謝倩 謝崔越

摘要 以鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）為研究對(duì)象，運(yùn)用蛋白酶SM98011酶解螺旋藻粗蛋白提取液，得到具有抗氧化活性的產(chǎn)物。結(jié)果表明，鈍頂螺旋藻酶解的最優(yōu)條件為加酶量1∶15、酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h。在此條件下，螺旋藻酶解產(chǎn)物的清除自由基能力為33.28%。

關(guān)鍵詞 鈍頂螺旋藻；酶解；清除自由基能力

中圖分類號(hào) S986 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0011-02

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Spirulina platensis

XIE Qian1，XIE Cui-yue2 （1.Liaocheng No.1 High School，Liaocheng，Shandong 252000；2.Luxi Quality Inspection Center of Liaocheng Bureau of Quality and Technical Supervision，Liaocheng，Shandong 252000）

Abstract Taking Spirulina platensis as research object，crude protein extract was hydrolyzed with protease SM98011 to obtain antioxidant substances.The results showed that the optimum conditions for enzymatic hydrolysis of Spriulina platensis were as follows：the addition quantity of 1∶15，enzymatic hydrolysis at 50 ℃ for 5 h.Under these conditions，the scavenging capability of enzymatic hydrolysate of Spirulina platensis to free radicals was 33.28%.

Key words Spirulina platensis；Enzymatic hydrolysis；Scavenging capability to free radicals

近年來(lái)，抗衰老研究已成為研究熱點(diǎn)之一[1]。研究表明，增加蔬菜與水果的攝入量可以提高對(duì)一些癌癥的抵抗力，主要是因?yàn)槠涓缓宄杂苫奈镔|(zhì)[2-4]。據(jù)報(bào)道，一些藻類可以阻止或預(yù)防自由基與活性氧造成的機(jī)體損傷，阻止癌細(xì)胞形成以及其他損害的發(fā)生[5]。此外，有學(xué)者從海洋藻類中提取出具有抗氧化和抗癌功能的多糖[6]。Hu等[7]研究表明，從黑角菜屬的海藻和昆布屬等植物中提取的硫酸鹽多糖具有較高的清除自由基活性。從紅藻門植物中提取的金屬卟啉類物質(zhì)可以通過(guò)增加小鼠體內(nèi)抗氧化酶的含量，來(lái)消除脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而達(dá)到延緩衰老的目的[8]。

藻類產(chǎn)品是一種均衡、無(wú)害、自然的產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于食品以及生命科學(xué)研究中[9-10]。海洋藻類品種的多樣性為新藥品的研究提供了多種原料[11-12]。海洋中存在大量的蛋白質(zhì)資源，但很少有關(guān)于藻類水解蛋白的應(yīng)用報(bào)道[13-15]。海洋資源具有廣闊的發(fā)展空間，關(guān)于新的海洋產(chǎn)品復(fù)合物在未來(lái)的醫(yī)學(xué)研究中具有很大的潛力[16]。目前，有多種從藻類中提取生物活性物質(zhì)的方法，而水解法具有其他方法所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，不需要任何有毒的化學(xué)藥品。酶解提取出的物質(zhì)比水提和有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)具有更高的活性[17]。

螺旋藻具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因其細(xì)胞形態(tài)呈螺旋狀而得名，易于水解，目前已有許多關(guān)于螺旋藻酶解反應(yīng)的報(bào)道。螺旋藻中含有極為豐富的營(yíng)養(yǎng)元素，甚至比日常食用的植物類和動(dòng)物類食品的營(yíng)養(yǎng)更加豐富，可作為地球上豐富的營(yíng)養(yǎng)源。螺旋藻除了可作為營(yíng)養(yǎng)豐富的食品外，在螺旋藻的水解產(chǎn)物中還提取出具有降血壓、抗艾滋、抗氧化等的活性物質(zhì)，可增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，在一定程度上替代合成藥品，用于治療人類多種疾病。筆者運(yùn)用山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)并保存的Bacillus sp.SM98011菌株發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶酶解鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），探討鈍頂螺旋藻酶解的優(yōu)化條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和菌株

1.1.1 試驗(yàn)材料。

鈍頂螺旋藻由山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，將螺旋藻藻液按約1∶1的比例與培養(yǎng)基混合，放入5 000 mL玻璃瓶中置于光照培養(yǎng)箱中，白熾燈照明，每天通氣約12 h，溫度控制在28 ℃左右。培養(yǎng)7～8 d后對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成熟螺旋藻進(jìn)行收集。此外，也可不對(duì)螺旋藻培養(yǎng)基通氣，培養(yǎng)21～28 d后對(duì)成熟螺旋藻進(jìn)行收集。清洗后，于-20 ℃下保存。

1.1.2 試驗(yàn)菌株。

試驗(yàn)菌株為山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室收藏菌株Bacillus sp.SM98011，經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)蛋白酶，經(jīng)測(cè)定其催化活力為4 000 U/ mL，可用于酶解反應(yīng)[18]。

1.2 試劑與藥品

α-脫氧核糖（Sigma公司）；FeSO4·7H2O、NaHCO3、K2HPO4、NaCl、CaCl2·2H2O、H2O2、NaH2CO3、Na2HCO3、硫代巴比妥酸、三氯乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī)，由Epppendorff公司生產(chǎn)；722分光光度計(jì)，由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；分光光度計(jì)GeneQuant100，由美國(guó)GE公司生產(chǎn)；多用途水浴恒溫振蕩器DSHZ-3000，由上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 鈍頂螺旋藻的養(yǎng)殖。

螺旋藻培養(yǎng)基采用Zarrouk培養(yǎng)基配方配制：NaHCO3 16.80 g/L、K2HPO4 0.50 g/L、NaNO3 2.50 g/L、NaCl 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、K2SO4 1.00 g/L、CaCl2·2H2O 0.04 g/L、EDTA 0.08 g/L。將鈍頂螺旋藻藻種接種至培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中，每天通氣12 h，用白熾燈照光，溫度控制在（28±2）℃。培養(yǎng)7～8 d，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行螺旋藻收集。收集螺旋藻后，用流動(dòng)的蒸餾水清洗干凈，于-20 ℃下保存，備用。

1.4.2 鈍頂螺旋藻粗蛋白的提取。

螺旋藻收集后，與濃度20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）混合并稀釋至適當(dāng)濃度，反復(fù)凍融，以利于蛋白質(zhì)的釋放。將蛋白液于4 ℃下11 000 r/min離心20 min，上清液即為螺旋藻粗蛋白液，于4 ℃下保存，備用。

1.4.3 蛋白酶 SM98011的培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1.00%，酵母粉0.30%，葡萄糖1.00%，瓊脂1.60%，pH 7.2～7.5。液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米粉2.00%，麩皮1.00%，豆粕2.00%，NaHPO4 0.10%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.10%，Na2CO3 0.10%，pH 7.5，裝液量50 mL/500 mL三角瓶[19]。

蛋白酶SM98011的制備：將Bacillius sp.SM98011接種于液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在32 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)約36 h，確保通氣量。將產(chǎn)酶發(fā)酵液在4 ℃、11 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃下保存，備用。

1.4.4 藻蛋白酶解條件的優(yōu)化。

將凍融后經(jīng)過(guò)離心的螺旋藻粗蛋白各取45 mL裝入500 mL三角瓶中，按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的比例分別加入20 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液（設(shè)為酶解對(duì)照）以及SM98011蛋白酶液，混勻后置于50 ℃水浴搖床中，設(shè)轉(zhuǎn)速為90 r/min，分別混勻酶解，于酶解2、3、4、5、6 h后分別取樣，迅速將樣品置于90 ℃水浴鍋中，保溫10～15 min，使酶滅活。將酶解產(chǎn)物在4 ℃、11 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為酶解液，棄去大顆粒沉淀，收集上清液，于-20 ℃下保存，備用。

1.4.5 清除羥基自由基能力的測(cè)定。采用α-脫氧核糖法[20-21]測(cè)定不同酶解時(shí)間鈍頂螺旋藻的清除自由基能力。

將FeSO4制成母液，同時(shí)將EDTA制成高濃度母液，將二者混合成濃度10 mmol/L的FeSO4-EDTA，并加入少量的還原鐵粉，以防止FeSO4被氧化。取0.2 mL的10 mmol/L FeSO4-EDTA溶液置于具塞試管中，加入0.2 mL的α-脫氧核糖溶液（濃度20 mmol/L），然后加入0.2 mL測(cè)試樣品（不同時(shí)間的酶解液樣品、未酶解樣品），用pH 7.4、20 mmol/L磷酸緩沖液將溶液定容至1.8 mL，再加入0.2 mL的H2O2（10 mmol/L），混勻，將各試管置于37 ℃水浴鍋中保溫1 h。然后，在各試管內(nèi)加入1.0 mL 2.8%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，再加入1.0 mL 1%的硫代巴比妥酸溶液，將溶液混勻后在沸水浴中加熱10 min后顯色，將溶液自然冷卻后（1 h內(nèi)）于532 nm處測(cè)定吸光值（As）。不加樣品，以緩沖液或三蒸水代替測(cè)試樣品，作為對(duì)照，進(jìn)行相同操作處理，測(cè)定其對(duì)比吸光值（Ac）。

按照以下公式計(jì)算樣品的自由基清除能力（SA，單位%）：SA=（Ac-As）/ Ac×100%。

2 結(jié)果與分析

蛋白酶SM98011是由山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提取發(fā)現(xiàn)的，并多次加以利用，在以前的報(bào)道中應(yīng)用SM98011發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的適宜酶解溫度約為50 ℃，其酶解樣品時(shí)反應(yīng)溫度在50 ℃左右[18，22]，所以選取50 ℃作為該試驗(yàn)中酶解溫度。運(yùn)用α-脫氧核糖法測(cè)定不同酶解時(shí)間鈍頂螺旋藻的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同加酶量及不同酶解時(shí)間鈍頂螺旋藻的清除自由基能力比未經(jīng)酶解的對(duì)照樣品強(qiáng)，而當(dāng)加酶量為1∶15時(shí)，酶解5 h的酶解液與其他樣品相比表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，約為33.28%（圖1）。由此可見(jiàn)，鈍頂螺旋藻的最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度50 ℃，蛋白酶SM98011的加酶量為1∶15，酶解時(shí)間5 h。

3 討論

螺旋藻是研究較多的一種高價(jià)值藻類，研究報(bào)道主要集中在其降血壓活性以及其作為自然食品所具有的豐富營(yíng)養(yǎng)，而關(guān)于從螺旋藻粗蛋白的酶解液中提取抗氧化活性物質(zhì)的報(bào)道較少。筆者對(duì)鈍頂螺旋藻粗蛋白酶解液的清除自由基能力進(jìn)行了測(cè)定。

鈍頂螺旋藻經(jīng)多次凍融提取粗蛋白后，用蛋白酶SM98011對(duì)其進(jìn)行酶解。據(jù)報(bào)道，運(yùn)用SM98011發(fā)酵產(chǎn)的蛋白酶酶解樣品時(shí)所用的反應(yīng)溫度在50 ℃左右[18，22]，因此該試驗(yàn)中用50 ℃作為酶解反應(yīng)溫度，將螺旋藻在酶解時(shí)間分別設(shè)為2、3、4、5、6 h，采用α-脫氧核糖法檢測(cè)其抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶解2～6 h鈍頂螺旋藻的清除自由基能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，分別為20.9%、23.5%、27.8%、33.2%、28.7%，均高于未酶解樣品。由此可見(jiàn)，酶解有利于促進(jìn)螺旋藻樣品中具有抗氧化活性物質(zhì)的釋放。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，鈍頂螺旋藻的清除自由基能力呈現(xiàn)先遞增后減小的趨勢(shì)，因此，確定鈍頂螺旋藻的適宜酶解時(shí)間對(duì)螺旋藻中抗氧化物質(zhì)的提取具有較大的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] SCHURER P D N Y.Anti-aging[J].Der hautarzt，2003，54（9）：833-838.

[2] SINGH N，RAJINI P S.Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel[J].Food chemistry，2004，85（4）：611-616.

[3] CHU Y F，SUN J，WU X Z，et al.Antioxidant and antiproliferative activities of common vegetables[J].Journal of agricultural and food chemistry，2002，50（23）： 6910-6916.

[4] COOKE M S，EVANS M D，MISTRY N，et al.Role of dietary antioxidants in the prevention of in vivo oxidative DNA damage[J].Nutrition research reviews，2002，15（1）： 19-41.

[5] SHEIH I C，F(xiàn)ANG T J，WU T K.Isolation and characterisation of a novel angiotensin I-converting enzyme（ACE） inhibitory peptide from the algae protein waste[J].Food chemistry，2009，115（1）：279-284.

[6] RUPE′REZ P，AHRAZEM O，LEAL J A.Potential antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from the edible marine brown seaweed Fucus vesiculosus[J].Journal of agriculture food chemistry，2002，50（4）：840-845.

[7] HU J F，GENG M Y，ZHANG J T，et al.An in vitro study of the structure-activity relationships of sulfated polysaccharide from brown algae to its antioxidant effect[J].Journal of asian natural product reports，2001，3（4）：353-358.

[8] ZHANG Q B，LI N，ZHOU G F，et al.In vivo antioxidant activity of polysaccharide fraction from Porphyra haitanesis（Rhodephyta） in aging mice[J].Pharmacological research，2002，48（2）：151-155.

[9] BOOTH E.Trace elements and seaweeds[C]//DE VIRVILLE A D，F(xiàn)ELDMANN J.Proceeding of the 4th International seaweed symposium.New York：Pergamon Press，1964：385-393.

[10] MUNRO M H G，LUIBRAND R T，BLUNT J W.The search for antiviral and anticancer compounds from marine organisms[J].Bioorganic marine chemistry，1987（1）： 93-176.

[11] MUNRO M H G，BLUNT J W，DUMDEI E J，et al.The discovery and development of marine compounds with pharmaceutical potential[J].Journal of biotechnology，1999，70（1/2/3）： 15-25.

[12] ATHUKORALA Y，JUNG W K，VASANTHAN T，et al.An anticoagulative polysaccharide from an enzymatic hydrolysate of Ecklonia cava[J].Carbohydrate polymers，2006，66（2）：184-191.

[13]SATO M，HOSKAWA T，YAMAGUCHI T，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from wakame （Undaria pinnatifida） and their antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J].Journal agriculture food chemistry，2002，50（21）：6245-6252.

[14] SUETSUNA K，CHEN J R.Identification of antihypertensive peptides from peptic digest of two microalgae，Chlorella vulgaris and Spirulina platensis[J].Marine biotechnology，2001，3（4）：305-309.

[15] SUETSUNA K，NAKANO T.Identification of an antihypertensive peptide from peptic digest of wakame（Undaria pinnatiifida）[J].Journal of nutrition and biochemistry，2000，11（9）：450-454.

[16] MAYER A M S，GUSTAFSON K R.Marine pharmacology in 2003-2004.Anti-tumor and cytotoxic compounds[J].European journal of cancer，2006，42（14）：2241-2270.

[17] HEO S J，PARK E J，LEE K W，et al.Antioxidant activities of enzymatic extracts from brown seaweeds[J].Bioresource technology，2005，96（14）：1613-1623.

[18] HE H L，CHEN X L，LI J W，et al.Taste improvement of refrigerated meat treated with cold-adapted protease[J].Food chemistry，2004，84（2）：307-311.

[19] 張樹政.酶制劑工業(yè)（上）[M].北京：科學(xué)教育出版社，1998.

[20] UCHIYAMA M，MIHARA M.Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test[J].Analytical biochemistry，1978，86（1）：271-278.

[21] PIN～ERO ESTRADA J E，BERMEJO B P，VILLAR DEL FRNSNO A M，Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean extract[J].Il farmaco，2001，56（5/6/7）：497-500.

[22] 師曉棟，何海倫，王運(yùn)濤，等.酶法進(jìn)行海洋低值蛋白資源高值化利用初探[J].海洋科學(xué)，2001，25（3）：4-7.