毛新新，侯小東，杜詠梅，袁曉龍，顏培珍，

董維杰1,2，張繼旭1,3，王紅剛1,3，張忠鋒1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京，100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學，青島266109）

煙草α-西柏三烯二醇的分離及抑制HepG2細胞活性研究

毛新新1,2，侯小東1，杜詠梅1，袁曉龍1，顏培珍1，

董維杰1,2，張繼旭1,3，王紅剛1,3，張忠鋒1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京，100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學，青島266109）

為挖掘煙草中α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（α-CBD）在抗腫瘤活性方面的應用價值，從煙花中提取并分離獲得α-CBD，以HepG2腫瘤細胞為材料，在體外培養(yǎng)條件下，分別應用噻唑藍（MTT）法、集落形成試驗和吉姆薩染色法研究了不同質(zhì)量濃度（2.5～80 mg/L）的α-CBD對HepG2細胞增殖、生長和形態(tài)變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-CBD具有抑制HepG2細胞株增殖、降低細胞克隆形成并使細胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)的作用。說明煙草α-CBD具有抑制腫瘤細胞生長的活性，具有深度開發(fā)利用價值。

煙草；α-西柏三烯二醇；分離；抑制HepG2細胞活性

我國歷代本草及國內(nèi)外醫(yī)藥文獻均對煙草的藥用價值進行過論述，現(xiàn)代煙草化學研究表明，煙草中富含茄尼醇、綠原酸、西松烷二萜等具有重要醫(yī)藥、保健功能的活性成分[1]。

在我國，煙草主要是作為工業(yè)原料用于卷煙生產(chǎn)，研究其主要化學成分的活性及用途，使其向食品、保健品、醫(yī)藥等行業(yè)發(fā)展，有利于煙草種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，發(fā)揮其潛在價值，具有十分重要的意義。

西松烷型二萜（cembranoid type diterpenes）是一種大環(huán)二萜類天然活性成分，由4個異戊二烯單元首尾相連組成，具有十四元環(huán)與3個對稱分布的甲基和1個異丙基的母體骨架[2]。最先在松屬植物和煙草中發(fā)現(xiàn)[3-5]，隨后從海洋生物中發(fā)現(xiàn)了多種該化合物[6]。煙草中的西松烷型二萜更多地存在于葉片和花的表面分泌物中，主要包含西柏三烯二醇[7]。α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇作為同分異構(gòu)體，前者含量更高，是西松烷型二萜最主要的成分[8]，而且具有良好的生物活性。AQIL等[9]研究發(fā)現(xiàn)西柏三烯二醇能夠抑制白念珠菌等真菌以及金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細菌的生長，NACOULMA等[10]研究發(fā)現(xiàn)煙草中的西松烷二萜混合物能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖，MARTINS等[11]證明西柏三烯二醇具有神經(jīng)保護作用。然而，肝細胞癌作為死亡率居世界第二的惡性腫瘤，近年來發(fā)生率逐步上升[12]，煙草中西柏三烯二醇對肝癌HepG2細胞的抑制作用研究卻鮮有報道。為探索煙草中西柏三烯二醇的抗腫瘤活性，充分利用煙草資源，作者從煙草中提取了西柏三烯二醇，以α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇[(1S, 2E, 4S, 6R, 7E, 11E)-2, 7,11-Cembratriene-4,6-diol，α-CBD]為對象，體外作用于肝癌HepG2細胞，探究其抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

煙花樣品于2014年7月采自山東省青島市即墨試驗基地，品種為中煙100。人肝癌HepG2細胞購自中國科學院細胞庫。

Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠（GE Healthcare公司），GF254柱層層析硅膠（青島海洋化工公司），乙醇、正己烷、二氯甲烷，氯仿、丙酮、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），溴化-3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑鹽（MTT，Sigma公司），MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），青鏈霉素雙抗（Gibco公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS, Sigma公司）。

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），Bruker AVIII 600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），Agilent 1260超高速液相色譜儀（Agilent公司），Multiskan FC酶標儀（Thermo公司），T-DH倒置顯微鏡（Nikon公司），HF90二氧化碳培養(yǎng)箱（Heal Force公司），SW-CJ-2FD醫(yī)用超凈臺（Airtech公司），Centrifuge 5424 R低速離心機（Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1 α-CBD的提取、分離 取新鮮煙草花序，用二氯甲烷室溫下浸提3次，每次浸提時間1～2 s，將提取液合并，過濾，濾液以無水硫酸鈉除去水分后減壓濃縮，獲得膏狀粗提物。取粗提物10 g，用300 mL 70%乙醇溶解、離心，傾出上清液，沉淀以300 mL 70%乙醇洗滌2次，將上清液合并，減壓濃縮至300 mL，加入石油醚萃取3次，每次300 mL，將石油醚層合并，濃縮得淺黃色西松烷二萜粗提物。取西松烷二萜粗提物1 g，進行硅膠柱層析分離，層析樣品依次用5：1（V：V）和3：1（V：V）石油醚/乙酸乙酯洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯（3：1，V：V）洗脫液第二餾分，濃縮后再經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/丙酮（5：1，V：V）洗脫分離，獲得無色油狀單體化合物，在中國科學院化學物理研究所通過核磁共振波譜進行結(jié)構(gòu)確認。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與細胞增殖抑制率檢測 人肝癌HepG2細胞用MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素+1%鏈霉素雙抗），置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，按100 μL/孔的量接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h后，試驗組加入α-CBD，使其終濃度為2.5、5、10、20、40、60、80 mg/L，對照組加入完全MEM培養(yǎng)基，每一濃度均設3個復孔，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，吸去上清液，然后每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，用酶聯(lián)免疫測定儀檢測波長為570 nm下每孔的吸光度（A）值[13]，并計算細胞活力抑制率：

介紹一部研究天然氣產(chǎn)業(yè)的專著：《低碳經(jīng)濟下中國天然氣產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略》… ……………… 周 鵬（6．封三）

細胞增殖抑制率=(1-試驗組A570/正常對照A570)×100%。

1.2.3 細胞集落形成能力檢測 按1.2.2培養(yǎng)和收集細胞，并調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)12 h后，根據(jù)MTT檢測結(jié)果，選擇作用較為明顯的濃度，加入α-CBD，設空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用0.25% 胰酶消化并將細胞稀釋至100～1000細胞/mL，接種于培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)2周，吸除培養(yǎng)基，經(jīng)PBS漂洗2遍后，加入10 mL無水甲醇固定10 min，經(jīng)PBS漂洗2遍后，加入10 mL 0.01 mg/L吉姆薩染液染色，拍照并統(tǒng)計集落形成數(shù)[14]。

1.2.4 細胞形態(tài)觀察 按上述方法培養(yǎng)和收集細胞，將HepG2細胞按5×104個/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，加入上述培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HepG2細胞到達對數(shù)期后，用含有不同質(zhì)量濃度的α-CBD培養(yǎng)基進行全換液處理，同種條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，經(jīng)吉姆薩染色，在倒置光學顯微鏡下觀察HepG2細胞的形態(tài)改變[15]。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 α-CBD的結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)核磁共振波譜鑒定（圖1），HR-ESI-MSm/z：329.2460 [M+Na]+，分子式為C20H34O3。1H NMR(400 MHz, measured in CDCl3)：δH 1.72 (1H, m, H-1)，5.36 (1H, dd,J= 8.6, 15.7 Hz, H-2), 5.37 (1H, m, H-3), 2.00 (1H, m, H-5α), 2.01 (1H, m, H-5β), 4.49 (1H, m, H-6), 5.36 (1H, d,J= 8.8 Hz H-7), 1.51 (1H, m, H-9α), 1.99 (1H, m, H-9β), 2.02 (2H, m, H-10), 5.04 (1H, m, H-11), 2.13 (2H, m, H-13), 1.68 (2H, m, H-14), 1.54 (1H, m, H-15), 0.83 (3H, d,J=5.8 Hz, H-16), 0.86 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-17), 1.36 (3H, s, H-18), 1.71 (3H, s, H-19), 1.56 (3H, s, H-20);13C NMR (100 MHz, measured in CDCl3)：δC46.43 (C-1, CH), 127.83 (C-2, CH), 137.58 (C-3, CH), 72.46 (C-4, C), 52.19 (C-5, CH2), 66.38 (C-6, CH), 130.61 (C-7, CH), 136.90 (C-8, C), 38.88 (C-9, CH2), 23.34 (C-10, CH2), 124.43 (C-11, CH), 133.43 (C-12, C), 36.82 (C-13, CH2), 27.97 (C-14, CH2), 33.02 (C-15, CH), 19.35 (C-16, CH3), 20.66 (C-17, CH3), 30.15 (C-18, CH3), 16.08 (C-19, CH3), 15.01 (C-20, CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定化合物為α-CBD。

圖1 α-CBD結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of α-CBD

2.2 α-CBD對HepG2細胞增殖抑制的影響

MTT試驗結(jié)果顯示（表1），α-CBD在體外對HepG2細胞具有明顯的增殖抑制作用。α-CBD處理24 h后，對HepG2細胞的增殖抑制較弱；處理48 h 和72 h后，對HepG2細胞的抑制較強，而質(zhì)量濃度大于60 mg/L時，抑制率變化不明顯。作用48 h、72 h時，α-CBD對HepG2細胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）分別為26.97、22.82 mg/L。

2.3 α-CBD對HepG2細胞集落形成能力的影響

與HepG2細胞對照組形成的克隆相比（圖2），處理組HepG2細胞形成的克隆數(shù)隨α-CBD濃度的增加而減少，20、40、60、80 mg/L濃度下的細胞克隆形成率分別為66.37%、55.16%、28.39%、0.00%。

表1 α-CBD作用于HepG2細胞的增殖抑制率比較（n=3）Table 1 Comparison of prolifetation inhibition effects of HepG2 cells after α-CBD treatment

2.4 α-CBD對HepG2細胞形態(tài)的影響

光學顯微鏡下觀察結(jié)果顯示（圖3），對照組細胞呈梭形、不規(guī)則多邊形，細胞貼壁，生長均勻飽滿；試驗組HepG2細胞經(jīng)質(zhì)量濃度為20、40、60 mg/L的α-CBD處理，吉姆薩染色后，細胞皺縮、變圓、體積縮小，從皿壁脫落，懸浮于培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)凋亡形態(tài)。

圖2 α-CBD對HepG2細胞克隆形成能力的影響Fig. 2 Effects of α-CBD on colony formation of HepG2 cells

圖3 α-CBD處理48 h對HepG2細胞形態(tài)變化的影響Fig. 3 Cell morphology changes of HepG2 cells after α-CBD treatment

3 討 論

大多數(shù)抗腫瘤藥物都能夠抑制敏感腫瘤細胞的增殖，并且其抗腫瘤效果與細胞在藥物誘導下發(fā)生增殖抑制的活性有關(guān)[17]。因此，細胞增殖抑制測定通常作為體外抗腫瘤藥物和臨床腫瘤敏感試驗的第一步。MTT比色法、集落形成試驗分別從細胞活力、克隆抑制能力兩方面測定藥物對腫瘤細胞增殖的抑制活性。在本試驗的MTT比色法中，用IC50值作為衡量藥物的增殖抑制能力的指標，數(shù)值越低，表明細胞對藥物處理越敏感，而藥物的增殖抑制能力越強。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度（2.5、5、10、20、40、60、80 mg/L）的α-CBD均對HepG2細胞增殖具有抑制作用，相比于24 h，作用48 h、72 h后，增殖抑制效果更為顯著。而α-CBD的IC50值相較紫杉醇等抗腫瘤藥物相比仍然較高[18]，說明抑制效果不如紫杉醇，但仍有進一步研究價值。

通過MTT比色試驗，證明α-CBD能夠使細胞活力降低，進一步通過集落形成試驗檢測細胞克隆形成能力。費洪榮等[19]通過此試驗方法測定了40 μmol/L告達庭和100 μg/L TRAIL聯(lián)合應用能夠明顯抑制HepG2細胞增殖，史江穎等[20]證明了谷糠內(nèi)、外殼結(jié)合態(tài)多酚均對HepG2細胞有明顯的抑制效果，孫建超等[21]試驗結(jié)果表明，5、25、50 μmol/L吳茱萸堿處理HepG2細胞，集落數(shù)明顯少于對照組。在本試驗中，隨著α-CBD濃度的增加，HepG2細胞的克隆形成率逐漸降低，說明α-CBD能夠抑制HepG2細胞的克隆形成能力，進而抑制細胞增殖。

惡性腫瘤形成的病理學基礎(chǔ)是腫瘤細胞異常增殖、凋亡嚴重減退而造成的。就細胞調(diào)控機制而言，既需拮抗、抑制腫瘤細胞增殖，又需誘導促使細胞凋亡[22]。目前，許多抗腫瘤藥物的主要作用機制之一就是誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[23]。細胞凋亡主要的表現(xiàn)之一就是形態(tài)學改變，細胞形態(tài)學觀察是判斷細胞凋亡的最基本、最可靠方法[24]。胡琦等[25]用臭牡丹總黃酮、劉麗璇等[26]用丹參酮IIA、劉媛等[27]用海灣扇貝多肽混合物作用HepG2細胞，形態(tài)學觀察結(jié)果顯示細胞出現(xiàn)了細胞皺縮、變圓、體積縮小等凋亡特征。在本試驗中，經(jīng)α-CBD作用后，HepG2細胞發(fā)生的形態(tài)學變化與上述文獻中的凋亡形態(tài)一致，表明α-CBD誘導HepG2細胞發(fā)生了凋亡。

α-CBD是煙草腺毛分泌物的主要化學成分，在煙草中含量豐富，具有豐富的原料資源。本研究表明，α-CBD培養(yǎng)基對HepG2細胞生長具有較好的抑制作用，具有作為先導化合物進行抗腫瘤藥物創(chuàng)制的潛力，下一步還需應用化學或生物手段通過結(jié)構(gòu)修飾進一步增強其對腫瘤細胞的抑制活性并明確其構(gòu)效關(guān)系，為新型抗腫瘤藥物的篩選提供研究基礎(chǔ)，也為煙草活性成分的深度開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

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Isolation and Anti-HepG2 Activity Study of α-cembratriene -diol from Tobacco

MAO Xinxin1,2, HOU Xiaodong1, DU Yongmei1, YUAN Xiaolong1, YAN Peizhen1, DONG Weijie1,2, ZHANG Jixu1,3, WANG Honggang1,3, ZHANG Zhongfeng1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

To investigate the anti-tumour activities of α-2,7,11- cembratriene-4,6 -diol (α-CBD) from tobacco, we isolated α-CBD from tobacco flowers. HepG2 cells were incubated with different concentrations of α-CBDin vitro. The inhibition rate on cell proliferation was determined with methylthiazolyldiphenyl -tetrazolium bromide (MTT) assay and colony formation assay. The change of morphology was observed with inverted microscope after Giemsa’s staining. The results indicated that, α-CBD from tobacco exhibited obvious inhibitive effects on the growth and colony forming rate of HepG2 cells. Typical morphology changes of apoptosis were observed. In summary, α-CBD from tobacco showed anti-tumor effects on HepG2 cells, which would have high value of further development and utilization.

tobacco; α-cembratriene-diol; isolation ; anti-HepG2 activity

TS41+3

1007-5119（2017）03-0080-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.014

中國農(nóng)業(yè)科學煙草研究所青年科學基金“煙草西松烷二萜體外抗腫瘤作用研究”（2015B04）；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）

毛新新（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向為植物功能成分。E-mail：mxxcaas@163.com。*通信作者，E-mail：zhangzhongfeng@caas.cn

2016-09-22

2017-02-04