孟凡麗

摘要：人參皂苷Rb3，人參二醇型皂苷的一種主要活性成分，已被證明對(duì)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型有抗糖尿病活性。本文為了探討人參皂苷Rb3在降低血糖方面的分子調(diào)控機(jī)制，利用HepG2細(xì)胞為研究材料，系統(tǒng)分析了人參皂苷Rb3對(duì)肝糖異生關(guān)鍵因子AMPK的影響。結(jié)值，與AMPK激活劑AICAP～能夠協(xié)同激活A(yù)MPK活性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該作用能夠被AMPK抑制劑Compound c部分阻斷，推測(cè)人參皂苷Rb3抑制肝糖異生作用是通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為重要的糖脂代謝靶點(diǎn)，在糖尿病及相關(guān)代謝類疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，這為探討人參皂苷Rb3治療糖尿病的作用機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：人參皂苷Rb3；HepG2細(xì)胞；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）；肝糖異生

糖尿病是一種世界性疾病，主要病因?yàn)榛颊唧w內(nèi)胰島素分泌的絕對(duì)或者相對(duì)不足而引發(fā)高血糖和尿糖，長(zhǎng)期高血糖還會(huì)導(dǎo)致心腦血管、腎、眼及神經(jīng)組織的病變，給患者造成很大危害。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病患者的數(shù)量呈快速上升趨勢(shì)。因此，開展糖尿病調(diào)控機(jī)制及防治方面的研究刻不容緩。

糖尿病的治療方法很多，有胰島素治療、胰島移植、基因治療、口服降糖藥物、“運(yùn)動(dòng)治療”和“飲食治療”等輔助治療方法。當(dāng)前口服降糖藥物包括三類，即促進(jìn)胰島素分泌類藥物、增加胰島素敏感性藥物和a葡萄糖苷酶的抑制劑類藥物。隨著中藥醫(yī)學(xué)的發(fā)展，源于中藥的降血糖藥物種類也不斷涌現(xiàn)，該類藥物除具有降血糖作用外，兼具有降血脂及改善血液黏度等效果。

人參皂苷Rb3，人參二醇型皂苷的一種成分，引起很大關(guān)注，因?yàn)榫哂卸喾N生物活性，如抗抑郁藥、抗細(xì)胞凋亡的影響，抗氧化活性和微循環(huán)的改善、降血糖、抗肥胖、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)保護(hù)作用、心血管保護(hù)作用等活性。前期我們研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb3能降低糖尿病小鼠血糖；增加血液中葡萄糖耐量和抗氧化；改善血脂紊亂，改善胰島素敏感性和耐藥性。在前期研究的基礎(chǔ)上，從分子水平研究人參皂苷Rb3降血糖機(jī)理，進(jìn)行人參皂苷Rb3對(duì)肝糖異生AMPK影響研究，為人參皂苷Rb3降血糖機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

人參皂苷Rb3（純度≥98.%HPL C）是上海士瑞化工實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；HepG2細(xì)胞系是中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所產(chǎn)品；AICAR（AMPK激發(fā)劑）、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基是美國(guó)sigma公司產(chǎn)品；AMPK、P-AMPK和二抗是SantaC ruz Biotechnology公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMsO）、小牛血清白蛋白、蛋白酶抑制劑是cocktail Roche診斷所產(chǎn)品；MTT（噻唑藍(lán)）是天津市魯鑫化工科技有限公司產(chǎn)品；Compound C（AMPK選擇性抑制劑）、葡萄糖試劑盒是北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品；ECL試劑盒是廣州寶泰克生物有限公司產(chǎn)品；X-膠片是EastmanKodak Company公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞系凍存管從液氮中取出于37℃水浴液化，然后轉(zhuǎn)移細(xì)胞至無(wú)菌的離心管（10毫升）中，加3毫升培養(yǎng)基并將細(xì)胞混勻，每分鐘1000轉(zhuǎn)離心5分鐘收集下層細(xì)胞系，用含15%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日換液。復(fù)蘇后的細(xì)胞系改用含有10%胎牛血清的D MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，當(dāng)有80%的細(xì)胞融合期時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶處理，并按1：3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT檢測(cè)

采用MTT方法檢測(cè)人參皂苷Rb3處理24小時(shí)后的HepG2細(xì)胞活力。人參皂苷Rb3參試濃度包括0，3.125，6.25，12.5，25，50微摩爾·升^-1作用。MTT處理細(xì)胞一定時(shí)間后，棄上清液并加入DMSO以溶解藍(lán)色結(jié)晶。利用酶標(biāo)儀測(cè)定490納米的吸光值，最后計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)存活率，細(xì)胞存活率=（處理組平均值OD/對(duì)照組平均值OD）×100。最后，確定對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)傷害的人參皂苷Rb3濃度，作為進(jìn)行葡萄糖生成和糖異生實(shí)驗(yàn)分析中的最佳給藥濃度。

1.4葡萄糖生成檢測(cè)

參照前人報(bào)道的方法進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，即CON、濃度分別為12.5微摩爾·升^-1和25微摩爾·升^-1的人參皂苷Rb3，設(shè)3次重復(fù)。具體步驟概括如下：首先，將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用24孔培養(yǎng)板每孔接種細(xì)胞懸液1毫升，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)（二氧化碳濃度為5%），處理24小時(shí)后；換用葡萄糖生成緩沖溶液于37℃（5%二氧化碳含量）培養(yǎng)4小時(shí)。最后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入EP管中，利用葡萄糖氧化酶法測(cè)定其中的葡萄糖濃度。

1.5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

當(dāng)HepG2細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞接種于6孔板（密度為每毫升5×104個(gè)，3毫升每孔），用DMEM培養(yǎng)（10%胎牛血清）培養(yǎng)。12小時(shí)后，放入含有25微摩爾·升^-1人參皂苷Rb3和/或1毫摩爾·升^-1AICAR和/或10微摩爾Compound C的DMEM培養(yǎng)基。孵育24小時(shí)后，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白和核蛋白。主要檢測(cè)細(xì)胞系中的下列蛋白表達(dá)水平，包括AMPK和p-AMPK。

1.6蛋白含量分析

HepG2細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA緩沖液處理，添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。用Bradford法測(cè)定蛋白（Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒）。免疫印跡分析被分離的進(jìn)行的表達(dá)通過Western blot檢測(cè)，用蛋白提取試劑盒提取40pg，總蛋白提取物用12%SD S聚丙烯酰胺凝膠電泳（sDS-PAGE）分離，濃縮膠電泳過程中采用80伏的恒壓，分離膠采用160伏。PVDF蛋白雜交膜首先用甲醇浸泡15秒以激活膜，然后放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。將蛋白膠及轉(zhuǎn)膜裝置等按照正確地順序放置好，然后在100伏簡(jiǎn)要流程如下：恒壓4℃轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST漂洗3次，每次10分鐘；然后用5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉處理2小時(shí)，也可用5%BSA封閉。采用標(biāo)準(zhǔn)的抗體雜交流程進(jìn)行第一抗體和第二抗體的雜交實(shí)驗(yàn)。將封閉過的膜用含有第一抗體的TBsT溶液4℃孵育過夜；然后，用含有第二抗體TBST溶液在37°C孵育1小時(shí)進(jìn)行雜交；接著用TBST漂洗液室溫漂洗3次，每次10分鐘；最后，進(jìn)行ECL試劑處理和X膠片壓片處理，獲得雜交圖片。掃描儀掃描X膠片，利用Quantity One軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果以目的蛋白OD與內(nèi)參OD比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。通過方差分析比較處理之間的差異，p<0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用方差分析，data用Mean±SE表示，兩組問比較采用t檢驗(yàn)分析，所有的統(tǒng)計(jì)軟件SPSSl3.0（SPSS公司，美國(guó)），p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果與分析

2.1人參皂苷Rb3對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的影響

通過MTT法進(jìn)行人參皂苷Rb3活性的檢測(cè)分析，研究結(jié)果表明（見圖1），人參皂苷Rb3給藥24小時(shí)后，濃度為3.125微摩爾·升^-16.25微摩爾·升^-1，12.5微摩爾^-1·升，25微摩爾·升^-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生少劑量的殺傷；而50微摩爾·升^-1的Rb3可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的明顯傷害，表現(xiàn)出細(xì)胞的皺縮和凋亡現(xiàn)象。因此，確定合適的人參皂苷Rb3給藥濃度為12.5微摩爾·升^-1、25微摩爾·升^-1進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

測(cè)定完葡萄糖含量之后用PBS漂洗下層的HepG2細(xì)胞；然后用蛋白酶將細(xì)胞裂解，并提取蛋白；最后在蛋白定量的基礎(chǔ)上將測(cè)得的葡萄糖含量與提取的總蛋白含量相比，這個(gè)比值可以更為準(zhǔn)確地體現(xiàn)人參皂苷Rb3對(duì)HepG2細(xì)胞中葡萄糖生成能力的抑制效應(yīng)。研究結(jié)果表明（見圖2），兩個(gè)劑量的人參皂苷Rb3均對(duì)HepG2細(xì)胞系的糖異生具有一定的抑制效應(yīng)，特別是25微摩爾·升1的劑量可產(chǎn)生顯著的抑制作用（p<0.05）。

2.2人參皂苷gb3對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK和p-AMPK表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究人參皂苷Rb3對(duì)糖異生的調(diào)控機(jī)制，利用AMPK的激動(dòng)劑AICAR和抑制劑Compound C系統(tǒng)分析了人參皂苷Rb3對(duì)AMPK表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)中，人參皂苷Rb3的給藥濃度為最佳濃度25微摩爾·升^-1，設(shè)6組處理，分別為CON（對(duì)照）組、人參皂苷Rb3組（25微摩爾·升^-1）、AICAR組（1毫摩爾·升^-1）、CompoundC組（10微摩爾·升^-1）、人參皂苷Rb3+AICAR組（25微摩爾·升^-1+1毫摩爾·升1）、人參皂苷Rb3+Compound C組（25微摩爾·升^-1+10微摩爾·升^-1）。研究結(jié)果表明（見圖3），人參皂苷Rb3和AICAR對(duì)AMPK具有一定的激活作用，而且p-AMPK的表達(dá)水平有所升高，特別是p-AMPK/總AMPK的比值表現(xiàn)尤為突出（圖3）。另外，人參皂苷Rb3和AI CAR表現(xiàn)出了對(duì)p-AMPK具有一定的協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)使用時(shí)p-AMPK的表達(dá)量顯著高于單獨(dú)使用的表達(dá)水平。

使用AMPK的抑制劑Compound C可以顯著抑制（p<0.05）細(xì)胞中總AMPK及其活化形式p-AMPK的表達(dá)水平，且p-AMPK與總AMPK的比值也變小，推斷Compound C對(duì)p-AMPK具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。當(dāng)人參皂苷Rb3和CompoundC同時(shí)使用時(shí)，p-AMPK的表達(dá)量顯著提高，特別是p-AMPK和AMPK的比值也顯著高于單加Compound C的處理。由此說(shuō)明，人參皂苷Rb3對(duì)AMPK的表達(dá)及其活化均有一定的作用，可能與其部分緩解Compound C對(duì)AMPK的抑制效應(yīng)有關(guān)。另外，人參皂苷Rb3和Compound C聯(lián)合使用時(shí)，p-AMPK的表達(dá)量及其與總AMPK的比值均極顯著（p<0.01）低于單用人參皂苷Rb3的處理，說(shuō)明Compound C可以部分阻斷人參皂苷Rb3對(duì)AMPK的激活效應(yīng)。

3.討論

肝癌細(xì)胞系HepG2是來(lái)源于人的肝細(xì)胞系，該類細(xì)胞具有正常肝細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，常用于肝臟糖異生的體外生物學(xué)功能研究。在實(shí)驗(yàn)過程中，可以測(cè)定Hep G2細(xì)胞的葡萄糖合成量來(lái)反映糖異生情況及其對(duì)2型糖尿病治療的作用。因此，利用HepG2細(xì)胞系常作為篩選糖尿病治療的藥物載體，是目前應(yīng)用的比較廣泛的降血糖效應(yīng)研究手段。

AMPK是細(xì)胞和系統(tǒng)的能量平衡調(diào)節(jié)因子，被缺氧、低糖和營(yíng)養(yǎng)不足代謝產(chǎn)物激活。在骨骼肌、肝臟和脂肪組織激活A(yù)MPK可以提高代謝、改善胰島素敏感性，并可能有利于糖尿病的治療。AMPK是一個(gè)有吸引力的藥物靶點(diǎn)，在全身能量平衡的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵的作用。肝臟AMPK的激活導(dǎo)致增加脂肪酸氧化，同時(shí)抑制肝葡萄糖生產(chǎn)以及脂肪和膽固醇的合成。

為了系統(tǒng)分析人參皂苷Rb3對(duì)AMPK的調(diào)控機(jī)制，本研究中使用了AMPK的抑制劑Compound c和激活劑AICAR，增加了正負(fù)對(duì)照組及處理的組合，這樣實(shí)驗(yàn)處理的設(shè)置更為系統(tǒng)科學(xué)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb3和AMPK的激活劑AICAR對(duì)HepG2細(xì)胞中的AMPK均具有活性作用，說(shuō)明AMPK是人參皂苷Rb3作用的重要靶位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，人參皂苷Rb3對(duì)糖異生作用有明顯的抑制作用，至少部分相關(guān)的人參皂苷Rb3對(duì)AMPK的激活和下游信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞中的。在這項(xiàng)研究中，這個(gè)反應(yīng)的HepG2細(xì)胞對(duì)人參皂苷Rb3對(duì)肝臟糖異生作用，AMPK介導(dǎo)的影響，對(duì)糖異生的分子調(diào)控機(jī)制研究的抑制提供了理論依據(jù)。