郝 鳳，劉曉靜，范俊俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

NO3--N/NH4+-N不同配比下紫花苜蓿氮代謝關(guān)鍵酶及鉬、鐵元素含量研究

郝 鳳，劉曉靜，范俊俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

以西北地區(qū)廣泛種植的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料紫花苜蓿“甘農(nóng)3號(hào)”為試驗(yàn)材料，在室外防雨網(wǎng)室內(nèi)，采用盆栽營(yíng)養(yǎng)液沙培法，在適宜氮素供應(yīng)水平210 mg·L-1基礎(chǔ)上，研究NO3--N和NH4+-N混合的7種配比(NO3--N/NH4+-N分別為12.5/87.5、25/75、37.5/62.5、50/50、62.5/37.5、75/25、87.5/12.5，依次標(biāo)為1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1)對(duì)紫花苜蓿全生育期各部位硝酸還原酶(NR)、固氮酶活性及鉬(Mo)、鐵(Fe)營(yíng)養(yǎng)吸收的影響。結(jié)果表明：(1) 從部位來(lái)看，紫花苜蓿NR活性、Mo含量趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)為：葉>根>莖，而Fe含量則表現(xiàn)為根>葉>莖；不同配比下各部位NR活性均表現(xiàn)為配比中NO3--N比例大時(shí)，其活性較高，尤其是生長(zhǎng)前期當(dāng)NO3--N/NH4+-N為7/1時(shí)，各部位NR活性均最高；不同配比對(duì)根中Mo含量的影響在苗期與NR趨勢(shì)相近，在NO3--N比例大時(shí)達(dá)最高。現(xiàn)蕾期與固氮酶活性相同，1/7時(shí)最高。成熟期同固氮酶與NR活性，均為5/3時(shí)最高；不同配比對(duì)根中Fe含量的影響與固氮酶活性變化趨勢(shì)相一致，苗期均為1/7處理最高，盛花期至成熟期均為5/3處理最高。(2) 從生育期來(lái)看，紫花苜蓿全生育期NR和固氮酶活性變化趨勢(shì)均呈單峰曲線；NR活性在盛花期最高，即盛花期氮代謝能力最強(qiáng)，且各生育期均為配比中NO3--N比例大時(shí)NR活性高，氮代謝能力較強(qiáng)；固氮酶活性在結(jié)莢期最高，即結(jié)莢期根瘤固氮能力最強(qiáng)，且苗期和現(xiàn)蕾期均表現(xiàn)為1/7處理其活性最高，盛花期至成熟期5/3處理活性最高；不同配比對(duì)莖和葉中Mo、Fe含量的影響基本相同，現(xiàn)蕾期至盛花期在配比中NH4+-N比例大時(shí)含量最高，結(jié)莢期至成熟期在配比中NO3--N比例大時(shí)含量最高。(3) NR和固氮酶活性相互關(guān)系在整個(gè)生育期表現(xiàn)不同：在紫花苜蓿生長(zhǎng)前期(苗期至現(xiàn)蕾期)，NO3--N/NH4+-N=7/1時(shí)NR活性最大，1/7處理NR活性最小，而固氮酶活性則相反，二者表現(xiàn)出拮抗關(guān)系；在紫花苜蓿生長(zhǎng)中、后期(盛花期至成熟期)NR活性與固氮酶活性均在NO3--N/NH4+-N=5/3時(shí)達(dá)最大值，二者又相互促進(jìn)。

NO3--N/NH4+-N配比；紫花苜蓿；氮代謝；酶；鉬；鐵

紫花苜蓿(Medicagosativa)是西北干旱半干旱地區(qū)人工種植面積最大的優(yōu)質(zhì)多年生豆科牧草[1]，由于其獨(dú)特的氮利用方式成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的植物蛋白資源[2]，尤其對(duì)西北生態(tài)脆弱區(qū)的生態(tài)修復(fù)和草食畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義[3]。紫花苜蓿雖可通過(guò)共生固氮利用分子態(tài)氮，但根瘤固定的氮素僅占其一生需氮量的50%～60%[4]，并不能滿足其生長(zhǎng)所需，在土壤氮貧瘠的西北地區(qū)，尤其在干旱荒漠化地區(qū)[5]，補(bǔ)充外源氮是生產(chǎn)的必要保證。在以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)為目的的生產(chǎn)中，要求外源氮既要滿足生產(chǎn)需要又不對(duì)共生固氮產(chǎn)生抑制，因此加強(qiáng)自身的氮代謝能力是提高氮素利用效率的重要途徑。

紫花苜蓿的氮素同化途徑有兩種：一是固氮酶把大氣中N2還原為氨。固氮酶是固氮生物體內(nèi)能將空氣中的氮還原成氨的生物催化劑，固氮酶活性是衡量固氮效能的重要指標(biāo)。二是硝酸還原酶(Nitrate reductase,NR)把硝態(tài)氮還原為亞硝酸，再由亞硝酸還原為氨。NR是植物體內(nèi)NO3--N同化步驟中的第一個(gè)酶，也是整個(gè)同化過(guò)程的限速酶，在植物氮代謝中起關(guān)鍵作用[6]。對(duì)大部分植物來(lái)說(shuō)，此反應(yīng)在根、莖和葉中都可進(jìn)行，通常綠色組織更為活躍[7]。而微量元素鉬(Mo)、鐵(Fe)是氮代謝關(guān)鍵酶的活化劑，在植物固氮和硝酸還原過(guò)程中二者缺一不可，對(duì)氮的吸收利用有促進(jìn)作用[8]。Mo是NR和固氮酶的組成因子，對(duì)豆科植物的氮代謝有重要的促進(jìn)作用，且Mo可以明顯提高NR活性，加強(qiáng)氮代謝[9]。Fe直接參與豆科作物共生固氮，是固氮酶、NR、鐵氧還原蛋白等含鐵蛋白的重要金屬組分[10]。對(duì)于豆科植物來(lái)說(shuō)，F(xiàn)e可促進(jìn)根瘤形成，提高固氮能力，且缺Fe時(shí)植物體內(nèi)NR降低，NO3--N同化受阻[11]。因此，Mo、Fe以及固氮酶和NR是反映植物氮代謝能力的重要指標(biāo)。

土壤中可供植物直接利用的氮素形態(tài)主要是硝態(tài)氮(NO3--N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)，其對(duì)植物生理代謝過(guò)程的影響不同[12]。生長(zhǎng)在不同土壤環(huán)境中的植物通過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，形成了各自特有的對(duì)NO3--N和NH4+-N的喜好，如水田作物水稻喜NH4+-N，而玉米、小麥、白菜等旱地作物則偏好NO3--N，且同一作物在不同的生長(zhǎng)階段對(duì)NO3--N和NH4+-N的喜好亦有變化[13]。有研究表明，大多數(shù)作物NO3--N與NH4+-N配合施用較單獨(dú)施用效果好，其最佳配比隨作物生育期不同而不同[14]。同是旱地植物的紫花苜蓿，已有研究證實(shí)，NO3--N和NH4+-N混合施用較單一NO3--N或NH4+-N更能促進(jìn)紫花苜蓿的根系生長(zhǎng)[15]，并促進(jìn)其氮代謝[16]。另一方面西北地區(qū)氣候較為干燥，土壤偏堿性的條件下[17]，土壤硝化作用強(qiáng)烈而反硝化作用較弱，土壤中易于積累硝態(tài)氮[18]。Britto等[19]研究表明，NO3--N和NH4+-N聯(lián)合供應(yīng)時(shí)，植物吸收NH4+-N產(chǎn)生的根際酸化又可以抵消吸收NO3--N引起的根際堿化。因此，了解NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿氮代謝酶及Mo、Fe的影響對(duì)加強(qiáng)其自身的氮代謝能力，提高外源氮利用效率有重要作用。為此，本研究采用砂培法以避免土壤氮的干擾，并利用營(yíng)養(yǎng)液，模擬土壤中可供植物直接吸收利用的兩種氮素形態(tài)的多種比例，研究不同NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿硝酸還原酶(NR)、固氮酶活性及Mo、Fe營(yíng)養(yǎng)吸收的影響，以期為西北干旱區(qū)有效調(diào)節(jié)紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)狀況及調(diào)控其土壤氮營(yíng)養(yǎng)高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿和中華根瘤菌(12531)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 土壤中氮素形態(tài)比例的模擬

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果設(shè)氮素水平為210 mg·L-1(以純氮計(jì))[20]，將NO3--N和NH4+-N按不同比例混合，以NO3--N所占比例由小到大，NO3--N/NH4+-N分別為12.5/87.5；25/75；37.5/62.5；50/50；62.5/37.5；75/25；87.5/12.5，依次標(biāo)為1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1，共模擬出土壤中的可供植物直接吸收利用的兩種氮素形態(tài)(NO3--N和NH4+-N)的7種比例，共7個(gè)處理，每處理重復(fù)15次，完全隨機(jī)排列。

1.3 砂培試驗(yàn)

為了更接近田間環(huán)境條件，且避免土壤氮的干擾，本試驗(yàn)設(shè)在室外防雨網(wǎng)室內(nèi)，并采用營(yíng)養(yǎng)液砂培法。營(yíng)養(yǎng)液以Hoagland無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液為基礎(chǔ)，利用Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，調(diào)節(jié)pH值為7。

2014年4月10日，選取顆粒飽滿、均一的種子，經(jīng)95%乙醇滅菌30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min，后用無(wú)菌水洗5～6次，最后拿無(wú)菌濾紙吸干。選用直徑32 cm、高20 cm的花盆，裝入經(jīng)自來(lái)水沖洗再用蒸餾水清洗并經(jīng)過(guò)高溫(121℃)滅菌的粗砂10 kg。每盆播種100粒，播種初期每日噴澆3次蒸餾水，每次100 mL，直至對(duì)生真葉完全展開，每盆保留健壯植株50株。長(zhǎng)至3片復(fù)葉時(shí)，每盆接種根瘤菌液50 mL。為防止鹽分積累，每7 d用蒸餾水充分淋洗，再重新加入營(yíng)養(yǎng)液500 mL，直至取樣。

1.4 采樣時(shí)期的劃分

苗期(5月15日)：有80%的植株開始分枝時(shí)；

現(xiàn)蕾期(6月5日)：有15%以上的植株在葉腋間已形成花蕾時(shí)；

盛花期(6月25日)：有75%左右的分枝開始開花；

結(jié)莢期(7月15日)：有10%以上的分枝花序已結(jié)莢；

成熟期(8月5日)：有80%以上的果實(shí)成熟。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

硝酸還原酶(NR)活性：采用離體法測(cè)定[21]，稱取0.5 g葉片，加4 mL緩沖提取液，冰浴研磨成勻漿。4℃下4 000 r·min-1離心15 min，上清液即酶的粗提液用于NR活性的測(cè)定。

固氮酶活性：采用乙炔還原法[22]測(cè)定。測(cè)定儀器為GC-7890F氣相色譜儀，柱溫170℃，進(jìn)樣器140℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器150℃。氣體壓力：N2為0.3 MPa，H2為0.08 MPa，空氣為0.15 MPa。

C2H4水平(μmol·g-1·h-1)=hx(樣品峰面積)×C(標(biāo)準(zhǔn)C2H4水平，μmol·mL-1)/hs(標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積)×V(反應(yīng)氣體體積)×t(C2H2反應(yīng)時(shí)間，h)×m(瘤重，g)。

鉬(Mo)、鐵(Fe)含量的測(cè)定：選擇晴天上午9∶00—10∶00。將紫花苜蓿植株地上部取下，莖葉分開并放入烘箱105℃殺青15 min，65℃～75℃下烘干至恒重后粉碎。稱量草粉1 g，用1 mol·L-1鹽酸浸提，提取液用原子吸收光譜法測(cè)定Mo、Fe元素的含量[23]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，并用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿不同生育期硝酸還原酶(NR)活性

氮素水平210 mg·L-1下，NR活性受氮素形態(tài)配比的影響很大(圖1)。整個(gè)生育期NR活性表現(xiàn)為：葉>根>莖。全生育期各配比下NR活性變化趨勢(shì)均呈單峰曲線，在盛花期時(shí)最大，而后迅速下降，成熟期時(shí)NR活性均最低，且各部位具有一致的變化趨勢(shì)。從生育期來(lái)看，各生育期NO3--N所占比例大時(shí)，NR活性均較高，苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。苗期NO3--N/NH4+-N為7/1時(shí)，NR活性顯著高于其它處理(P<0.05)；現(xiàn)蕾期NO3--N/NH4+-N為7/1，NR活性最高，但與5/3處理差異不顯著(P>0.05)；盛花期至成熟期NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，各部位NR活性均最大，但成熟期各處理間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性

整個(gè)生育期，各處理下紫花苜蓿的固氮酶活性均隨著生育期的推進(jìn)呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)(表1)。氮素水平210 mg·L-1下，氮素形態(tài)配比對(duì)紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性的影響較大。苗期和現(xiàn)蕾期紫花苜蓿的固氮酶活性表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N<5/5時(shí)，固氮酶活性較高，且最高值出現(xiàn)在1/7處理；盛花期至成熟期NO3--N/NH4+-N配比為5/3時(shí)，固氮酶活性最大，在盛花期5/3處理顯著高于其它處理(P<0.05) ，結(jié)莢期和成熟期5/3和7/1處理差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于其它處理(P<0.05)。由此可見(jiàn)，紫花苜蓿中后期NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，自身固氮能力較強(qiáng)。

圖1 NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿不同生育期各部位NR的影響

表1 NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性的影響/(μmol·g-1·h-1)

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level.

2.3 紫花苜蓿不同生育期鉬(Mo)含量

氮素形態(tài)配比對(duì)紫花苜蓿各部位中Mo含量的變化影響較大(圖2)。不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿各部位中Mo含量整體表現(xiàn)為葉>根>莖，三者中Mo含量隨著生育期的推進(jìn)均呈先增加后減小的趨勢(shì)，均在苗期最低，葉中Mo含量在結(jié)莢期最高，莖和根中則在盛花期達(dá)到峰值。

苗期，紫花苜蓿各部位中Mo含量均表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比為3/1時(shí)顯著高于其它處理(P<0.05)；現(xiàn)蕾期，NO3--N/NH4+-N<5/5時(shí)各部位中Mo含量均較高，且1/7處理顯著高于其它處理(P<0.05)；盛花期至結(jié)莢期，隨NO3--N/NH4+-N比例的上升，各部位中Mo含量也發(fā)生變化。盛花期，根、莖和葉中Mo含量均在3/5處理下最大，且顯著高于其它處理(P<0.05)；結(jié)莢期，葉和莖中NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)Mo含量最高，而根中則3/1處理顯著高于其它處理(P<0.05)；至成熟期，紫花苜蓿葉、莖中Mo含量減少較多，根中Mo含量仍保持較高水平，且葉和莖中Mo含量在3/1處理時(shí)，顯著高于其它處理(P<0.05)，根中在5/3處理下含量最高。由此可見(jiàn)，在不同氮素形態(tài)下，紫花苜蓿前中期NH4+-N更有利于其對(duì)Mo營(yíng)養(yǎng)的吸收，而到后期則相反。

2.4 紫花苜蓿不同生育期鐵(Fe)含量

從紫花苜蓿不同生育期對(duì)各部位Fe的吸收來(lái)看(圖3)，F(xiàn)e含量均表現(xiàn)為根>葉>莖。由圖3所示，苗期至結(jié)莢期葉片中的鐵含量整體呈緩慢上升趨勢(shì)，結(jié)莢期至成熟期略有下降。莖中Fe的含量比較穩(wěn)定，但在結(jié)莢期時(shí)有所下降。而根部Fe含量在苗期至盛花期快速升高，結(jié)莢期有所下降，成熟期時(shí)達(dá)到峰值。

苗期，葉和莖中Fe含量在NO3--N/NH4+-N為3/1時(shí)均顯著高于其它處理(P<0.05)，根中則為NO3--N/NH4+-N為1/7時(shí)最高；現(xiàn)蕾期各部位中Fe含量均在1/3處理達(dá)最大值，且顯著高于其它處理(P<0.05)；盛花期葉和莖中Fe含量在NO3--N/NH4+-N為1/3時(shí)最高，而根則在5/3時(shí)最高；結(jié)莢期葉中Fe含量在NO3--N/NH4+-N為5/5時(shí)最高，根和莖中在5/3處理達(dá)最大值，且顯著高于其它處理(P<0.05)；成熟期葉中Fe含量最大值出現(xiàn)在3/1處理，莖中Fe含量在7/1處理下顯著高于其它處理(P<0.05)，而根中Fe含量則表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N所占比例大的處理積累的Fe含量較多，且在NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)最大。

3 討論與結(jié)論

3.1 NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿各部位氮代謝的影響

本研究中，不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿5個(gè)生育期的NR活性均表現(xiàn)為：葉>根>莖，說(shuō)明葉是紫花苜蓿同化NO3--N的最主要部位，在其它作物的研究中已證實(shí)[24]。在不同NO3--N和NH4+-N配比處理下，紫花苜蓿根、莖、葉中NR活性均表現(xiàn)為：配比中NO3--N所占比例大時(shí)，其活性較高，尤其是苗期至現(xiàn)蕾期當(dāng)NO3--N/NH4+-N為7/1時(shí)，NR活性最高。黃俊[25]等對(duì)白菜的研究也發(fā)現(xiàn)NO3--N/NH4+-N不同，葉片內(nèi)的NR活性差異顯著，并在比例為75/25時(shí)，NR活性最強(qiáng)。主要是因?yàn)镹R不僅是氮代謝過(guò)程中的限速酶，同時(shí)還是一種誘導(dǎo)酶[5]，NR可被介質(zhì)中的NO3-所誘導(dǎo)，其活性取決于介質(zhì)中NO3-的濃度，且與之呈正相關(guān)[26]，因此，環(huán)境中NO3-的增加可誘導(dǎo)其體內(nèi)NR活性的提高。

圖2 NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿不同生育期各部位鉬含量的影響

圖3 NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿不同生育期不同部位鐵含量的影響

本研究中紫花苜蓿各部位Mo含量表現(xiàn)為：葉>根>莖，且各部位Mo含量均在苗期最低，吳明才等[27]研究發(fā)現(xiàn)大豆各部位Mo含量也均在苗期最低。根中Mo含量的最大值隨著生育期的推進(jìn)出現(xiàn)在不同的NO3--N/NH4+-N配比下，苗期為3/1時(shí)最大，現(xiàn)蕾期為1/7時(shí)最大，而至成熟期又在5/3處理達(dá)最大值，分析認(rèn)為紫花苜蓿生長(zhǎng)初期根瘤尚未形成，根瘤固氮能力較低，對(duì)Mo的需求還未與NR形成競(jìng)爭(zhēng)，因此在苗期NO3--N/NH4+-N配比對(duì)根中Mo含量的影響與NR趨勢(shì)相近，在NO3--N所占比例大時(shí)Mo含量達(dá)最高。隨著生育期的推進(jìn)，大量根瘤形成，根瘤固氮能力大幅度提高，對(duì)Mo的需求量大于NR對(duì)其的競(jìng)爭(zhēng)，因此現(xiàn)蕾期NO3--N/NH4+-N配比對(duì)根中Mo含量的影響與固氮酶活性趨勢(shì)相近，在NH4+-N所占比例大時(shí)Mo含量達(dá)最高。至生育后期，根瘤老化，根瘤固氮能力開始下降并與NR對(duì)Mo的競(jìng)爭(zhēng)協(xié)同共進(jìn)，因此成熟期NO3--N/NH4+-N配比對(duì)根中Mo含量的影響同固氮酶活性與NR，均在NO3--N所占比例大時(shí)Mo含量達(dá)最高。

Fe是植物體內(nèi)鐵氧還原蛋白的重要組分，直接影響NR活性并參與豆科作物共生固氮。本研究中紫花苜蓿植株Fe含量表現(xiàn)為：根>葉>莖，喬鮮花等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小麥各器官Fe含量也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)：根系>葉片>穗軸、穎殼>莖>子粒。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿根中Fe含量的影響與固氮酶活性變化趨勢(shì)相一致，苗期、盛花期、結(jié)莢期和成熟期的最大值均出現(xiàn)在同一NO3--N/NH4+-N配比處理下，表明Fe可影響固氮酶活性大小，Dakora等[29]關(guān)于豇豆和大豆的研究也證實(shí)，固氮酶活性不僅受外源氮素的影響，而且也受金屬元素Mo、Fe的制約。而苗期后根部Fe含量急劇增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葉和莖中的含量，可能是由于隨著生育期的推進(jìn)，根系逐漸衰老，活力下降，氧化能力減弱，使得根系周圍大量的Fe以Fe3+沉積在根系表面而造成的[30]。

由此，從部位來(lái)看，紫花苜蓿NR活性、Mo含量趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)為：葉>根>莖，而Fe含量則表現(xiàn)為根>葉>莖；不同配比下各部位NR活性均表現(xiàn)為配比中NO3--N所占比例大時(shí)，其活性較高，尤其是生長(zhǎng)前期當(dāng)NO3--N/NH4+-N為7/1時(shí)，各部位NR活性均最高；不同配比對(duì)根中Mo含量的影響在苗期與NR趨勢(shì)相近，在NO3--N所占比例大時(shí)達(dá)最高?，F(xiàn)蕾期與固氮酶活性相同，1/7時(shí)最高。成熟期同固氮酶與NR活性，均在5/3時(shí)最高；不同配比對(duì)根中Fe含量的影響與固氮酶活性變化趨勢(shì)相一致，苗期均在1/7處理最高，盛花期至成熟期均在5/3處理最高。

3.2 NO3--N/NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿各生育期氮代謝的影響

本研究中，紫花苜蓿全生育期各配比下NR活性變化趨勢(shì)均呈單峰曲線，盛花期活性最高，成熟期最低，且各部位具有一致的變化趨勢(shì)，說(shuō)明在紫花苜蓿的5個(gè)生育期中，盛花期氮代謝能力最強(qiáng)。劉鵬等[31]研究也發(fā)現(xiàn)大豆葉片各生育期NO3--N與NR活性的動(dòng)態(tài)變化相似，以開花期最高、成熟期最低。不同NO3--N/NH4+-N配比處理下，紫花苜蓿NR活性在整個(gè)生育期均表現(xiàn)為NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比例高時(shí)NR活性較高，這是由于NR作為一種誘導(dǎo)酶，其活性大小與底物(NO3-)的濃度呈正相關(guān)，而氮代謝過(guò)程中同化的產(chǎn)物NH4+、谷氨酸、谷氨酰胺等則抑制其活性[32]。所以，配比中NO3--N比例大時(shí)，促進(jìn)其NR活性增加，反之，當(dāng)NH4+-N比例大時(shí)，因NH4+也是NO3-還原反應(yīng)的產(chǎn)物，即氮代謝的同化產(chǎn)物，其反饋抑制作用致使NR活性降低。

本研究中，紫花苜蓿全生育期各配比下固氮酶活性變化趨勢(shì)均呈單峰曲線，結(jié)莢期達(dá)最大值，說(shuō)明在紫花苜蓿的5個(gè)生育期中，結(jié)莢期根瘤固氮能力最強(qiáng)。且不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿的固氮酶活性在苗期和現(xiàn)蕾期均表現(xiàn)為1/7處理最好，說(shuō)明NH4+-N更有利于根瘤的生長(zhǎng)，分析原因是供給NO3--N時(shí)主要影響根瘤呼吸速率使根瘤皮層內(nèi)O2擴(kuò)散阻抗力增大，根瘤侵染區(qū)細(xì)胞O2濃度降低，類菌體呼吸和固氮所需氧供應(yīng)不足，因而導(dǎo)致根瘤活性受到抑制[33]。紫花苜蓿生長(zhǎng)至中、后期(盛花期至成熟期)，NH4+-N比例較大的處理紫花苜蓿固氮酶活性下降，而5/3處理下表現(xiàn)最好，分析原因可能是大量的NH4+-N來(lái)不及利用和轉(zhuǎn)移，NH4+濃度過(guò)高導(dǎo)致NH4+鹽毒害，不能形成根瘤進(jìn)而限制固氮酶的合成。本研究采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，可提供充足的Mo供紫花苜蓿生長(zhǎng)，而Mo可促進(jìn)植物對(duì)NO3--N的吸收與同化，因此，Mo的存在能緩解NO3--N對(duì)固氮酶的抑制作用，提高根瘤固氮能力[34]。

在本研究中整個(gè)生育期不同配比對(duì)莖和葉中Mo、Fe含量的影響基本相同，現(xiàn)蕾期至盛花期表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比中NH4+-N比例大時(shí)，Mo和Fe含量達(dá)最高；而結(jié)莢期至成熟期則表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比例大時(shí)，Mo和Fe含量達(dá)最高。分析原因是氮素形態(tài)對(duì)它們根際pH的影響不同造成的[35]，前中期NH4+-N能較快地釋放出H+，陰陽(yáng)離子結(jié)合使得Mo和Fe吸收較快，積累量多。結(jié)莢期后，大量NO3--N經(jīng)NR還原成NH4+-N，使得植株中NH4+-N大量積累，故結(jié)莢期后表現(xiàn)為NO3--N含量高時(shí)Mo和Fe含量反而高。

由此，從生育期來(lái)看，紫花苜蓿全生育期NR活性和固氮酶活性變化趨勢(shì)均呈單峰曲線；NR活性在盛花期最高，即盛花期氮代謝能力最強(qiáng)，且各生育期均為NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比例大時(shí)NR活性高，氮代謝能力較強(qiáng)；固氮酶活性在結(jié)莢期達(dá)最大值，即結(jié)莢期根瘤固氮能力最強(qiáng)，且苗期和現(xiàn)蕾期均表現(xiàn)為1/7處理其活性最高，盛花期至成熟期則在5/3處理下活性最高；不同配比對(duì)莖和葉中Mo、Fe含量的影響基本相同，現(xiàn)蕾期至盛花期在配比中NH4+-N所占比例大時(shí)含量達(dá)最高，結(jié)莢期至成熟期在配比中NO3--N所占比例大時(shí)含量達(dá)最高。

3.3 NO3--N/NH4+-N配比下紫花苜蓿NR活性與固氮酶活性的關(guān)系

有觀點(diǎn)認(rèn)為NR和固氮酶是一對(duì)拮抗酶，它們不僅含有共同的鉬輔因子，產(chǎn)生對(duì)這種共同因子的競(jìng)爭(zhēng)，而且對(duì)氮素形態(tài)的響應(yīng)不同，前者受NO3--N的誘導(dǎo)和促進(jìn)，后者受NO3--N的鈍化和抑制[36]。但在本研究中，在紫花苜蓿生長(zhǎng)前期(苗期至現(xiàn)蕾期)，NO3--N/NH4+-N=7/1處理NR活性最大，1/7處理NR活性最小，而固氮酶活性則相反，二者表現(xiàn)出拮抗關(guān)系；在紫花苜蓿生長(zhǎng)中、后期(盛花期至成熟期)NR活性與固氮酶活性均在NO3--N/NH4+-N=5/3處理達(dá)最大值，二者又相互促進(jìn)。所以，固氮酶與NR之間不都是拮抗關(guān)系，在固氮酶活性被外源氮抑制時(shí)，與NR之間存在拮抗關(guān)系，而固氮酶未受抑制或抑制較輕時(shí)，固氮酶與NR之間又可以相互促進(jìn)、協(xié)調(diào)氮素營(yíng)養(yǎng)。

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StudyonkeyenzymeactivityinnitrogenmetabolismandthecontentofmolybdenumandironinalfalfaunderdifferentNO3--N/NH4+-Nratio

HAO Feng, LIU Xiao-jing, FAN Jun-jun

(CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofPrataculturalEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-USCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou，Gansu730070,China)

By solution culture method, ‘Gannong No.3’ alfalfa was chosen as the experimental material to explore the effects of NO3--N/NH4+-N ratios(1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1) based on nitrogen supply of 210 mg·L-1on the activity of nitrate reductase(NR) and nitrogenase, and the content of molybdenum(Mo) and iron(Fe) in organs of alfafa during the whole growth period. The results showed that: (1) NR activity and Mo content was consistent:leaf>root>stem, while Fe content was root>leaf>stem. With the proportion of NO3--N increasing, NR activity in each organ became higher. In the early stage, when NO3--N/NH4+-N equaled to 7/1, NR activity was the highest. The influence of different ratio on Mo content in root during seedling stage was similar to NR activity, that is to say, in large proportion of NO3--N it was the highest. During budding stage, the same as nitrogenase activity, in 1/7 it was highest. During mature stage, same as nitrogenase and NR activity, in 5/3 it was highest. The influence of different ratio on Fe content in root was similar to nitrogenase activity, that is to say, it was highest at 1/7 in seedling and 5/3 from full-bloom to mature. (2) NR and nitrogenase activity showed a single-peak curve during the whole growth period, that is to say, NR activity was the highest during full-bloom stage and nitrogenase activity was the highest during podding stage. NR activity was higher under larger proportion of NO3--N in different ratios during the whole growth period. Nitrogenase activity was the highest in 1/7 at seedling and budding, and from full-bloom to mature it was the highest in 5/3. Mo and Fe content in the stem and leaf was consistent, they were the highest for larger proportion of NH4+-N from budding to full-bloom and highest for larger proportion of NO3--N from podding to maturity. (3) Relationship between NR and nitrogenase activity differed in the whole growth period. At the early growth stage (from seeding to budding), NR activity was highest in 7/1 and lowest in 1/7. Nitrogenase activity was in the opposite situation, suggesting that there was an antagonistical relationship between NR and nitrogenase activity. From full-bloom to mature, both NR and nitrogenase activity was highest in 5/3, they accelerated each other.

NO3--N/NH4+-N ratio; alfalfa; nitrogen metabolism; enzyme; molybdenum; iron

1000-7601(2017)03-0190-08doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2017.03.30

2016-04-29

：2017-03-15

：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460622)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201403048-8)；甘肅省科技支撐項(xiàng)目(1504NKCA003)

郝 鳳(1985—)，女，黑龍江鶴崗人，博士研究生，研究方向?yàn)槟敛菁安萜翰轄I(yíng)養(yǎng)生理。 E-mail：haofeng1026@163.com。

劉曉靜，E-mail：liuxj@gsau.edu.cn。

N143.1

： A