試驗，分別是自主活動、體溫和抓力試驗以及戊巴比妥鈉閾下催眠試驗。其中，自主活動、體溫和抓力試驗共用40只小鼠，采用區(qū)組隨機方法分為參知健腦膠囊低劑量組、中劑量組和高劑量組（60、180、540 mg/kg）和陰性對照組（滅菌注射用水），每組各10只，雌雄各半。灌胃給藥，于給藥后（90±5）min、24 h±5 min進(jìn)行一般行為觀察及自主活動試驗；給藥后（90±15）min、24 h±15 min進(jìn)行抓力測試；給藥后（90±20）min、24 h±20 min進(jìn)行體溫測試。戊巴比妥鈉閾下催眠試驗共用50只小鼠，采用區(qū)組隨機方法分為參知健腦膠囊低劑量組、中劑量組和高劑量組（60、180、540 mg/kg）、陰性對照組（灌胃給予滅菌注射用水）和陽性對照組（腹腔注射地西泮注射液），每組各10只，雌雄各半。陽性對照組于給藥后（30±5）min腹腔注射戊巴比妥鈉，其余各組于給藥后（90±5）min腹腔注射戊巴比妥鈉，均測試給藥后30 min內(nèi)小鼠翻正反射消失數(shù)。 結(jié)果 給藥后的90 min內(nèi)和24 h內(nèi)觀察，動物一般行為、姿勢、步態(tài)、流涎、肌顫、瞳孔未見異常。參知健腦膠囊各劑量組小鼠的自主活動數(shù)、小鼠抓力、體溫和翻正反射消失數(shù)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。戊巴比妥鈉閾下催眠試驗中陰性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組動物均未出現(xiàn)翻正反射消失，陽性對照組10只動物翻正反射全部消失。 結(jié)論 在本試驗條件下，參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠，在60、180、540 mg/kg劑量范圍內(nèi)對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能無明顯影響，與戊巴比妥鈉無協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞] 參知健腦膠囊；小鼠；單次灌胃；安全藥理學(xué)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)

[中圖分類號] R977 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0008-05

Effects of Shenzhijiannao Capsules on the central nervous system in mice at single-pass administration

1.Department of Neurology， Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China； 2.Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3.Geriatric Department， Eye Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100040， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Shenzhijiannao Capsules on the central nervous system in mice after single-pass administration. Methods There were four tests after single-pass administration， which respectively were autonomic activity， body temperature， the holding power， and nembutal subthreshold hypnotic tests. 40 mice were shared in autonomic activity， body temperature and the holding power tests， and according to block random method they were divided into four groups by low-dose group， middle-dose group and high-dose group of Shenzhijiannao Capsules （60， 180， 540 mg/kg） and negative control group （sterile water for injection）， with 10 animals in each group， all half male and female. The general behavior observation and autonomic activity test were executed （90±5）min， 24 h±5 min after intragastric administration， the holding power test were executed （90±15） min， 24 h±15 min after intragastric administration， and body temperature test （90±20） min， 24 h±20 min. 50 mice were observed in nembutal subthreshold hypnotic test， and according to block random method they were divided into five groups by low-dose group， middle-dose group and high-dose group of Shenzhijiannao Capsules （60， 180， 540 mg/kg）， negative control group （sterile water for injection） and positive control group （diazepam injection by intraperitoneal injection）， with 10 animals in each group， all half male and female. Pentobarbital sodium were intraperitoneal injected （30±5） min after diazepam injection by intraperitoneal injection for positive control group， and other groups were injected （90±5）min after intragastric administration. Then the areflexia number of righting reflex were recorded 30 min after administration. Results There were nothing abnormal detected including general behavior， posture， gait， salivation， muscle tremors， pupils， at the time of 90 min and 24 h after administration. There were no significant difference found among each test article group and negative control group in the aspects of the number of autonomic activities， holding power and the temperature （P > 0.05）. In the nembutal subthreshold hypnotic test， the righting reflex of the positive control group was disappeared， while the righting reflex of other groups was existed. Conclusion Under this experimental condition， there are no significant effects on the central nervous system in mice found after Shenzhijiannao Capsules single-pass intragastric administration at the doses of 60， 180， 540 mg/kg， and there is no synergy with sodium pentobarbital.

[Key words] Shenzhijiannao Capsules； Mice； Single-pass administration； Safety pharmacology； Central nervous system

隨著腦血管病發(fā)病率的逐年增高，血管性癡呆（VD）的患病率也相應(yīng)提高[1]，目前北京地區(qū)VD的患病率達(dá)1.5%[2]。目前VD的治療手段有限，西藥作用靶點單一，療效難以滿足患者的需求。發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點優(yōu)勢，優(yōu)化組方配伍，開發(fā)有效治療VD的現(xiàn)代中藥是擺在中醫(yī)藥工作者面前的一項重要課題。參知健腦膠囊由人參、知母、赤芍等藥物提取物按一定比例優(yōu)化配伍而成[3]，具有扶正、通絡(luò)、解毒的功效，是以王永炎等[4-5]提出的“正虛毒損絡(luò)阻”VD創(chuàng)新病因病機理論為基礎(chǔ)研發(fā)而來。本研究旨在觀察參知健腦膠囊單次灌胃對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響，為本藥物的臨床應(yīng)用提供可靠的安全藥理毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

參知健腦膠囊，批號：20100907，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，臨床擬用劑量：1.05 g/（人·d），口服，療程6個月；滅菌注射用水，500 mL/瓶，批號：20100901，由北京立時達(dá)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；陽性對照藥物為地西泮注射液，10 mg/2 mL/支，批號：100811，由貴州光正制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)；戊巴比妥鈉，批號：100808，25 g/瓶，北京化學(xué)試劑公司德國進(jìn)口分裝。

1.2 實驗儀器

ZIL-2小鼠自主活動儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品；YLS-13A大小鼠抓力測定儀，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；KF-201電子體溫計，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

4～5周齡SPF級昆明小鼠100只，雌雄各半，雌性：21.0～25.4g，雄性：20.8～24.2g，購于中國藥品生物制品檢定所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0017，簽發(fā)單位：北京市科學(xué)技術(shù)委員會，動物合格證編號：0200278。實驗動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2009-0024。雌雄分養(yǎng)，每盒飼養(yǎng)同性別5只動物；室溫23.8～24.10℃，濕度51.9%～556.3%，實際光照12 h明暗交替，墊料每周更換2次，同時更換飼養(yǎng)盒，異常情況時隨時更換飼養(yǎng)盒。每天更換高壓消毒過的飲水瓶和瓶塞，每周清洗消毒籠架1次。每天用0.1%新潔爾滅或0.5%的84消毒液交叉消毒地面和墻面，兩種消毒液每周進(jìn)行1次交叉使用。所有換洗的籠具清洗過后均采用高壓滅菌。

1.4 動物分組方法

采用區(qū)段隨機分組法，將符合要求檢疫合格體重接近的動物按性別、體重區(qū)段分為兩組，將每個性別小鼠按體重從小到大排序，以每5個數(shù)為1個組，按照隨機數(shù)的大小給與對應(yīng)的組別，將動物分組，給出正式動物號，確定每組動物。

1.5 實驗設(shè)計

1.5.1 劑量設(shè)計 根據(jù)急毒預(yù)試驗結(jié)果、動物給藥體積等因素綜合考慮，設(shè)計劑量見表1：

1.5.2 動物分組

試驗共用90只動物，40只動物按性別區(qū)段隨機分為4組（對照、低、中、高），每組10只，均雌雄各半，用于行為觀察、自主活動、抓力及體溫測試。另外50只動物按性別區(qū)段隨機分為5組（陰性、低、中、高、陽性），每組10只，均雌雄各半，用于閾下劑量催眠試驗。

1.5.3 給藥途徑及方法

使用一次性1 mL無菌注射器準(zhǔn)確抽取所需溶液，陰性對照組和參知健腦膠囊低、中、高三個劑量組均用12號灌胃針灌胃給藥。陽性對照組采用腹腔注射。陰性對照組：直接使用市售制劑，無需配制。供試品組：稱取適量的供試品，用滅菌注射用水溶解，配制濃度為6、18、54 mg/mL的供試品溶液。溶解后的供試品常溫保存。

1.6 觀測指標(biāo)及頻率

1.6.1 一般行為觀察 將動物按上述方法分組給藥，于給藥后（90±5）min、24 h±5 min直接觀察給藥后動物一般行為表現(xiàn)、姿勢、步態(tài)、流涎、肌顫及瞳孔等變化。

1.6.2 對正常小鼠自主活動的影響 上述動物于給藥后（90±5）min、24 h±5 min，每輪次將每組各一只小鼠分別放入不同測試箱，同時檢測10 min內(nèi)各組小鼠自主活動數(shù)，兩輪間隔時間為12 min，比較組間結(jié)果。

1.6.3 對正常小鼠抓力的影響 將動物輕輕放在抓力板上，抓住尾巴輕輕向后拉，待動物用力抓牢抓力板后，及時均勻用力后拉，致使動物松爪，儀器會自動測定記錄動物的最大抓力，并伴有音響提示。每只動物測試兩次求平均值，首先測試對照組，依次測試低、中、高劑量組。測試時間為藥后（90±15）min、24 h±15 min。比較組間結(jié)果。

1.6.4 對正常小鼠體溫的影響 在動物按上述分組用藥后（90±20）min、24 h±20 min，將實驗小鼠每輪次每組1只進(jìn)行體溫測定，首先測定對照組，依次為低、中、高劑量組，準(zhǔn)確記錄體溫計顯示屏上的體溫讀數(shù)和測定時間。

1.6.5 對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響 將動物按上述分組給藥，每輪次給予每組3～4只動物，兩輪給藥間隔時間（45±5）min，按給藥輪次，供試品各組每輪動物均于藥后（90±5）min，陽性對照組每輪動物于藥后（90±5）min，分別腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，觀察30 min內(nèi)動物睡眠情況，以出現(xiàn)翻正反射消失為睡眠判斷標(biāo)準(zhǔn)（將動物從俯臥置于仰臥狀態(tài)，動物不能恢復(fù)正常體位，時間大于1 min為翻正反射消失）。如有動物出現(xiàn)翻正反射消失，需記錄出現(xiàn)動物數(shù)及出現(xiàn)睡眠的時間、睡眠消失時間。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用leneve Test進(jìn)行方差齊性檢驗，如果方差齊（P > 0.05），用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較采用Dunnett's test （參數(shù)法）分析，如果方差不齊（P < 0.05），采用Kruskal-Wallis檢驗，非參數(shù)檢驗采用Dunnett's test（非參數(shù)方法）分析；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或確切概率法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠一般行為的影響

給藥后1.5 h內(nèi)和24 h各組動物行為活動自如，未見異常姿勢、步態(tài)，無流涎、肌顫等現(xiàn)象發(fā)生。

2.2 對小鼠自主活動的影響

結(jié)果顯示參知健腦膠囊各劑量組動物的自主活動數(shù)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.3 對正常小鼠抓力的影響

結(jié)果顯示參知健腦膠囊低劑量組、中劑量組和高劑量組動物的抓力值與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 對正常小鼠體溫的影響

結(jié)果顯示參知健腦膠囊各劑量組動物的體溫與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.5 對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

結(jié)果顯示陰性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組動物均未出現(xiàn)翻正反射消失，陽性對照組10只動物翻正反射全部消失。

2.6 影響研究可靠性和造成研究工作偏離實驗方案的異常情況

試驗過程中，未見影響研究可靠性和造成研究工作偏離實驗方案的其他異常情況。

3 討論

人參、知母和赤芍是臨床治療VD的常用藥物，全方具有“扶正、祛毒、通絡(luò)”的作用。人參為五加科草本植物人參的根，具有大補元氣，補肺、脾、心、腎氣，生津，安神益智的功效。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有廣泛的藥理作用，包括抗疲勞、抗應(yīng)激、抗自由基、抗腫瘤、增強免疫力等，其中還能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、提高記憶力[6-12]，可以用來“扶正”，但久服亦可出現(xiàn)脘腹脹滿、食欲減退、初感外邪而無虛證時若投人參，也可使表邪久滯不去，加重病情[13]。知母，苦、寒、無毒，為百合科植物知母的根莖，能清熱降火，滋陰潤燥。研究發(fā)現(xiàn)，知母皂苷能夠抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、降血壓、降血糖及降血脂，另外還能抗腦缺血，改善記憶力、防治老年癡呆[14-18]，可以用來“清熱以祛毒”，該藥臨床安全性高，曾有研究表明知母水提取液的小鼠經(jīng)口最大耐受量為生藥35.0 g/kg，相當(dāng)于人用量的145～291倍，知母乙醇提取液的的小鼠經(jīng)口最大耐受量為生藥37.5 g/kg，相當(dāng)于人用量的156～312倍[19]。赤芍，苦，微寒，歸肝經(jīng)，清熱涼血，散瘀止痛。研究發(fā)現(xiàn)，赤芍化學(xué)成分除了具有保肝、抗凝血、抗血栓、抗炎、抗氧化等作用外，還有神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、改善學(xué)習(xí)記憶的作用，可以用以“散瘀涼血，以通腦絡(luò)”[20-22]，但過量服用可有心悸、頭暈等不良反應(yīng)[23]。

參知健腦方是范吉平教授以王永炎等[4-5]提出的“正虛毒損絡(luò)阻”VD創(chuàng)新病因病機理論為基礎(chǔ)，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，并根據(jù)前期研究基礎(chǔ)[3]優(yōu)化組方而成。既往臨床經(jīng)驗表明，該方劑治療輕中度VD有較好的臨床療效，未見有明顯的不良反應(yīng)。

本研究是參知健腦膠囊單次灌胃對小鼠中樞神經(jīng)影響的安全藥理實驗，結(jié)果表明，在本實驗條件下，參知健腦膠囊以60、180、540 mg/kg灌胃給予小鼠，給藥后小鼠一般行為表現(xiàn)、姿勢、步態(tài)等未見異常，各劑量組給藥動物的自主活動數(shù)，攀網(wǎng)活動及戊巴比妥鈉閾下催眠引起的翻正反射消失數(shù)與陰性對照組比較均無顯著差異。故可以認(rèn)為，參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠，在60、180、540 mg/kg劑量范圍內(nèi)對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響，與戊巴比妥鈉無協(xié)同作用，具有較好的安全性。

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（收稿日期：2016-11-21 本文編輯：李岳澤）