高銳 楊威 宋鵬飛

摘要 煙草香精香料在彌補(bǔ)卷煙因焦油降低而導(dǎo)致的香氣成分不足的問題上發(fā)揮著重要的作用，其中天然香料由于天然、綠色、健康而備受歡迎，而微生物發(fā)酵產(chǎn)香是獲取天然香料的較好方法。全面介紹了國內(nèi)外微生物制備煙用香料的發(fā)展趨勢(shì)，綜述了近些年微生物在制備煙用香料方面的研究進(jìn)展，并對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行了展望，以期為微生物制備煙用香料的開發(fā)提供借鑒與參考。

關(guān)鍵詞 微生物發(fā)酵；煙草；天然香料

中圖分類號(hào) TS264.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）02-0092-05

Abstract Tobacco flavors are very important to make up for insufficient tobacco aroma caused by tar reducing.Among tobacco flavors，natural flavor is popular for healthy to human，and production of flavor by microbial fermentation is a better way to gain the natural flavor.To fully understand the development trend at home and abroad，research progress on production of tobacco flavor by microbial fermentation in recent years was reviewed，and the field was also prospected.The aim was to provide references for the development of tobacco flavor by microbial fermentation.

Key words Microbial fermentation；Tobacco；Natural flavor

煙草行業(yè)是重要的消費(fèi)品制造行業(yè)，我國是世界第一煙草消費(fèi)大國，煙草產(chǎn)業(yè)每年都為國家貢獻(xiàn)了大量的稅收財(cái)富[1]。然而，隨著社會(huì)的進(jìn)步，煙草行業(yè)受到了日趨嚴(yán)峻的“吸煙對(duì)健康不利”的輿論壓力，提高卷煙的安全性已成為煙草行業(yè)的共同目標(biāo)。目前的研究表明，要提高卷煙的安全性，就要減少煙氣中的焦油含量，如何在降低卷煙焦油量的同時(shí)還能保持卷煙的吃味已成為煙草行業(yè)的主攻課題[2]，而煙草香精香料在彌補(bǔ)卷煙因焦油降低導(dǎo)致的香氣成分不足的問題上發(fā)揮著重要的作用[3]。

煙草香料按照來源，分為來自煙草本身的香料、非煙草的天然香料和人工合成的香料[4]。合成香料是非天然性的，會(huì)給人體健康帶來危害。天然香料主要來源于動(dòng)物和植物，動(dòng)物、植物香料資源有限，提取成本高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。微生物制備的香料是以天然原料為起始物，使用發(fā)酵技術(shù)、酶技術(shù)產(chǎn)生的香料，也屬于天然香料，且其具有生產(chǎn)周期短，不受氣候影響，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品分離后形成的“三廢”少，對(duì)環(huán)境友好等多種優(yōu)越性，所以越來越受到人們的重視[5]。筆者綜述了微生物制備的幾種煙用香料（香蘭素、2-苯乙醇、類胡蘿卜素降解香料、多糖類及其他復(fù)合香料）的生產(chǎn)菌株的種類、發(fā)酵優(yōu)化條件、基因工程改造及香料在煙草加香中的應(yīng)用，并對(duì)利用微生物制備煙用香料的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 微生物發(fā)酵生產(chǎn)單體煙用香料

微生物發(fā)酵生產(chǎn)的單體煙用香料原來大部分是采用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)，但隨著人們對(duì)綠色食品的追求，越來越多的研究者投入到利用天然原料生產(chǎn)天然香料的研究中，其中微生物轉(zhuǎn)化合成就是生產(chǎn)天然香料的研究熱點(diǎn)。

1.1 香蘭素的微生物合成

香蘭素（Vanillin，4-羥基-3-甲氧基苯甲醛）香氣濃郁而持久，在煙草制品中常做定香劑，協(xié)調(diào)煙香。利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素的底物主要有丁香酚、異丁香酚和阿魏酸。丁香酚和異丁香酚對(duì)微生物具有一定的毒性，會(huì)抑制菌體的正常生長(zhǎng)及代謝，轉(zhuǎn)化生成香蘭素的產(chǎn)率低。阿魏酸在自然界中含量豐富，廉價(jià)易得，對(duì)菌體沒有毒害作用，轉(zhuǎn)化生成香蘭素的產(chǎn)率相對(duì)較高[6]。所以現(xiàn)在對(duì)阿魏酸發(fā)酵產(chǎn)生香蘭素的研究較多。以阿魏酸為底物合成香蘭素有兩步法和單一菌株合成法。兩部法：第一步，先用黑曲霉（Aspergillus niger）將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香草酸；第二步，再用朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）將香草酸還原為香蘭素[7]，該方法轉(zhuǎn)化合成香蘭素的產(chǎn)率較低。單一菌株合成法：能將阿魏酸轉(zhuǎn)化合成香蘭素的菌株很多，如Pseudomonas fluorescens AN103[8]、Amycolatopsis sp.HR167[9]、Amycolatopsis sp.ATCC 39116[10]、Delftia acidovorans[11]、Sphingomonas paucimobilis SYK-6[12]，Enterobacter sp.Px6-4[13]、Rhodococcus opacus PD630[14]、Streptomyces setonii[15]、Corynebacterium glutanmicum、Haematococcus pluvialis、Alcaligenes paradoxus、Polyporus versicolor、Rhodotorula rubra[16]、Halomonas sp.B15[17]等，在眾多菌株中，由于香蘭素對(duì)菌體來說是一種抑制劑[18]，大多數(shù)菌株無法耐受高濃度的香蘭素，或者部分菌株體內(nèi)存在香蘭素的下游代謝基因，會(huì)將生成的香蘭素繼續(xù)降解，最終導(dǎo)致香蘭素的產(chǎn)量均比較低。為了提高香蘭素產(chǎn)率及適宜工業(yè)化生產(chǎn)，目前研究方向有如下幾種。

1.1.1 發(fā)掘高產(chǎn)、高耐受香蘭素的菌株。目前的研究表明，僅放線菌中的擬無枝酸菌（Amycolatopsis） 和鏈霉菌（Streptomyces）2個(gè)屬的幾個(gè)菌株能將底物阿魏酸轉(zhuǎn)化生成較高產(chǎn)量（超過10.00 g/L）的香蘭素。Hua等[19]利用Streptomyces sp.V-1 以阿魏酸為底物，借助吸附樹脂的作用，經(jīng)55 h 的發(fā)酵最終獲得19.20 g/L 的香蘭素，總摩爾得率為54.50%。Muheim等[20]利用10 L 的生物反應(yīng)器發(fā)酵西唐鏈霉菌（Streptomyces setonii）（后來經(jīng)鑒定是擬無枝酸菌Amycolatopsis sp.ATCC 39116），獲得13.90 g/L香蘭素的高產(chǎn)量。轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)生香蘭素的高產(chǎn)菌株都是放線菌，這可能是因?yàn)檫@些放線菌是在接近植物的土壤環(huán)境中腐生，在長(zhǎng)期進(jìn)化中，獲得分解利用包括阿魏酸在內(nèi)的羥基肉桂酸的能力，從而能將阿魏酸高效轉(zhuǎn)化成香蘭素[21]。

1.1.2 優(yōu)化發(fā)酵條件。發(fā)酵培養(yǎng)基、pH、底物阿魏酸濃度及發(fā)酵菌株的起始濃度等是影響香蘭素產(chǎn)率的重要因素。Ma 等[21-22]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵液起始 pH 8.0，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度10.00 g/L，酵母提取物8.00 g/L，添加100.00 mg/L香草酸時(shí)，Amycolatopsis sp.ATCC 39116 和Streptomyces sp.V1的產(chǎn)率最高，最終香蘭素的濃度是分別是9.18和9.09 g/L，轉(zhuǎn)化率分別高達(dá)96.10%和 95.20%，這是迄今為止以阿魏酸為底物，利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素獲得的最高轉(zhuǎn)化率。另外，高濃度（>10 mmol/L）的底物阿魏酸不利于菌株密度提高，會(huì)降低香蘭素產(chǎn)率，所以分批流加底物優(yōu)于一次性加入。Pérez-rodríguez N等[23]研究了培養(yǎng)基組分、一次性加料和分批流加底物、補(bǔ)充香草酸、種子起始濃度對(duì)Amycolatopsis sp.ATCC 39116轉(zhuǎn)化阿魏酸的影響，發(fā)現(xiàn)種子起始濃度是影響阿魏酸轉(zhuǎn)化生成香蘭素的最強(qiáng)因子，當(dāng)種子起始濃度處于中間值（5.00～10.00 g/L）時(shí)香蘭素的產(chǎn)率最高，其原因還有待進(jìn)一步研究。雖然這些放線菌轉(zhuǎn)化合成香蘭素的產(chǎn)率較高，但是，由于這些菌株菌絲體十分密集，使得發(fā)酵液非常黏稠，對(duì)產(chǎn)物提純?cè)斐蓸O大的困難，從而導(dǎo)致下游的加工過程成本過高。所以有的研究者把視線轉(zhuǎn)移到易操作的菌株大腸桿菌和假單胞菌的基因工程改造上。

1.1.3 基因工程改造目標(biāo)菌株。目前的研究表明，很多假單胞菌本身就擁有合成香蘭素的關(guān)鍵基因fcs（編碼Feruloyl-CoA 合成酶）和ech（編碼Enoyl-CoA 水合酶），但同時(shí)也有進(jìn)一步降解香蘭素的基因，所以有研究者通過基因工程手段，增強(qiáng)合成基因fcs和ech的表達(dá)，降低香蘭素降解基因vdh（編碼香蘭素脫氫酶）的活性，從而提高香蘭素的產(chǎn)率。2011年，Di Gioia等[24]轉(zhuǎn)入一個(gè)含有fcs和ech基因的低拷貝重組質(zhì)粒到熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens BF13）中，并將菌株的降解基因vdh失活，發(fā)酵獲得約1.30 g/L 香蘭素。Graf等[22]認(rèn)為，要解決香蘭素降解的問題，降低vdh的活性還不夠，所以，他們不僅將假單胞菌（Pseudomonas putida KT2440）的香蘭素降解基因vdh敲出，還使鉬離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體失活（在假單胞菌中鉬離子是某些氧化還原酶的輔助因子，所以失活鉬離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，降低鉬離子的攝入，就可能降低這些酶的活性，從而降低這些酶分解利用香蘭素），來減少香蘭素降解，且通過引入tac啟動(dòng)子系統(tǒng)，增強(qiáng)fcs和ech基因的表達(dá)，使假單胞菌轉(zhuǎn)化阿魏酸合成香蘭素的轉(zhuǎn)化率3 h就達(dá)到86.00%。另外，不只假單胞菌中存在香蘭素降解基因vdh，擬無枝酸菌中也有，敲出該基因后，擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化阿魏酸合成香蘭素的產(chǎn)率也得到了提高[25]。

1.1.4 異源表達(dá)香蘭素合成關(guān)鍵基因生產(chǎn)香蘭素。大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，抗污染能力強(qiáng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。所以，有的研究者利用基因工程手段，將與香蘭素合成有關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)氪竽c桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)生產(chǎn)香蘭素。Yoon等[26-27]將關(guān)鍵基因fcs和ech導(dǎo)入大腸桿菌中異源表達(dá)，優(yōu)化后得到1.12 g/L 的香蘭素。在此基礎(chǔ)上，該課題組還引入重組質(zhì)粒使gltA 基因（編碼檸檬酸合成酶）過量表達(dá)，并對(duì)TCA 循環(huán)進(jìn)行了一系列改造，中斷部分TCA 循環(huán)，最終，經(jīng)過24 h 的轉(zhuǎn)化，得到5.14 g/L 香蘭素，摩爾轉(zhuǎn)化率為86.60%[28]。不過，由于重組大腸桿菌本身沒有香蘭素合成關(guān)鍵基因（fcs和ech），它攜帶這2個(gè)基因的遺傳不穩(wěn)定性成為該思路的一個(gè)缺陷[24]。

盡管目前微生物轉(zhuǎn)化合成香蘭素的產(chǎn)率普遍低于傳統(tǒng)的化學(xué)法，但相信隨著高新生物技術(shù)手段的發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化合成香蘭素將實(shí)現(xiàn)低成本、高效益的工業(yè)化生產(chǎn)，成為市場(chǎng)主導(dǎo)的香蘭素來源。

1.2 2-苯乙醇的微生物合成

2-苯乙醇具有清甜玫瑰氣息，輕甜柔和，可改善煙草吃味[29]。許多發(fā)酵生產(chǎn)的食品中都含有2-苯乙醇，如可可、咖啡、面包、啤酒、奶酪等。人們發(fā)現(xiàn)，酵母菌都能產(chǎn)生雜醇油，而2-苯乙醇是雜醇油的重要組成部分[30]，所以，許多酵母菌具有從頭合成或生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的能力，如馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentation）、酸酒酵母（Saccharomycesvi vini）、產(chǎn)阮球擬酵母（Torulopsisu tilis）、芽枝狀枝霉（Cladosporiumc ladosporioides）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）和異常漢遜酵母等（Hansenula anomala）。另外，其他真菌如黑曲霉（Aspergilus niger ）、猴頭菌（Hericium erinaceus）等也具有該能力，只是產(chǎn)率較低[31]。

微生物合成2-苯乙醇的途徑有苯丙酮酸途徑和艾氏途徑，苯丙酮酸途徑在微生物中廣泛存在，但是由于代謝途徑過長(zhǎng)、支路多以及各種各樣的抑制作用，使得最終2-苯乙醇的產(chǎn)量很低[30]。目前，一般都是通過艾氏途徑調(diào)控2-苯乙醇的合成。艾氏途徑是L-苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨基作用（轉(zhuǎn)氨酶催化）生成苯丙酮酸，繼而經(jīng)過脫羧酶和氧化脫氫酶作用生成2-苯乙醇。2-苯乙醇對(duì)微生物細(xì)胞有一定的毒性，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.00～3.00 g/L時(shí)，能抑制多種細(xì)菌及真菌的生長(zhǎng)，這是制約2-苯乙醇微生物合成生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[32]。為了提高2-苯乙醇的產(chǎn)量，目前廣泛采用的較為有效的方法有如下幾種。

1.2.1 高產(chǎn)菌株的篩選。不同的菌種轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力是不同的，因此在對(duì)轉(zhuǎn)化途徑及培養(yǎng)條件細(xì)致研究之前，選育出1株高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌株意義重大[13]。Albertazzi E等[33]篩選到2株高產(chǎn)菌Hansenula anomala CBS 110和Saccharomyces cerevisiae NCYC 739，在L-苯丙氨酸2.00 g/L、pH 4.5的條件下發(fā)酵24 h，2-苯乙醇產(chǎn)量分別為1 728.00和1 573.00 mg/L。Fabre等[34]從21種酵母菌中篩選到1株高產(chǎn)菌Kluyveromyces marxianus，在30 ℃、125 r/min條件下培養(yǎng)192 h后2-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)1.85 g/L。 Celińska等[35]發(fā)現(xiàn)，解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica NCYC3825）具有很強(qiáng)的產(chǎn)2-苯乙醇能力，在沒有優(yōu)化培養(yǎng)基的情況下，產(chǎn)量高達(dá)2.00 g/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化。除了優(yōu)良的菌種，發(fā)酵條件優(yōu)化也是提高2-苯乙醇的方法之一。培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、L-苯丙氨酸濃度等都是影響產(chǎn)率的重要因素。碳源和氮源是培養(yǎng)基的主要成分，其種類和濃度對(duì)生物轉(zhuǎn)化率有顯著影響，是培養(yǎng)基優(yōu)化的主要因素，過量的碳源將導(dǎo)致酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，乙醇可與2-苯乙醇對(duì)菌株產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)[36-37]，所以，分批補(bǔ)料培養(yǎng)體系，可以控制副產(chǎn)物乙醇的濃度，降低抑制效應(yīng)； L-苯丙氨酸既可做轉(zhuǎn)化底物，也可以是菌株的氮源，過量的L-苯丙氨酸不僅造成浪費(fèi)而且會(huì)增加下游分離純化的負(fù)擔(dān)，L-苯丙氨酸濃度也是影響2-苯乙醇產(chǎn)量的重要因素。王航等[38]對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae R-UV3）轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-苯乙醇的碳氮源及補(bǔ)料進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果是葡萄糖為最佳碳源，以呼吸商1.1±0.1為補(bǔ)糖控制依據(jù)，1.00 g/L脲為氮源，8.00 g/L的 L-苯丙氨酸，2-苯乙醇的最終濃度為4.39 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為80.00%。Etschmann等[39]通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度，使得Kluyveromyces marxianus CBS600在糖30.00 g/L，L-苯丙氨酸9.00 g/L，溫度32.5 ℃條件下，發(fā)酵39 h后 2-苯乙醇質(zhì)量濃度為5.60 g/L，較沒優(yōu)化前提高了87.00%。

1.2.3 原位萃取分離技術(shù)。原位萃取分離技術(shù)（ISPR）是指將生物細(xì)胞的代謝產(chǎn)物快速移走的提取方法，以防止代謝產(chǎn)物抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。在2-苯乙醇發(fā)酵中常用的提取方法是溶劑萃取和吸附法。Etschmann等[40]在培養(yǎng)Kluyveromyces marxianus CBS600過程中，在優(yōu)化培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，通過使用聚丙二醇1200作為提取劑消除終產(chǎn)物2-苯乙醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性，使有機(jī)相中的2-苯乙醇產(chǎn)量提高到26.50 g/L。雖然有機(jī)相-水相萃取技術(shù)效果明顯，但是也伴隨著黏度大、產(chǎn)品不易分離和毒性大等缺點(diǎn)。因此，有人采用固相-水相吸附技術(shù)從水相中吸附2-苯乙醇以提高其產(chǎn)量，關(guān)昂等[41]研究了酵母釀酒（Saccharomyces cerevisiae）轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇的常規(guī)和帶原位轉(zhuǎn)移的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程特性：在常規(guī)培養(yǎng)中，2-苯乙醇的最高終濃度僅為3.85 g/L，而采用大孔樹脂F(xiàn)D0816作為原位轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的介質(zhì)時(shí)，2-苯乙醇的最終總濃度達(dá)到12.80 g/L，較原先提高了232.00%。后來的研究中，當(dāng)水相中的2-苯乙醇的濃度高于2.70 g/L時(shí)，就更換吸附樹脂，使2-苯乙醇的最終濃度達(dá)到了32.50 g/L [37]。大孔樹脂結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無揮發(fā)性氣味，價(jià)格低廉，且在萃取過程中不會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量，工藝路線也簡(jiǎn)單易行。所以，在工業(yè)生產(chǎn)天然2-苯乙醇中有良好的應(yīng)用前景。

1.2.4 基因工程改造目標(biāo)菌株提高2-苯乙醇產(chǎn)率。在釀酒酵母中，基因ARO8、 ARO9（編碼轉(zhuǎn)氨酶）和ARO10（編碼脫羧酶）是轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇的關(guān)鍵基因[42-43]，所以增強(qiáng)這些基因的表達(dá)可能提高2-苯乙醇的產(chǎn)率。2014年，Kim等[44]通過過表達(dá)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ARO9、ARO10 基因及內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子Aro80，并敲出基因ALD3（編碼苯乙醛氧化酶，該酶存在會(huì)與苯乙醛脫羧反應(yīng)形成競(jìng)爭(zhēng)從而減少2-苯乙醇的生成），最終2-苯乙醇的濃度達(dá)到4.80 g /L。2015年，Yin等[45]分別把攜帶有基因ARO8和ARO10的表達(dá)載體導(dǎo)入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），2-苯乙醇的產(chǎn)率比未引入載體的分別提高了9.30%和 16.30%，當(dāng)同時(shí)引入這2個(gè)表達(dá)載體，并采用分批補(bǔ)料發(fā)酵法發(fā)酵60 h后，2-苯乙醇的濃度提高到2.61 g/L。但他們發(fā)現(xiàn)，只導(dǎo)入 ARO9表達(dá)載體時(shí)并不能增強(qiáng)轉(zhuǎn)氨酶活性，不能提高2-苯乙醇的合成。所以，可能基因ARO8比ARO9對(duì)2-苯乙醇合成的影響更大。

另外，國內(nèi)華寶香化科技發(fā)展（上海）有限公司經(jīng)過多年的創(chuàng)新研發(fā)，成功完成了以煙草（煙梗、煙末）為原料，用微生物（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、中國克魯維酵母中的一種）發(fā)酵降解煙草中的木質(zhì)素、果膠和多酚類化合物生成2-苯乙醇，并于2004年7月28日獲得了發(fā)明專利授權(quán)（ZL專利號(hào)02137575.5，授權(quán)公告CNl 159447C）[46]。

2 微生物發(fā)酵產(chǎn)生復(fù)合煙用香料

微生物發(fā)酵除可生產(chǎn)單一的香料外，還可生產(chǎn)復(fù)合香料。復(fù)合香料由多種成分有機(jī)組合在一起，其香韻協(xié)調(diào)、獨(dú)特，能賦予卷煙特殊香氣風(fēng)格，所以微生物發(fā)酵產(chǎn)生復(fù)合香料也是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的復(fù)合煙用香料主要有類胡蘿卜素降解香料、多糖類香料等。

2.1 微生物降解類胡蘿卜素產(chǎn)香

類胡蘿卜素是一類在自然界中廣泛存在的、由8個(gè)異戊二烯單元相連，且分子兩端各含有1個(gè)不飽和己烯環(huán)的一類四萜化合物的總稱。類胡蘿卜素降解后可形成許多不同的香味物質(zhì)，如大馬酮、巨豆三烯酮、紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、檸檬醛等[47]，這些物質(zhì)的香氣閾值低，即使含量不大，對(duì)煙草香氣影響也較大，且該類物質(zhì)香氣淡雅，是高檔卷煙凸顯風(fēng)格的重要物質(zhì)。降解類胡蘿卜素的方法有高溫氧化降解、熱裂解、化學(xué)氧化降解、微生物降解等，其中，微生物降解因其條件溫和、選擇性高、效率高而越來越受到關(guān)注。Zorn等[48]從含有萜烯類物質(zhì)較多的基質(zhì)中分離到10多株具有β-胡蘿卜素降解能力較強(qiáng)的絲狀真菌和酵母菌，這些菌株能轉(zhuǎn)化合成萜烯類化合物，產(chǎn)生的香味物質(zhì)主要為二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-紫羅蘭酮。蒿洪欣等[49]從常年落花的土壤中分離到了6株芽孢桿菌屬細(xì)菌能降解類胡蘿卜素，且產(chǎn)生香味物質(zhì)2-庚酮、棕櫚酸、鄰苯二甲酸酐等。樊明濤課題組[50-53]從沙棘汁中分離到了1株可降解類胡蘿卜素產(chǎn)香的巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri TS-82），并優(yōu)化該菌株培養(yǎng)條件、分離純化降解酶，研究了該酶催化降解β-胡蘿卜素的效率（40.40%），催化降解蝦青素的效率（51.12%）。

2.2 微生物發(fā)酵產(chǎn)生多糖類物質(zhì)

多糖是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物組織中的重要的生命有機(jī)組成部分，具有多種生物活性。真菌多糖作為煙草添加劑，經(jīng)高溫裂解或美拉德反應(yīng)可產(chǎn)生一定的香氣，極大地改善抽吸口感和煙氣對(duì)喉部的刺激，從而提升煙氣品質(zhì)[54]，而且這些香氣物質(zhì)隨煙氣進(jìn)入人體后也可產(chǎn)生抗腫瘤、抗氧化的藥理作用。對(duì)真菌多糖在煙草加香方面研究較多的是許春平課題組，該課題組分別從硬毛蓋孔菌（Funalia trogii）、二年殘孔菌（Abortiporus biennis）、 檉柳核纖孔菌（Inocutis tamaricis）及肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）發(fā)酵液中提取胞外多糖，分析結(jié)果顯示，肺形側(cè)耳胞外多糖和二年殘孔菌胞外多糖都富含葡萄糖和甘露糖；卷煙加香試驗(yàn)中，檉柳核纖孔菌在煙氣中的轉(zhuǎn)移率是1.40%～1.70%，硬毛蓋孔菌胞外多糖的轉(zhuǎn)移率是1.58%～3.39%，肺形側(cè)耳胞外多糖的轉(zhuǎn)移率為1.26%～12.40%；感官評(píng)吸試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，肺形側(cè)耳多糖具有增加卷煙香氣量、增強(qiáng)回甜感、提高主流煙氣細(xì)膩度、掩蓋雜氣等作用（在卷煙中的最佳用量為0.04%），檉柳核纖孔菌多糖不僅具有減輕刺激性、增加回甜感、改善余味等效果（在卷煙中的最佳用量為0.07%），還有清除自由基的作用，在3.00 g/L時(shí)對(duì)DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）的清除率達(dá)到34.66%，二年殘孔菌胞外多糖能增加清香香韻，減輕刺激性；另外，煙氣中具有殺菌、抗病毒、抗腫瘤等作用的香葉基香葉醇含量顯著升高[55-58]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生多糖類物質(zhì)作為增香劑添加在煙草中，不僅可提升煙草香韻品質(zhì)，還有保健的作用，符合人們的消費(fèi)理念，具有很好的市場(chǎng)前景。

2.3 微生物發(fā)酵產(chǎn)生的其他類煙用復(fù)合香料

除了類胡蘿卜素降解產(chǎn)生的香料、多糖類香料外，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的其他類香料復(fù)雜多樣，它們大多是來自于香料作物內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)生。植物內(nèi)生菌在與植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過程中相互依存和相互作用，不僅對(duì)宿主植物有促進(jìn)生長(zhǎng)、防止病害和內(nèi)生固氮等有益的生物學(xué)作用，而且由于基因的轉(zhuǎn)移或植物成分的誘導(dǎo)，使內(nèi)生菌產(chǎn)生具有與宿主相同或相似的物質(zhì)。因此，利用香料作物內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)香料也是開發(fā)煙用香料的一條途徑。2006年，楊黎華等[59]從香料植物香茅草[Cumbopogon citratus（DC.） Stapf]中篩選到1株產(chǎn)生香味物質(zhì)的內(nèi)生真菌XCJ-1，從這株菌的發(fā)酵提取物檢出74種化合物，其中有乙縮醛二乙醇、檸檬烯、月桂烯、月桂醛等多種香料物質(zhì)，經(jīng)卷煙加香試驗(yàn)表明，由該菌株發(fā)酵制備的生物香料具有增加煙香，柔和煙氣，增加細(xì)膩性，略降低刺激性，明顯改善煙氣質(zhì)的作用[60]。周麗娟等[61]從荔枝中分離得到的內(nèi)生酵母菌能夠發(fā)酵產(chǎn)生苯乙醇、糠醛、2，3-丁二醇等香氣物質(zhì)，朱宇等[62]從西瓜中分離的株內(nèi)生酵母菌，能夠?qū)⒈?、胺、酚等物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成酸、醇等香氣物質(zhì)，這2株菌發(fā)酵干果提取液制取的香料，加入卷煙中，具有柔和煙氣、提高煙氣細(xì)膩性、甜潤(rùn)感的作用。龐登紅等[63]分離到的西紅柿內(nèi)生釀酒酵母（Saccharomyces cerevis）發(fā)酵葡萄汁，產(chǎn)生了苯乙醇和一些酯類香氣物質(zhì)，將該香料加入卷煙后，卷煙香氣量增加、刺激性降低、煙氣更加細(xì)膩，賦予卷煙甜香香韻，且具有清除卷煙煙氣中自由基的作用。這些植物內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)生的復(fù)合香料，由多種香味成分有機(jī)組合而成，其香韻協(xié)調(diào)、獨(dú)特，能賦予卷煙特殊香氣風(fēng)格，難以仿制，是煙用香料開發(fā)的重要途徑。但是，目前的研究比較隨機(jī)、分散、不夠深入，今后應(yīng)該對(duì)潛力菌株的特征、發(fā)酵條件，產(chǎn)生的致香物質(zhì)種類及含量進(jìn)行深入研究，達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的要求。

3 總結(jié)與展望

開發(fā)天然的煙用香料來彌補(bǔ)降焦減害后卷煙的低吃味，形成獨(dú)特的卷煙風(fēng)味，是提升卷煙品牌競(jìng)爭(zhēng)力的重要任務(wù)。由于微生物制備煙用香料具有生產(chǎn)周期短、不受氣候限制、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此利用微生物制備煙用香料的研究方興未艾。目前，雖然微生物制備煙用香料的研究取得了一定成果，但還遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，今后應(yīng)該在以下幾方面積極開展研究來推動(dòng)微生物制備煙用香料的發(fā)展：①煙用香料有多種類型，而目前能通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的只有香蘭素、苯乙醇等少數(shù)幾種，今后應(yīng)該擴(kuò)大范圍，篩選更多的生產(chǎn)香料的菌株，豐富微生物生產(chǎn)制備的天然香料種類。②對(duì)已有的菌株，充分利用基因工程、發(fā)酵工程等技術(shù)手段，深入研究開發(fā)，盡快產(chǎn)業(yè)化。③加強(qiáng)微生物制備的香料在卷煙加香中的應(yīng)用研究，形成獨(dú)特的香氣風(fēng)格和口味特征，提高香料的調(diào)制和供應(yīng)能力，滿足卷煙發(fā)展的需求。相信隨著技術(shù)的發(fā)展，研究的深入，微生物制備煙用香料具有很大的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 王慧英.專賣制度下我國煙草產(chǎn)業(yè)的改革與發(fā)展[J].上海經(jīng)濟(jì)研究，2009（4）：22-28.

[2] 楊君，高宏建，張獻(xiàn)忠，等.煙草香味物質(zhì)及其精油應(yīng)用研究進(jìn)展[J].香料香精化妝品，2012（3）：45-49.

[3] 葉榮飛，趙瑞峰.我國煙草香精香料的研究現(xiàn)狀[J].清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011，4（3）：34-37.

[4] 葉榮飛，趙瑞峰.煙草香氣物質(zhì)來源[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（5）：51-53.

[5] 蘇林.微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)制備天然香精香料[J].中國食品添加劑，2009（6）：197-201.

[6] 楊文文， 吳秋林， 唐鴻志，等.“香料皇后”：天然香蘭素生物合成的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（6）：1087-1095.

[7] LESAGEMEESSEN L，DELATTRE M，HAON M，et al.A twostep bioconversion process for vanillin production from ferulic acid combining Aspergillus niger and Pycnoporus cinnabarinus[J].Journal of biotechnology，1996，50（2/3）：107-113.

[8] GASSON M J，KITAMURA Y，MCLAUCHLAN W R，et al.Metabolism of ferulic acid to vanillin[J].The journal of biological chemistry，1998，273（7）：4163-4170.

[9] ACHTERHOLT S，PRIEFERT H，STEINBCHEL A.Identification of Amycolatopsis sp.strain HR167 genes，involved in the bioconversion of ferulic acid to vanillin[J].Applied microbiology and biotechnology，2000，54（6）：799-807.

[10] FLEIGE C，HANSEN G，KROLL J，et al.Investigation of the Amycolatopsis sp.strain ATCC 39116 vanillin dehydrogenase and its impact on the biotechnical production of vanillin[J].Applied and environmental microbiology，2013，79（1）：81-90.

[11] PLAGGENBORG R，STEINBCHEL A，PRIEFERT H.The coenzyme Adependent，nonbetaoxidation pathway and not direct deacetylation is the major route for ferulic acid degradation in Delftia acidovorans[J].FEMS Microbiology Letters，2001，205（1）：9-16.

[12] MASAI E，HARADA K，PENG X，et al. Cloning and characterization of the ferulic acid catabolic genes of Sphingomonas paucimobilis SYK6[J].Applied and environmental microbiology，2002，68（9）：4416-4424.

[13] GU W，LI X M，HUANG J W，et al.Cloning，sequencing，and overexpression in Escherichia coli of the Enterobacter sp.Px64 gene for ferulic acid decarboxylase[J].Applied microbiology and biotechnology，2010，89（6）：1797-1805.

[14] PLAGGENBORG R，OVERHAGE J，LOOS A，et al.Potential of Rhodococcus strains for biotechnological vanillin production from ferulic acid and eugenol[J].Applied microbiology and bbotechnology，2006，72（4）：745-755.

[15] MUHEIM A，LERCH K.Towards a highyield bioconversion of ferulic acid to vanillin[J].Applied microbiology and biotechnology，1999，51（4）：456-461.

[16] 陳朋，李紅玉，劉超群.微生物轉(zhuǎn)化合成香蘭素[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（2）：385-388.

[17] VYRIDES I，AGATHANGELOU M，DIMITRIOU R，et al.Novel Halomonas sp.B15 isolated from Larnaca Salt Lake in Cyprus that generates vanillin and vanillic acid from ferulic acid[J].World journal of microbiology and biotechnology，2015，31（8）：1291-1296.

[18] 趙建芬，韋壽蓮，嚴(yán)子軍.香蘭素的抑菌性及其應(yīng)用的初步研究[J].微生物學(xué)雜志，2009，29（6）：73-76.

[19] HUA D L，MA C Q，SONG L F，et al.Enhanced vanillin production from ferulic acid using adsorbent resin[J].Applied microbiology and biotechnology，2007，74（4）：783-790.

[20] MUHEIM A，MULLER B，MUNCH T，et al.Microbiological process for producing vanillin：US 6235507 B1[P].2001-05-22.

[21] MA X K，DAUGULIS A J.Effect of bioconversion conditions on vanillin production by Amycolatopsis sp.ATCC 39116 through an analysis of competing byproduct formation[J].Bioprocess and biosystems engineering，2014，37（5）：891-899.

[22] GRAF N，ALTENBUCHNER J.Genetic engineering of Pseudomonas putida KT2440 for rapid and highyield production of vanillin from ferulic acid[J].Applied microbiology and biotechnology，2014，98：137-149.

[23] PREZRODRGUEZ N，DE SOUZA OLIVEIRA R P，AGRASAR A M T，et al.Ferulic acid transformation into the main vanilla aroma compounds by Amycolatopsis sp.ATCC 39116[J].Applied microbiology and biotechnology，2016，100（4）：1677-1689.

[24] DI GIOIA D，LUZIATELLI F，NEGRONI A，et al.Metabolic engineering of Pseudomonas fluorescens for the production of vanillin from ferulic acid[J].Journal of biotechnology，2011，156（4）：309-316.

[25] FLEIGE C，HANSEN G，KROLL J，et al. Investigation of the Amycolatopsis sp.strain ATCC 39116 vanillin dehydrogenase and its impact on the biotechnical production of vanillin[J].Applied and environmental microbiology，2013， 79（1）：81-90.

[26] YOON S H，LI C，LEE Y M，et al.Production of vanillin from ferulic acid using recombinant strains of Escherichia coli[J].Biotechnology bioprocess engineering，2005，10（4）：378-384.

[27] YOON S H，LI C，KIM J E，et al.Production of vanillin by metabolically engineered Escherichia coli[J].Biotechnology letters，2005，27（22）：1829-1832.

[28] LEE E G，YOON SH ，DAS A，et al.Directing vanillin production from ferulic acid by increased acetylCoA consumption in recombinant Escherichia coli[J].Biotechnology and bioengineering，2009，102（1）：200-208.

[29] 黃映鳳.煙用香精香料的分析研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[30] 榮紹豐，付艷麗.微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)β-苯乙醇的研究進(jìn)展[J].上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，9（4）：266-270.

[31] 劉東亞.微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵法生產(chǎn)天然香料β苯乙醇的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2006.

[32] 黃友和， 楊尚彤， 周志強(qiáng)，等.植物和微生物合成2-苯乙醇的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，32（4）：41-44.

[33] ALBERTAZZI E，CARDILLO R，SERVI S，et al.Biogeneration of 2phenylethanol and 2phenylethylacetate important aroma components[J].Biotechnology letters，1994，16（5）：491-496.

[34] FABRE C E，BLANC P J，GOMA G.Screening of yeasts producing 2phenylethyl alcohol[J].Biotechnology techniques，1997，11（7）：523-525.

[35] CELIN′SKA E，KUBIAK P，BIALAS W，et al.Yarrowia lipolytica：The novel and promising 2phenylethanol producer[J].Journal of industrial microbiology & biotechnology，2013，40（3/4）：389-392.

[36] STARK D，ZALA D，MNCH T，et al.Inhibition aspects of the bioconversion of Lphenylalanine to 2phenylethanol by Saccharomyces cerevisiae[J].Enzyme and microbial technology，2003，32（2）：212-223.

[37] WANG H，DONG Q F，GUAN A，et al.Synergistic inhibition effect of 2phenylethanol and ethanol on bioproduction of natural 2phenylethanol by Saccharomyces cerevisiae and process enhancement[J].Journal of bioscience and bioengineering，2011，112（1）：26-31.

[38] 王航，董清風(fēng)，孟春，等.釀酒酵母轉(zhuǎn)化生成2-苯乙醇分批補(bǔ)料工藝優(yōu)化[J].過程工程學(xué)報(bào)，2010，10（4）：767-771.

[39] ETSCHMANN M M W，SELL D，SCHRADER J.Medium optimization for the production of the aroma compound 2phenylethanol using a genetic algorithm[J].Journal of molecular catalysis B：Enzymatic，2004，29（1/2/3/4/5/6）：187-193.

[40] ETSCHMANN M M W，SCHRADER J.An aqueousorganic twophase bioprocess for efficient production of the natural aroma chemicals 2phenylethanol and 2phenylethylacetate with yeast[J].Applied microbiology and biotechnology，2006，71（4）：440-443.

[41] 關(guān)昂，王航，孟春，等.原位轉(zhuǎn)移技術(shù)用于酵母合成2-苯乙醇[J].過程工程學(xué)報(bào)，2009，9（1）：128-132.

[42] IRAQUI I，VISSERS S，CARTIAUX M，et al.Characterization of Saccharomyces cerevisiae ARO8 and ARO9 genes encoding aromatic aminotransferases I and II reveals a new aminotransferase subfamily[J].Molecular and general genetics，1998，257（2）：238-248.

[43] VURALHAN Z，MORAIS M A，TAI S L，et al.Identification and characterization of phenylpyruvate decarboxylase genes in Saccharomyces cerevisiae[J].Applied and environmental microbiology，2003，69（8）：4534-4541.

[44] KIM B，CHO B R，HAHN J S.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of 2phenylethanol via Ehrlich pathway[J].Biotechnology and bioengineering，2014，111（1）：115-124.

[45] YIN S，ZHOU H，XIAO X，et al.Improving 2phenylethanol production via ehrlich pathway using genetic engineered Saccharomyces cerevisiae strains[J].Current microbiology，2015，70（5）：762-767.

[46] 華寶香化科技發(fā)展（上海）有限公司，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝：CN 02137575.5[P].2003-03-19.

[47] 孫九喆，李永寬，鄭峰洋，等.香料生物合成及其在卷煙料液中的應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008（4）：64-66.

[48] ZORN H，LANGHOFF S，SCHEIBNER M，et al.Cleavage of β，βcarotene to flavor compounds by fungi[J].Applied microbiology and biotechnology，2003，62（4）：331-336.

[49] 蒿洪欣，許園園，劉冬，等.降解類胡蘿卜素產(chǎn)香細(xì)菌的篩選及鑒定[J].食品科學(xué)，2014，35（9）：152-156.

[50] 王樹林，樊明濤.沙棘源微生物降解類β-胡蘿卜素芳香成分的研究[C]//第五屆國際沙棘協(xié)會(huì)大會(huì).西寧：國際沙棘協(xié)會(huì)，2011：70.

[51] 麻俊俠，樊明濤，王樹林，等.β-胡蘿卜素降解葡萄球菌化學(xué)合成培養(yǎng)基營養(yǎng)素的研究[J].食品科學(xué)，2013，34（5）：137-141.

[52] ZHU M M，HE J，WANG S L，et al.In vitro study on the carotenoid cleavage enzyme from Staphylococcus pasteuri cleaving different substrates[J].Journal of food and nutrition reaserch，2014，2（7）：411-418.

[53] 朱明明，賀靜，樊明濤，等.細(xì)菌類胡蘿卜素裂解酶酶解蝦青素工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2015，36（8）：1-5.

[54] 魏玉磊.煙草中糖對(duì)主流煙氣成分的影響研究[J].食品工業(yè)，2010（3）：62-63，64.

[55] 王吉中，楊琛琛，耿盧婧，等.硬毛蓋孔菌胞外多糖組分分析及其在卷煙煙氣中的轉(zhuǎn)移率[J].煙草科技，2012（6）：52-54.

[56] 許春平，楊琛琛，袁鷺，等.提取檉柳核纖孔菌發(fā)酵多糖開發(fā)煙用香料[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2012（12）：29-32.

[57] 許春平，史超文，毛多斌.發(fā)酵肺形側(cè)耳胞外多糖的成分分析及在卷煙中的應(yīng)用[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，28（1）：41-44.

[58] 曹健，張惠杰，許春平.二年殘孔菌胞外多糖組分分析及其在卷煙中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（2）：279-284.

[59] 楊黎華，李祖紅，陳東，等.香茅草產(chǎn)香內(nèi)生真菌的篩選及香氣成分分析[J].生物技術(shù)，2006，16（5）：53-56.

[60] 劉麗芬，李祖紅，李雪梅，等.香茅草產(chǎn)香菌發(fā)酵液的揮發(fā)性成分分析及在卷煙中的應(yīng)用[J].煙草科技，2007（11）：35-39.

[61] 周麗娟，鄭琳，劉煜宇，等.荔枝產(chǎn)香內(nèi)生菌的揮發(fā)性成分分析及其在卷煙中的應(yīng)用研究[J].精細(xì)化工，2010，27（10）：1013-1015.

[62] 朱宇，鄭琳，劉煜宇，等.西瓜內(nèi)生菌的揮發(fā)性成分分析及其發(fā)酵香料在卷煙中的應(yīng)用[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（4）：2093-2097.

[63] 龐登紅，董愛君，朱巍，等.特色煙用甜香型葡萄香料的制備及其在降低卷煙自由基中的應(yīng)用[J].生物加工過程，2012，10（2）：24-28.