劉旭 華欲飛 陳業(yè)明

摘要 [目的] 探究浸泡條件與大豆之間的關(guān)系，尋找適合的浸泡條件，為實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。[方法]用Peleg方程，探討了大豆在不同溫度（4～50 ℃）和不同浸泡時間下的吸水動力學(xué)性質(zhì)，并用電泳與質(zhì)譜的方法對浸泡液中蛋白質(zhì)的滲出情況進行分析。[結(jié)果] 吸水過程可以用數(shù)學(xué)模型進行較好地擬合，在大豆的吸水模型中，Peleg方程參數(shù)k1隨溫度升高而減小，是浸泡溫度的多項函數(shù)，說明初始吸水速率與浸泡溫度有關(guān)。大豆在各個溫度浸泡過程中，均有蛋白質(zhì)釋放出，其中分子量為37 kD的蛋白質(zhì)在50 ℃浸泡時大量釋放出，經(jīng)質(zhì)譜鑒定后為堿性7S球蛋白，是一種細胞壁蛋白，其大量釋放出，說明細胞壁被破壞，故50 ℃浸泡吸水速率明顯加快。[結(jié)論] Peleg方程可以較好地描述大豆浸泡過程吸水性質(zhì)，浸泡過程中細胞壁蛋白堿性7S球蛋白大量滲出，細胞壁結(jié)構(gòu)被破壞。

關(guān)鍵詞 大豆；吸水；Peleg方程；浸泡液；蛋白質(zhì)

中圖分類號 TS214.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）18-0077-04

Abstract [Objective] To explore the relationship between soaking conditions and soybean， find suitable soaking conditions and provide theoretical basis for actual production. [Method] Pelegs equation was used to describe the kinetics of water absorption of soybean during soaking at 4 ℃ to 50 ℃ for different duration. The protein exudation in the soaking solution was analyzed by electrophoresis and mass spectrometry. [Result] The result showed high fitting of kinetics to Pelegs equation for predicting the hydration characteristics. This study found that the value of k1 （rate） depended on temperature according to a polynomial function， meaning that the value of the initial rate of hydration was dependent on soaking temperature. Soybean seeds released several proteins during soaking. It was found that the 37 kD protein was identified as the most abundant protein， especially at 50 ℃basic 7S globulin （Bg 7S）， which is the cell wall protein. These meant that the structure of cell wall was destroyed to some extent， which could explain why the release rate was quick at 50 ℃. [Conclusion] Peleg equation can describe the water absorption properties of soybean during soaking process well， 7S globulin exude abundantly and the structure of cell wall is destroyed.

Key words Soybean；Water absorption；Pelegs equation；Soaking solution；Protein

大豆浸泡是豆制品加工的重要步驟，在傳統(tǒng)豆制品加工中浸泡的主要目的是軟化大豆，便于研磨[1]。大豆浸泡過程對水分的吸收程度直接影響大豆的質(zhì)構(gòu)和其在加工過程中的研磨特性。Pan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，大豆的研磨特性只和大豆最后的吸水率有關(guān)，與浸泡條件沒有關(guān)系；高溫浸泡可以顯著縮短浸泡時間，但是當浸泡溫度由30 ℃上升到40 ℃時，浸泡液中固形物損失嚴重。通過測量不同浸泡時間種子質(zhì)量的增加來計算干豆的總吸水率，是評估干豆加工特性的常用方法，并以此為基礎(chǔ)，擬合出大豆吸水方程和參數(shù)[3]。Joshi 等[4]研究了浸泡過程中，扁豆的硬度與吸水率和浸泡溫度有關(guān)，與種子大小和種子質(zhì)量無關(guān)。Peleg方程能較高地對吸水過程進行擬合[5]，且可以通過阿累尼烏斯方程和經(jīng)驗公式來擬合動力學(xué)參數(shù)與溫度的關(guān)系[6]。

大豆在浸泡吸水的同時，大豆中的物質(zhì)也在向外擴散，Kon[7]研究了不同浸泡溫度（20～90 ℃）下，當大豆達到最大吸水率時總固形物、含N物質(zhì)、總糖、低聚糖、Ca、Mg和3種水溶性維生素（硫胺素、核黃素和煙酸）的損失情況，結(jié)果表明，當浸泡溫度小于50 ℃時，損失較少，但當浸泡溫度高于60 ℃時，損失是低溫時的3～4倍。在國內(nèi)研究中，多研究不同浸泡條件所得豆?jié){的性質(zhì)，間接浸泡過程[8-11]，對浸泡過程中的變化研究較少。大豆中的營養(yǎng)物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)的浸出情況對于浸泡過程的研究有重要意義。

筆者主要探索大豆在浸泡過程中吸水動力學(xué)以及蛋白質(zhì)浸出動力學(xué)，為實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。

大豆，市購。甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、考馬斯亮藍G-250、甘油、過硫酸銨、乙酸銨均為分析純；三羥甲基氨基甲烷（Tris）為生化試劑；丙烯酰胺、N，N，-甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED），購于Sigma-Aldrich；精確分子量雙色預(yù)染蛋白標準品，購于Bio-Rad。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；DYY-8C型垂直電泳儀，北京六一儀器廠；GelDoc-ItTS 凝膠成像儀，美國UVP公司；豆?jié){機，九陽股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸泡方法。

大豆→脫皮→挑選→豆液比1∶5浸泡。浸泡溫度4 ℃下，浸泡6、12、15、18、21、24 h；25 ℃下，浸泡2、6、10、12、14、16 h；50 ℃下，浸泡1、2、3、4、5 h。

1.2.2 大豆吸水率的測定。

20 g大豆，去離子水洗2次，濾紙吸干殘余水分，浸泡于100 g浸泡液中，取出不同浸泡溫度和浸泡時間的大豆，將大豆撈出，濾紙擦干，稱重，按公式（1）計算大豆吸水率。

大豆吸水率=Wt-W0W0×100%（1）

式中，Wt為浸泡t時間后大豆質(zhì)量（g）；

W0為浸泡前大豆質(zhì)量（g）。

1.2.3 浸泡液SDS-PAGE分析。

樣品制備：取不同浸泡條件所得浸泡液2 mL于離心管中，冷凍干燥后加入0.2 mL去離子水溶解，然后加入0.2 mL SDS-PAGE樣品溶解液混勻，上樣10 μL。

操作步驟主要參考Laemmli[12]的方法并略加修改。

選取濃縮膠濃度為5.0%，分離膠濃度為12.5%。

電泳電極緩沖液：1.44 %（W/V）甘氨酸，0.025 mol/L Tris-HCl和0.1%（W/V）SDS。試驗時取上述溶液75 mL，加入200 mL去離子水混合均勻。

樣品溶解液：50%（W/V）甘油，0.05 mol/L Tris-HCl，4%（W/V））SDS和1 %溴酚藍。

固定液：33%（W/V）無水乙醇和12%（W/V）三氯乙酸（TCA）。染色液：0.2%（W/V）考馬斯亮藍G-250，5.3%（V/V）濃硫酸，9.35%（W/V）KOH，12% TCA。脫色液：10%（V/V）乙酸。

電泳電流15 mA，電泳結(jié)束后，立即固定凝膠，時間為2 h，然后倒出固定液，換上染色液染色過夜，最后脫色至背景透明，即可拍照，Bio-Rad Image Lab軟件分析。

1.2.4 質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜分析用于鑒定SDS-PAGE凝膠的未知條帶，參考閆尊浩[13]的方法并略作修改，具體方法如下：

①用手術(shù)刀切下SDS-PAGE凝膠上的目標條帶，置于EP管中；②用300 μL NH4HCO3（100 mmol/L）和30%的乙腈（ACN）脫色2 h；③每個管加入90 μL NH4HCO3（100 mmol/L），10 μL現(xiàn)配的DTT（100 mmol/L），56 ℃下孵化30 min；④除去上清，加入100 μL 100% ACN，5 min后吸出；⑤每管加入70 μL NH4HCO3（100 mmol/L）和30 μL IAA（200 mmol/L），避光放置20 min；⑥去除上清，每管加入100 μL NH4HCO3（100 mmol/L），室溫下放置15 min；⑦去除上清，加入100 μL 100% ACN，5 min之后吸出，重復(fù)2次；⑧酶管中加入5 μL Trypsin溶液（10 μg/μL），4 ℃保溫30～60 min；⑨吸出多余酶液，再加25 μL NH4HCO3（25 mmol/L）覆蓋膠粒；⑩將酶管倒置，pH 7.8～8.0，37 ℃下反應(yīng)20 h；B11吸取酶液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，原管中加入60 μL 60% ACN，一并倒入新的EP管中；B12新的EP管中加入20 μL雙蒸水，離心濃縮成干粉；B13干粉中加入3 μL 0.1% TFA溶解；B14點靶。整個過程要避免角蛋白污染。

1.2.5 Peleg 數(shù)學(xué)模型理論基礎(chǔ)。

吸水過程可以用Peleg數(shù)學(xué)模型進行較好地擬合[2，14-15]。Peleg數(shù)學(xué)模型為兩參數(shù)、非指數(shù)的經(jīng)驗型方程，其主要形式如方程（2）所示，將方程（2）經(jīng)過一定的轉(zhuǎn)換即得到方程（3）：

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆吸水動力學(xué)

2.1.1 大豆吸水過程分析。

圖1展示了不同浸泡溫度下大豆吸水率隨時間的變化，圖2是不同浸泡溫度下大豆吸水速率隨浸泡時間的變化。由圖1、2看出大豆浸泡過程經(jīng)歷3個階段：第1個階段，快速吸水，吸水率直線上升，吸水速率最大；而后吸水率緩慢上升，吸水速率減??；最后吸水率曲線趨于平緩，吸水速率接近于0甚至為負值，最終吸水達到飽和。

大豆的浸泡過程是自身的吸水膨脹過程，大豆的吸水速率取決于驅(qū)動力（飽和時刻與某一時刻的水分含量差）；隨著吸水過程進行，大豆水分含量越來越高，降低了驅(qū)動力，因而吸水速率下降，當達到飽和水分含量時，吸水過程終止[16]，所以理論上不同溫度的最大吸水率應(yīng)該是大約相等的。隨著浸泡溫度的升高，最大吸水率減小，當浸泡溫度為50 ℃時，浸泡3 h后，吸水率降低甚至出現(xiàn)負值，這可能是由于浸泡溫度較高，當達到平衡含水量時，大豆水分含量基本不變，但固形物等其他物質(zhì)仍在釋放，導(dǎo)致吸水率降低。

由圖1和圖2還可以看出，大豆吸水速率受溫度的影響明顯。50、40、30、20、4 ℃達到100%吸水率分別需要1.5、2.5、4.0、6.0和11.0 h。以連續(xù)3個數(shù)據(jù)相對標準偏差RSD<1.2%作為吸水平衡點，即為最大吸水率點。50、40、30、20、4 ℃達到最大吸水率分別需要3、5、9、12和24 h?？梢?，浸泡溫度越高，豆子吸水速率越快，達到飽和吸水率的時間越短。溫度較高時，水分子運動較為劇烈，水分子進入細胞的速度較快。此外，大豆細胞壁是水分子進入細胞的第一道阻礙，細胞壁主要是由纖維素、半纖維素和果膠組成，纖維素會通過分子間氫鍵相互作用，形成非常穩(wěn)定的多聚體，同時半纖維素、果膠和木質(zhì)素也會通過氫鍵鑲嵌在纖維素多聚體中，形成不溶性的微纖維[17]，其結(jié)構(gòu)類似于“鋼筋混凝土”。當采用較高的溫度浸泡時，果膠成分會部分溶解到溫水中，“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)被破壞，因此水分更易進入細胞。

2.1.2 Peleg數(shù)學(xué)模型分析。

使用OriginPro 8.0對所得數(shù)據(jù)進行擬合，得到方程相關(guān)參數(shù)如表1所示。

2.1.3 Peleg數(shù)學(xué)模型評價。

根據(jù)擬合方程，可以計算不同溫度下的數(shù)據(jù)，以用來描述浸泡過程中大豆的水分含量與溫度和時間的關(guān)系，并通過方程求出相應(yīng)溫度和時間下的近似含水量，同時可以大致預(yù)測不同浸泡溫度下達到相應(yīng)吸水率所需要的時間。

選取25 ℃對Peleg擬合方程進行檢驗，結(jié)果如圖5所示，擬合方程能較好地預(yù)測大豆吸水過程，吸水率變化曲線與試驗值相差不大。

2.2 浸泡過程中蛋白質(zhì)浸出動力學(xué)

2.2.1 浸泡液SDS-PAGE分析。

為了研究浸泡條件對大豆蛋白質(zhì)浸出成分的影響，更直觀地了解蛋白的溶出量及溶出的蛋白種類，對去離子水浸泡后的浸泡液濃縮后進行電泳分析，結(jié)果如圖6所示。

由電泳圖可知，隨著浸泡時間的增加，蛋白含量呈增加趨勢，50 ℃浸泡有一個分子量為37 kD的蛋白條帶，含量明顯大于其他2個溫度，且隨著時間的增加，含量顯著增加；40 ℃浸泡出現(xiàn)了先增加后趨于不變的現(xiàn)象，而且相較于50 ℃，浸泡5 h后的蛋白溶出量較少；20 ℃時，蛋白溶出量比50、40 ℃浸泡條件下的都要少。

2.2.2 浸泡液成分質(zhì)譜鑒定。

通過與SPI條帶對比，可以確定浸泡液中大部分重要蛋白質(zhì)種類，對不能確定的重要電泳條帶進行質(zhì)譜鑒定，分別為50 ℃浸泡電泳圖上的1、2、3、4號電泳條帶，結(jié)果如表2所示。

24 kD seed coat protein（SC24）是一種新的有羧酸鹽結(jié)合活性的植物防御蛋白[19]。浸泡溫度為50 ℃時，分子量為37 kD的蛋白質(zhì)大量釋放，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為堿性7S球蛋白（Bg7S）。Bg7S是一種富含Cys（半胱氨酸）的糖蛋白，在57.5～62.5 ℃，豆類種子能迅速釋放Bg類蛋白（堿性球蛋白）[20]。在溫度為40 ℃及以下時，通過電泳圖可以看出，其釋放較少，這與Palavalli等[21]報道的結(jié)果相一致。Bg7S可溶于高離子強度的鹽溶液中，在50～60 ℃熱水浸泡液中會大量浸出[22-23]。Bg7S是一種細胞壁蛋白，Bg7S被大量浸出，說明細胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，水分更容易通過細胞壁進入到細胞中，大豆吸水速率加快，這和之前推測50 ℃吸水速率加快的原因一致。

3 結(jié)論

Peleg方程能較好地描述大豆浸泡過程吸水性質(zhì)。在大豆的吸水模型中，Peleg方程參數(shù)k1隨溫度升高而減小，是浸泡溫度的多項函數(shù)，說明初始吸水速率與浸泡溫度有關(guān)。大豆在各個溫度浸泡過程中，均有大量蛋白質(zhì)滲出，其中分子量為37 kD的蛋白質(zhì)在50 ℃浸泡時大量浸出，經(jīng)質(zhì)譜鑒定后為堿性7S球蛋白，是細胞壁蛋白，其大量浸出，說明細胞壁被破壞，故50 ℃浸泡吸水速率明顯加快。

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