范延輝 王君

（1. 黃河三角洲生態(tài)環(huán)境研究中心 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濱州 256603；2. 濱州學(xué)院生物工程學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，濱州 256603）

冬棗輪紋病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及其抑制效果

范延輝 王君

（1. 黃河三角洲生態(tài)環(huán)境研究中心 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濱州 256603；2. 濱州學(xué)院生物工程學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，濱州 256603）

旨在篩選出能高效抑制冬棗輪紋病病原真菌的放線菌，為冬棗輪紋病的生物防治提供理論依據(jù)。通過(guò)純培養(yǎng)法從黃河三角洲貝殼堤島貝沙沉積物中分離獲得198株放線菌，對(duì)抑菌作用最強(qiáng)的菌株BK作了進(jìn)一步研究。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析對(duì)菌株BK進(jìn)行了鑒定，并研究了其對(duì)冬棗輪紋病菌抑制效果。結(jié)果表明，菌株BK對(duì)冬棗輪紋病菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)72.30%。菌株BK發(fā)酵液對(duì)離體冬棗果實(shí)輪紋病的防效為73.72%，與50% 多菌靈的防效相差不顯著。經(jīng)鑒定菌株BK為絳紅北里孢菌是一株較為理想的拮抗菌，在冬棗輪紋病生物防治方面有較好的應(yīng)用前景。

黃河三角洲貝殼堤島；拮抗放線菌；冬棗；輪紋??；抑制效果

沾化冬棗是黃河三角洲地區(qū)特晚熟鮮食果品，自推廣種植給廣大棗農(nóng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)利益，目前種植面積已達(dá)30余萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量近3.5億kg。但隨著冬棗栽培面積的迅速增加，冬棗病害的發(fā)生愈來(lái)愈重，其中冬棗輪紋病是冬棗采摘季節(jié)較為常見(jiàn)并危害嚴(yán)重的真菌病害。冬棗輪紋病不僅直接造成冬棗產(chǎn)量下降與品質(zhì)降低，而且病原真菌可產(chǎn)生對(duì)人體有害的代謝物，對(duì)人們的健康構(gòu)成極大威脅［1］。目前，對(duì)冬棗輪紋病的防治主要是噴灑化學(xué)農(nóng)藥多菌靈和退菌特［2］，化學(xué)農(nóng)藥具有誘導(dǎo)抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等缺點(diǎn)［3］，嚴(yán)重制約了沾化冬棗的可持續(xù)發(fā)展。放線菌 是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微生物資源，是抗生素、酶制劑和免疫調(diào)節(jié)劑等多種生物活性物質(zhì)的主要生產(chǎn)者，目前農(nóng)業(yè)和臨床使用的抗生素有四分之三是由放線菌生產(chǎn)的［4］。利用放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)制備的生物農(nóng)藥，因其具有高效、低毒無(wú)污染、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，已成為未來(lái)農(nóng)藥的發(fā)展方向［5］。

冬棗輪紋病生物防治相關(guān)工作開(kāi)始的較晚，冬棗輪紋病的病原菌于2005年才被分離鑒定［1］。近年來(lái)，馬海玲，劉俊華等［6，7］對(duì)苔蘚植物水浸提液對(duì)冬棗輪紋病病菌的抑菌效果進(jìn)行了初步研究，而在拮抗微生物方面鮮有報(bào)道［8］。隨著放線菌研究工作的廣泛開(kāi)展，新放線菌的發(fā)現(xiàn)越來(lái)越難，大量放線菌和活性代謝產(chǎn)物被多次重復(fù)發(fā)現(xiàn)和描述［9，10］，這也成為新型放線菌藥物開(kāi)發(fā)的瓶頸。為了破解這些難題，一些學(xué)者提出“新來(lái)源，新菌種，新基因，新產(chǎn)物，新用途”的概念，建議從新環(huán)境來(lái)獲得新菌種，發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)［11，12］。

黃河三角洲貝殼堤位于山東省濱州市無(wú)棣縣、沾化縣境內(nèi)，與美國(guó)圣路易斯安娜州和南美蘇里南的貝殼堤并稱為世界三大古貝殼堤，是典型且特殊的海岸帶生態(tài)系統(tǒng)類型［13］。特殊的生境為我們發(fā)現(xiàn)放線菌新物種，進(jìn)而開(kāi)發(fā)新型微生物源農(nóng)藥提供了良好的資源。本研究旨在從貝殼堤貝沙沉積物中篩選出高效的生防菌，并對(duì)其抑菌效果進(jìn)行研究，以期為冬棗輪紋病的生物防治及微生物源農(nóng)藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 貝砂土樣采自貝殼堤汪子島（經(jīng)度：117°52-56″，緯度：38°14'30″），采樣區(qū)域在向海側(cè)，樣品采集深度為5-30 cm，共采集土樣20份，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌株 供試菌為冬棗輪紋病病原真菌，本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.3 供試菌培養(yǎng)基 病原真菌培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂15 g；水1 000 mL；pH自然）；放線菌分離采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基（可溶性淀粉 20 g；KNO31 g；K2HPO40.5 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；NaCl 0.5 g；FeSO4·7H2O 0.01 g；瓊脂 20 g；水 1 000 mL；pH 7.2-7.4）。分離放線菌時(shí)，培養(yǎng)基加入重鉻酸鉀，終濃度為100 μg/mL；查氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、ISP2（酵母-麥芽膏瓊脂）培養(yǎng)基、ISP4（無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂）培養(yǎng)基、ISP6（蛋白胨酵母-鐵瓊脂）培養(yǎng)基、ISP6（蛋白胨酵母-鐵瓊脂）培養(yǎng)基，以及高氏一號(hào)培養(yǎng)基用于放線菌培養(yǎng)特征觀察，配制方法參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。

1.1.4 供試品種 供試冬棗為沾化冬棗一代，購(gòu)自濱州市沾化縣。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離篩選 土樣100℃干熱預(yù)處理1 h，用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋后，涂布于高氏一號(hào)平板，28℃恒溫培養(yǎng)1-3周。培養(yǎng)獲得的放線菌根據(jù)菌落形態(tài)和顏色進(jìn)行分類和編號(hào)，并經(jīng)反復(fù)劃線進(jìn)行純化。將得到的純培養(yǎng)物接種于斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱中保存。菌株對(duì)冬棗輪紋病菌的抑制作用采用對(duì)峙培養(yǎng)法：打孔法在PDA平板中央接種直徑為5 mm的真菌菌塊，將分離純化的放線菌在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，打孔法接于指示菌四周，28℃恒溫培養(yǎng)5-8 d后，觀察抑菌情況。

1.2.2 菌株BK的分類鑒定

1.2.2.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征 采用蓋玻片插片法培養(yǎng)，將放線菌劃線接種高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d，觀察并記錄培養(yǎng)菌落特征。取蓋玻片插片用普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡觀察菌絲體形態(tài)。將菌株BK分別接種到查氏、馬鈴薯葡萄糖、ISP2、ISP4、ISP6、ISP6，以及高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，分別在7、15、30 d 觀察記錄基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和可溶性色素的顏色變化。

1.2.2.2 生理生化特征 參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》中的方法進(jìn)行［15］。

1.2.2.3 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將菌株BK接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基，120 r/min，28℃震蕩培養(yǎng)36 h，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，用正向引物27F（5'-GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3'），和反向引物1541R（5''-AAGG AGGTGATCCAGCC -3'），對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：2.5 mmol/ L dNTPs 1 μL、10 μmol /L上游引物1 μL、10 μmol /L 下游引物1 μL、Taq plus DNA聚合酶3 U、1 0× PCR buffer 2.5 μL、模板DNA 0.5 μg。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將擴(kuò)增的產(chǎn)物由北京三博公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的16S rRNA 序列在網(wǎng)站http://eztaxon-e. ezbiocloud.net中進(jìn)行比對(duì)分析，然后利用MAGE 5.0軟件，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定菌株BK的分類地位。

1.2.3 菌株BK的抑菌和防治效果

1.2.3.1 發(fā)酵濾液對(duì)冬棗輪紋病菌絲生長(zhǎng)的影響 用接種針挑取在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d的菌株BK，接種到含15 mL種子培養(yǎng)液的試管中，在28℃培養(yǎng)4 d，按8%的接種量接種到內(nèi)裝100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，200 r/min 28℃振蕩培養(yǎng)7 d，菌懸液10 000 r/min、4℃條件下離心20 min，上清用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得到發(fā)酵濾液4℃保存?zhèn)溆谩２捎煤窘橘|(zhì)法測(cè)定菌株BK對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用：分別配制20 mL 含菌株BK發(fā)酵濾液的PDA 平板［16］，用打孔器取直徑為5 mm的病原真菌菌絲塊，移入平板中心處，28℃培養(yǎng)5-7 d測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑（mm），計(jì)算抑菌率。以無(wú)菌發(fā)酵液和蒸餾水為對(duì)照。發(fā)酵液分別稀釋5倍、10倍、20倍、50倍和100倍，每個(gè)處理重復(fù)3次。抑菌率=［（對(duì)照菌落直徑-試驗(yàn)處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑］×100%

1.2.3.2 BK對(duì)冬棗離體果實(shí)的防效測(cè)定 參考文獻(xiàn)［17］中的方法，選擇健康、大小且成熟度接近的冬棗果實(shí)，用蒸餾水洗干凈，待果面稍干后在果實(shí)上刺一傷口并接種冬棗輪紋病菌孢子懸液（濃度為1×108CFU/mL），于24 h后噴施菌株BK發(fā)酵液、50 %多菌靈500 倍液，另設(shè)噴無(wú)菌水為對(duì)照。每個(gè)處理15 個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)在25℃保溫、保濕貯藏，5 d 后調(diào)查病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，并用Duncan 氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性（P< 0.05）。

2 結(jié)果

2.1 放線菌的分離與篩選結(jié)果

共分離到198株放線菌，經(jīng)平板初篩獲得對(duì)冬棗輪紋病菌有拮抗作用的放線菌8株（圖1），根據(jù)抑菌作用的大小，選擇拮抗性最強(qiáng)的一株菌作為本實(shí)驗(yàn)的目的高效菌株，命名為BK（圖2）。經(jīng)測(cè)定，菌株BK遺傳穩(wěn)定性好，傳代培養(yǎng)6次后，抑菌作用無(wú)明顯變化。因此，選定菌株BK作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

圖1 8株對(duì)冬棗輪紋病菌有拮抗作用的放線菌的菌落照片

圖2 菌株BK對(duì)冬棗輪紋病菌的抑制作用

2.2 菌株BK的抑菌效果

2.2.1 菌株BK發(fā)酵濾液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 菌株BK發(fā)酵濾液對(duì)冬棗輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，5倍稀釋液的發(fā)酵濾液可完全抑制冬棗輪紋病菌絲生長(zhǎng)。隨著發(fā)酵濾液濃度的降低對(duì)冬棗輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率逐漸降低，但下降不劇烈。稀釋10、20、50 和100倍時(shí)的抑制率分別為72.3%、61.7%、47.2% 和39.3%。無(wú)菌發(fā)酵液與蒸餾水對(duì)照一致，對(duì)菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用（表1）。說(shuō)明放線菌菌株BK分泌在發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物質(zhì)具有較高的抑菌活性。

表1 菌株BK發(fā)酵濾液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率

2.2.2 BK對(duì)離體果實(shí)輪紋病的防治效果 結(jié)果（表2）表明，24 h 后接種處理的冬棗輪紋病的病情指數(shù)為14.80，防效為73.72%，與50 %多菌靈500 倍液的防治效果差異性不顯著，說(shuō)明菌株BK的發(fā)酵液對(duì)離體冬棗果實(shí)輪紋病具有一定的防治效果。

表2 對(duì)離體果實(shí)輪紋病的防治效果

2.3 菌株鑒定

2.3.1 放線菌菌株BK的形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化特性 結(jié)果（圖3）表明，菌株BK為革蘭氏陽(yáng)性菌，在高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7 d 的菌落直徑4-6 mm，表面致密、干燥、多皺、不易挑起。菌絲細(xì)長(zhǎng)，分枝多，孢子呈橢圓形表面光滑，孢子絲呈螺旋形（圖4）。菌株BK在大多數(shù)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素，氣生菌絲白色或灰白色，基內(nèi)菌絲無(wú)色、淺黃色或褐色。

圖3 菌株BK的菌落形態(tài)（高氏一號(hào)培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7 d）

圖4 菌株BK的孢子形態(tài)

菌株BK生長(zhǎng)溫度22-40℃，pH4-10，NaCl耐受性1%-3%。硝酸鹽還原、淀粉水解試驗(yàn)、纖維素水解試驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，不凝固但胨化牛奶，能夠利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、D-木糖、蔗糖、乳糖，不能利用山梨糖、肌糖、L-阿拉伯糖。2.3.2 BK的16S rRNA分析 BK的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 406 bp，在GenBank中的登錄號(hào)為KF111562，比對(duì)結(jié)果（圖5）顯示與其同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取其中的12株模式菌株，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，菌株BK與絳紅北里孢菌（Streptomyces purpureus）NBRC 13927T（AB184547）親緣關(guān)系最近，16S rRNA 基因序列相似性為99.15%。因此，結(jié)合培養(yǎng)特征和生理生化特性（表3）初步鑒定BK菌株為絳紅北里孢菌（S.purpureus）。

圖5 放線菌BK的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 菌株BK的生理生化特征

3 討論

貝殼堤是典型而又特殊的海岸帶類型，目前，針對(duì)黃河三角洲貝殼堤海岸生態(tài)系統(tǒng)的研究主要集中在貝殼堤的發(fā)育演變［18］、土壤理化特征［19］和植被多樣性和生物區(qū)系等方面［20］，有關(guān)微生物多樣性的報(bào)道甚少［21］。本研究共分離到198株放線菌，其中對(duì)冬棗輪紋病菌有拮抗作用的放線菌8株，這說(shuō)明貝殼堤放線菌資源豐富，值得進(jìn)一步發(fā)掘。本研究分離篩選的菌株BK經(jīng)鑒定為苯胺紫鏈霉菌，對(duì)冬棗輪紋病菌抑制作用較強(qiáng)，其發(fā)酵濾液5倍稀釋液對(duì)冬棗輪紋病的抑制效果與50%多菌靈可濕性粉劑500倍稀釋液相當(dāng)。因此，菌株BK具有的防治冬棗輪紋病生防潛力，有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的價(jià)值。

菌株BK分離自貝殼堤島，特殊的生態(tài)環(huán)境可能會(huì)賦予其特殊的代謝途徑，進(jìn)而獲得新穎的活性代謝產(chǎn)物，初步研究表明，菌株BK產(chǎn)生的抗真菌活性成分為脂肽類物質(zhì)（待發(fā)表），下一步我們將對(duì)菌株BK活性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其抑菌作用機(jī)理開(kāi)展研究，期望BK能在防治冬棗輪紋病方面發(fā)揮積極作用。另外，我們目前通過(guò)DGGE、宏基因組學(xué)等免培養(yǎng)方法對(duì)該區(qū)域的放線菌資源作進(jìn)一步研究，以期更全面地闡明該地區(qū)土壤放線菌的多樣性，獲得更多具有生物活性的放線菌新種。

4 結(jié)論

本研究從黃河三角洲貝殼堤貝沙土樣中分離了198 株放線菌，從中篩選出1 株對(duì)冬棗輪紋病具有極強(qiáng)拮抗作用的放線菌菌株BK，經(jīng)鑒定菌株BK為苯胺紫鏈霉菌 Streptomyces purpureus。菌株BK對(duì)冬棗輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)和離體冬棗果實(shí)輪紋病都有很好的抑制效果，是一株較為理想的拮抗菌，在冬棗輪紋病生物防治方面有很好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Screening， Identification，and Inhibitory Effect of Antagonistic Actinomycetes Against Macrophoma kuwatsukai Causing Winter Jujube Ring Grain Disease

FAN Yan-hui WANG Jun
（1. Research Center for Eco-Environmental Sciences Yellow River Delta，Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta，Binzhou 256603；2. School of Bioengineering，Binzhou University，Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603）

The objective is to select actinomycete which has strong antagonistic ability against winter jujube ring grain disease. Total 198 actinomycetes were isolated by culture-dependent method from the shell sediment in the Seashell Islands of Yellow River Delta，and the strain BK with the strongest antagonistic ability was further studied. Strain BK was identified based on its morphology，physio-biochemical characters and 16S rRNA sequence analysis，and its ability against winter jujube ring grain disease was also studied，providing a theoretical basis in biological control of winter jujube ring grain disease. The results showed that BK significantly inhibited the mycelium growth of Macrophoma kuwatsukai，with inhibitory rate of 72.3%. The control effect of the culture filtrate against winter jujube ring grain disease was 73.7%，which had no significant difference from that by the 50% carbendazim. Strain BK was identified as Streptomyces purpureus. To sum up，strain BK is an ideal antagonistic one，and presents a potential application for the biological control of winter jujube ring grain disease.

Seashell Islands of Yellow River Delta；antagonistic actinomycete；winter jujube；ring grain disease；inhibitory effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0119

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000059），山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J10LC55），國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410449034）

范延輝，男，講師，碩士，研究方向：土壤微生物；E-mail：yanhuifan@163.com

王君，女，副教授，博士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：ivywangjun@163.com