熒光分光光度法測(cè)定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量研究

胡家勇，柳迪，程銀棋，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢430060）

熒光分光光度法測(cè)定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量研究

胡家勇，柳迪，程銀棋，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢430060）

建立熒光分光光度法測(cè)定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的方法。在弱酸性條件下，以鄰苯二甲醛/銨鹽為熒光指示劑，亞硫酸氫鈉為定量標(biāo)準(zhǔn)，熒光強(qiáng)度作為考察指標(biāo)，測(cè)定樣品中的二氧化硫殘留量。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=23.22X+0.854，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8、檢出限為0.732 mg/kg、加標(biāo)回收率在95.3%～104.8%之間、精密度良好、檢測(cè)結(jié)果可靠。熒光分光光度法可以作為淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的測(cè)定方法。

熒光分光光度法；比色法；二氧化硫殘留量；淀粉及其衍生物

亞硫酸鹽作為一種漂白劑、抗氧化劑和抗菌劑，廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中。亞硫酸鹽常被用作食品清潔和保存，檢測(cè)結(jié)果通常以二氧化硫殘留量計(jì)。淀粉是一種多糖，是植物貯存能量的一種方式，淀粉除食用外，也是食品行業(yè)的重要配料，工業(yè)上用于制備糊精、麥芽糖、葡萄糖、酒精等。淀粉也是百姓日常生活中必不可少的原料之一。為了保證產(chǎn)品的白度，淀粉提取工藝中會(huì)使用二氧化硫達(dá)到漂白的目的，如馬鈴薯淀粉提取時(shí)，由于馬鈴薯塊莖中含有絡(luò)氨酸酶會(huì)使淀粉變色，因此粉碎時(shí)通入二氧化硫，以抑制絡(luò)氨酸酶的作用[1]。二氧化硫?qū)θ梭w有很大傷害，長(zhǎng)期或大劑量攝入可造成胃腸和肝臟的損壞，會(huì)使血紅蛋白減少[2-5]，因此國(guó)家規(guī)定淀粉中二氧化硫殘留量不得超過(guò)30.00 mg/kg[6]。食品中二氧化硫殘留量測(cè)定的常規(guī)方法是采用國(guó)標(biāo)GB 5009.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中二氧化硫的測(cè)定》中的滴定法[7]及鹽酸副玫瑰苯胺比色法[8]，滴定法存在終點(diǎn)不敏銳，方法重復(fù)性與準(zhǔn)確性差，并且需要蒸餾，過(guò)程比較繁瑣，不適合大量樣品的檢測(cè)；而鹽酸副玫瑰苯胺比色法所使用的吸收液四氯汞鈉存在重金屬汞污染，方法不環(huán)保；其他測(cè)定食品中二氧化硫的方法尚有高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜法[11-13]、離子色譜法等[14-16]，幾種色譜法需要相應(yīng)的設(shè)備及填充柱，檢測(cè)成本較高，對(duì)檢測(cè)人員的素質(zhì)要求也較高。

本研究是基于在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽與鄰苯二甲醛、乙酸銨反應(yīng)能夠生成異吲哚-1-磺酸鹽熒光化合物，建立了熒光光度法測(cè)定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量，以期為淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的測(cè)定提供一個(gè)方法參考，也可作為食品中二氧化硫殘留量測(cè)定的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉樣品均是市場(chǎng)抽檢樣品。

亞硫酸氫鈉、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（均分析純）：Aladdin科技（中國(guó)）有限公司；乙酸銨、無(wú)水乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600分子熒光分光光度計(jì)：日本日立公司；ME203/02電子天平、ME2002E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；827 pH Lab pH計(jì)：瑞士萬(wàn)通有限公司；MEMMERT WNB29水浴鍋：德國(guó)Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光衍生法原理

在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽與鄰苯二甲醛、乙酸銨反應(yīng)生成異吲哚-1-磺酸鹽熒光化合物[17]，熒光強(qiáng)度與其濃度呈正比。以亞硫酸氫鈉作為對(duì)照品，用來(lái)定量樣品中的二氧化硫殘留量。

1.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

吸取亞硫酸氫鈉使用液0.3 mL（相當(dāng)于15 μg二氧化硫），置于25 mL帶塞比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL、鄰苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸銨1.5 mL，混勻，用水定容至刻度，于50℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，放入冰水中冷卻，靜置30 min后用熒光分光光度計(jì)掃描吸收和發(fā)射光譜圖，確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

1.3.3 試劑配制

亞硫酸氫鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取亞硫酸氫鈉對(duì)照品0.250 0 g，加水溶解定容至100 mL，避光冷藏，備用，使用前按下述方法標(biāo)定。

吸取10.0 mL亞硫酸氫鈉水溶液于250 mL碘量瓶中，加100 mL水，準(zhǔn)確加入20.00 mL碘溶液（0.1 mol/L），5 mL冰乙酸，搖勻，放置于暗處，2 min后迅速以硫代硫酸鈉（0.100 mol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色，加0.5 mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至無(wú)色。另取110 mL水，準(zhǔn)確加入碘溶液20.0 mL（0.1 mol/L）、5 mL冰乙酸，按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度計(jì)算公式如下：

式中：X—二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；V1—亞硫酸氫鈉儲(chǔ)備液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2—試劑空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；c—硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L；32.03—每毫升硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于二氧化硫的質(zhì)量，mg。

亞硫酸氫鈉使用液：臨用前將亞硫酸氫鈉儲(chǔ)備液稀釋成每毫升相當(dāng)于50 μg二氧化硫。

鄰苯二甲醛溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取鄰苯二甲醛26.82 mg，用無(wú)水乙醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，即得。避光冷藏，臨用新配。

乙酸銨溶液：稱(chēng)取乙酸銨0.3850g，用去離子水溶解，定容至1 000 mL容量瓶中，即得。

磷酸鹽緩沖溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸氫二鈉2.13 g、磷酸二氫鉀2.04 g，加水溶解后定容至100 mL容量瓶中，即得。

1.3.4 亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

吸取亞硫酸氫鈉使用液0、0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL（相當(dāng)于0、0.5 μg、1.5 μg、2.5 μg、5.0 μg、15.0 μg、25.0 μg二氧化硫），分別置于25 mL帶塞比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL、鄰苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸銨1.5 mL，混勻，用去離子水定容至刻度，于50℃水浴中反應(yīng)5min，取出，放入冰水中冷卻，靜置30min，于1cm的石英比色皿中測(cè)定熒光強(qiáng)度。以二氧化硫含量（x）為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)繪制亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 熒光化合物生成及測(cè)定[17]

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品2.50 g于50 mL離心管中，40℃水浴振蕩提取后，移取樣品溶液10.0 mL于25 mL帶塞比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL、鄰苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸銨1.5 mL，混勻，用水定容至刻度，于50℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，放入冰水中冷卻，靜置30 min，于1 cm的石英比色皿中測(cè)定熒光強(qiáng)度。按照亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中二氧化硫殘留量，其計(jì)算公式如下：

式中：X—二氧化硫殘留量，mg/kg；m—測(cè)定用試樣中二氧化硫殘留量的質(zhì)量，μg；V1—樣品定容體積，mL；V2—樣液移取體積，mL；M—樣品稱(chēng)取質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)為390nm，掃描激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)光譜分別在波長(zhǎng)221 nm和320 nm處出現(xiàn)二個(gè)光譜峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為221 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)，最大發(fā)射光譜峰在386 nm；設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)，最大發(fā)射光譜峰在386 nm，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 熒光激發(fā)光譜圖Fig.1 Fluorescence of excitation spectra

圖2 熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence of emission spectra

根據(jù)波長(zhǎng)掃描確定激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)后，試驗(yàn)過(guò)程中熒光分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)221nm、386nm和320nm、386nm，積分時(shí)間0.1s，延遲時(shí)間0.1 s，激發(fā)波長(zhǎng)狹縫寬度5.0 nm，發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度5.0 nm，光電倍增管電壓250 V。

2.2 亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別在激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為221nm、386nm和320nm、386 nm條件下繪制亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在0～1 000 μg/L范圍內(nèi)，激發(fā)波長(zhǎng)320 nm、發(fā)射波長(zhǎng)386 nm條件下，亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的線性相關(guān)性（0.999 8）優(yōu)于激發(fā)波長(zhǎng)221 nm、發(fā)射波長(zhǎng)386 nm條件下的線性相關(guān)性（0.984 0），雖然二者在0～600 μg/L范圍內(nèi)有一致的線性相關(guān)性，但是線性范圍變窄。因此，確定最佳激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為320 nm和386 nm。

圖3 亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of sodium bisulfite

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 方法精密度試驗(yàn)

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

稱(chēng)取3個(gè)未知二氧化硫殘留量的淀粉各5份進(jìn)行平行性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，3個(gè)二氧化硫殘留量不同的樣品平行性試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均＜10%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.3.2 方法最低檢測(cè)限

表2 檢出限測(cè)定結(jié)果Table 2 Detection results of limit of detection

由表2可知，連續(xù)11次進(jìn)空白樣品，根據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得出本方法二氧化硫檢出限為0.732 mg/kg。

2.3.3 方法加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已知二氧化硫含量的淀粉3份，精確加入亞硫酸氫鈉對(duì)照品溶液適量（相當(dāng)于加入二氧化硫含量是70 μg），按供試品溶液的制備與測(cè)定同法操作，計(jì)算二氧化硫加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，方法的回收率在95.3%～104.8%之間，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.3.4 方法穩(wěn)定性試驗(yàn)

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of stability experiments

同一樣品分別放置0、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h后測(cè)定一次，分別記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，高質(zhì)量濃度二氧化硫（30.231 mg/kg）熒光強(qiáng)度與低質(zhì)量濃度二氧化硫（2.405mg/kg）熒光強(qiáng)度在2.0 h內(nèi)均衰減不顯著（P＞0.05），由此可以說(shuō)明樣品溶液在避光冷藏放置2.0h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 熒光分光光度法與鹽酸副玫瑰苯胺比色法、滴定法比較

淀粉中二氧化硫測(cè)定通常采用GB5009.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中二氧化硫的測(cè)定》中的滴定法以及鹽酸副玫瑰苯胺比色法，而關(guān)于熒光分光光度法測(cè)定淀粉中二氧化硫的報(bào)道則比較少。故將熒光分光光度法檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)滴定法、鹽酸副玫瑰苯胺比色法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，3種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05），且熒光分光光度法精密度更好。由此可見(jiàn)，熒光分光光度法更適合測(cè)定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量。

表5 熒光分光光度法與比色法和滴定法比較Table 5 Comparison of fluorescence spectrophotometry with colorimetric method and titrimetry

3 結(jié)論

基于亞硫酸氫鹽、鄰苯二甲醛與銨鹽反應(yīng)生成熒光化合物的原理，本研究建立了熒光分光光度法作為測(cè)定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的方法，該方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示：方法的最低檢測(cè)限為0.732 mg/kg，亞硫酸氫鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程y=23.22x+0.854，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.81%～5.16%，加標(biāo)回收率在95.3%～104.8%之間，溶液在避光冷藏放置2 h內(nèi)穩(wěn)定，熒光分光光度法檢測(cè)結(jié)果與GB 5009.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中二氧化硫的測(cè)定》滴定法及鹽酸副玫瑰苯胺比色法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明熒光分光光度法可以作為測(cè)定淀粉中二氧化硫殘留量的方法。

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Determination of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives by fluorescence spectrophotometry

HU Jiayong,LIU Di,CHENG Yinqi,PENG Qingzhi*
(Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test,Wuhan 430060,China)

The determination method of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives by fluorescence spectrophotometry was established.In weak acid conditions,using the o-phthalaldehyde/ammonium salt as fluorescent indicator,sodium bisulfite as quantitative standard,fluorescence intensity as evaluation index,the sulfur dioxide residue content in simples was determined.The results showed that the linear regression equation of standard curve wasY=23.22X+0.854.The linearly dependent coefficient(R2)was 0.999 8,the limit of detection was 0.732 mg/kg,the adding standard recovery rate was in the range of 95.3%-104.8%,which indicated that the method had good precision and reliable test results.The fluorescence spectrophotometry could be used for determination method of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives.

fluorescence spectrophotometry;colorimetric method;sulfur dioxide residue;starch and its derivatives

O657.31

0254-5071（2017）06-0175-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.036

2017-03-10

胡家勇（1990-），男，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：彭青枝（1967-），女，研究員，博士研究生，研究方向食品質(zhì)量與安全。