瞿印權(quán) 徐雯 沈露 何天友++魏建文 榮俊冬 鄭郁善

摘要：以大頭典竹葉片為材料，采用單因素分析法和正交設(shè)計(jì)直觀分析法，對影響PCR擴(kuò)增效果的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA含量這5個(gè)PCR反應(yīng)體系主要成分以及退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選。通過研究建立了適合大頭典竹的ISSR-PCR反應(yīng)體系：20 μL反應(yīng)液中含2.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，10 ng模板DNA，2 μL 10×Buffer，10.55 μL ddH2O。相應(yīng)反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性45 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。應(yīng)用建立的優(yōu)化反應(yīng)體系成功地篩選出16條多態(tài)性較高的引物，表明該體系具有較高穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、適用性，可較好地應(yīng)用于大頭典竹不同地理種源間的遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞：大頭典竹；ISSR；反應(yīng)體系；優(yōu)化

中圖分類號： S795.901文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0034-06

地球上的竹類植物共有88屬1 400多種，主要分布在亞太區(qū)、美洲區(qū)、非洲區(qū)[1]。中國竹類主要分布于長江中下游，其中以福建、浙江、江西、湖南4省最多，占全國竹林面積的60.7%[2]。大頭典竹[Dendrocalamopsis beecheyana var. pubescens （P. F. Li） Keng f.]屬于竹亞科（Bambusoideae）綠竹屬[Dendrocalamopsis （Chia et H. L. Fung） Keng f.]的叢生竹，別稱新竹、榮竹，具有繁殖生長快、根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。目前，在我國關(guān)于大頭典竹在分子生物方面的研究較少。[JP]

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性以及指紋圖譜構(gòu)建的研究[3-5]。目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等[6]。其中SSR序列廣泛分布在高等生物的染色體上，因此利用該簡單重復(fù)序列標(biāo)記（inter simple sequence repeat，ISSR）技術(shù)可以獲得較多的分子標(biāo)記。ISSR的引物長度較RAPD引物長，因此ISSR具有重現(xiàn)性的特點(diǎn)，可以獲得較可靠的遺傳多樣性信息，有利于植物種間及種內(nèi)的鑒別[7]。已有研究表明，竹亞科植物不同地理種源間的遺傳變異較豐富[8]，為了進(jìn)一步證實(shí)上述觀點(diǎn)，本試驗(yàn)采用ISSR方法對大頭典竹的群居差異進(jìn)行研究，旨在建立 ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，為其地理種源的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系的鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試的材料來源于福建省東山國有赤山林場的大頭典竹地理種源試驗(yàn)樣地。采摘洗凈的竹葉3～5張，放入自封袋并冰袋保存，盡快轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，以備DNA的提取。

[BT2+*5]1.2試劑與儀器

主要試劑：ISSR引物都參考哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10×PCR Buffer、6×loading Buffer均購上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂糖、核酸染料均購自北京賽西盛公司。

主要儀器：JS-680全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀、T6新世界紫外分光光度計(jì)、Lab Cycler PCR儀、DYY-8C電泳儀、TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)等。

1.3DNA的提取與檢測

大頭典竹DNA的提取采用博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取的方法。將提取出的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度、純度，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性及是否有降解現(xiàn)象。

[BT2+*5]1.4ISSR原初擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系

原初設(shè)定的擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。原初擴(kuò)增反應(yīng)體系為2.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，50 ng 模板DNA，2 μL 10×Buffer，9.8 μL ddH2O。原初擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系均參考李炎梅的方法[9]。

1.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)

[JP+1]經(jīng)過初步的引物篩選，引物UBC810能產(chǎn)生清晰度高、多態(tài)性好的條帶，因此可以用于ISSR-PCR體系的篩選（圖1）。分別采用單因素多水平梯度試驗(yàn)法和正交設(shè)計(jì)分析法（表1、

1.6擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

取9 μL的PCR產(chǎn)物，加入1.5 μL 6×loading Buffer并混勻，上樣到加有核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠上，電泳1 h，電壓設(shè)為5 V/cm。待電泳時(shí)間結(jié)束到紫外凝膠成像分析儀觀察和拍照。

2結(jié)果與分析

2.1單因素多水平梯度試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1Mg2+濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

Mg2+濃度變化直接影響反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶的活性，也間接影響引物與模板DNA的雙聯(lián)雜交體的解鏈和退火溫度以及擴(kuò)增產(chǎn)物[CM（25]的特異性[10]，因此選擇合適的Mg2+濃度對ISSR-PCR反[CM）]

應(yīng)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)，無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；在Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶極少且模糊；Mg2+濃度為2.0～4.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)一致，但Mg2+濃度在2.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較多清晰（圖2）。因

2.1.2dNTPs濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

dNTP是 ISSR-PCR反應(yīng)的原料，其濃度的高低直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性[11]。研究發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度為0.25 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶較為清晰明亮；當(dāng)dNTPs濃度低于0.25 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶模糊；dNTPs濃度過低會(huì)影響底物與引物的酶促反應(yīng)速度的下降，導(dǎo)致擴(kuò)增條帶產(chǎn)率低、效果差；當(dāng)dNTPs濃度大于0.25 mmol/L時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶較一致（圖3）。因此，從降低成本考慮，dNTPs濃度選用0.25 mmol/L。[FL）]

在 ISSR-PCR反應(yīng)中，TaqDNA聚合酶是影響擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素之一。TaqDNA聚合酶用量過多會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，過低則會(huì)使得擴(kuò)增產(chǎn)物減少[12]。另外TaqDNA聚合酶的活性還受Mg2+、dNTPs濃度的影響[13]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TaqDNA聚合酶含量為0.5～1.0 U時(shí)，擴(kuò)增的條帶較少，總體條帶數(shù)較為模糊，但擴(kuò)增條帶隨著TaqDNA聚合酶含量的增加依次增加；當(dāng)TaqDNA聚合酶含量為1.25～2.00 U時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)增加，條帶清晰（圖4）。因此，TaqDNA聚合酶含量選用 1.25 U。[FL）]

引物的濃度過高時(shí)容易引起引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致擴(kuò)增條帶模糊或減少，還會(huì)產(chǎn)生新的非特異性位點(diǎn)；過低則會(huì)使PCR反應(yīng)提前結(jié)束，使擴(kuò)增條帶減少甚至沒有條帶出現(xiàn)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引物濃度為0.3、0.4 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶數(shù)目減少且模糊；當(dāng)引物濃度為0.5、0.6 μmol/L時(shí)，條帶清晰，擴(kuò)增條數(shù)比0.3、0.4 μmol/L時(shí)的條帶數(shù)增多；當(dāng)引物濃度大于 0.6 μmol/L 時(shí)，條帶清晰度明顯減弱（圖5）。因此，本試驗(yàn)選用 0.6 μmol/L 引物濃度為ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。[FL）]

[FL（2K2]2.1.5模板DNA用量對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

一般情況下，模板DNA含量過低，會(huì)導(dǎo)致無擴(kuò)增產(chǎn)物，過高則會(huì)引起非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)或擴(kuò)增條帶的模糊[15]。少數(shù)情況下，模板DNA含量對ISSR-PCR擴(kuò)增影響不大[16]。研究發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的7個(gè)梯度水平的DNA含量均能擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶且無明顯差異（圖6）?？紤]到DNA用量越少越好，因此本試驗(yàn)選擇10 ng模板DNA為ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳用量。[FL）]

本試驗(yàn)的主要影響因素濃度，以單因素多水平梯度試驗(yàn)的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)成5個(gè)影響因素、4個(gè)水平、16個(gè)試驗(yàn)處理的正交設(shè)計(jì)，并建成關(guān)于大頭典竹的ISSR-PCR標(biāo)記的反應(yīng)體系表。研究發(fā)現(xiàn)，處理4、處理7、處理8擴(kuò)增條帶最為清晰，條帶數(shù)比較多，而處理3、處理11、處理16沒有擴(kuò)增條帶。參照何正文等的方法[17]，根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的多少、條帶的亮暗程度和清晰度進(jìn)行評分。最好的評16分，最差的評1分，依次對16條擴(kuò)增條帶進(jìn)行評分。16個(gè)處理的分?jǐn)?shù)依次為6、11、1、16、13、7、14、15、12、8、1、12、5、10、

[FL（2K2]根據(jù)評分結(jié)果求出每個(gè)因素同一水平下的試驗(yàn)值之和Ki以及每一因素同水平下的數(shù)據(jù)平均值ki并求出同一因素不同水平間平均值的極差R。極差R反應(yīng)各影響因素對反應(yīng)體系的影響，R越大則影響越顯著[12]。各因素水平變化對ISSR-PCR反應(yīng)體系影響從大到小排序?yàn)門aq酶含量>Mg2+濃度>引物濃度>dNTPs濃度>模板DNA含量（表3）。每一因素同水平下的數(shù)據(jù)平均值ki反應(yīng)影響因素各水平對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響情況，ki越大，水平對反應(yīng)體系越有利[12]。因此，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)下，大頭典竹的ISSR-PCR反[CM（25]應(yīng)體系的最佳濃度為 2.0 mmol/L[KG*3]Mg2+，0.35[KG*3]mmol/L

2.3擴(kuò)增程序參數(shù)的調(diào)整

2.3.1退火溫度的篩選

退火溫度是影響PCR特異性反應(yīng)的重要因素，退火溫度不同，產(chǎn)生引物和模板DNA間的錯(cuò)配[18]。一般來說，每一個(gè)引物都有各自的理論退火溫度。合理的退火溫度一般55～70 ℃，退火溫度一般在設(shè)定引物的理論退火溫度±5 ℃范圍內(nèi)。在一定的溫度范圍內(nèi)，退火溫度越高，擴(kuò)增的特異性也越高，退火溫度越低，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性也降低。如果退火溫度過高，則引物與模板結(jié)合差，電泳條帶差，甚至沒有擴(kuò)增。如果溫度過低，則擴(kuò)增特異性差，雜帶較多，背景深[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退火溫度為50～54.5 ℃時(shí)，擴(kuò)增的條帶逐漸增多，條帶逐漸清晰，當(dāng)退火溫度大于54.5 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰度逐漸降低，條帶數(shù)逐漸減少（圖8）。因此選擇最佳退火溫度為第6泳道的54.5 ℃，與UBC810引物的理論退火溫度52.2 ℃相差不超過5 ℃，符合文獻(xiàn)報(bào)道[20]。

2.3.2循環(huán)次數(shù)的篩選

PCR的循環(huán)次數(shù)對PCR反應(yīng)有重要的影響，循環(huán)次數(shù)太低，會(huì)引起擴(kuò)增產(chǎn)物的減少。循環(huán)次數(shù)太高，又會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物[21]。本試驗(yàn)對循環(huán)次數(shù)設(shè)了3個(gè)梯度，分別為30、35、40次。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為40次時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰（圖9），因此40次循環(huán)作為大頭典竹ISSR-PCR反應(yīng)最佳反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。[FL）]

利用建立好的大頭典竹的最佳反應(yīng)體系，對100條引物進(jìn)行擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)在選用不同的引物時(shí)，絕大部分都能擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶，只有少部分引物不能擴(kuò)增出條帶（圖10）。研究結(jié)果說明，該反應(yīng)體系穩(wěn)定，并具有重復(fù)性。

3結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、DNA用量少等其他分子標(biāo)記技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢[9]，同時(shí)，也受到 ISSR-PCR 反應(yīng)體系中Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA等因素的影響[17]。有關(guān)巨竹屬植物的ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化的研究表明，模板DNA含量對ISSR-PCR擴(kuò)增有較大的影響[18]。而在本試驗(yàn)中，模板DNA含量對大頭典竹 ISSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)沒有太大影響，可能是因?yàn)椴煌駚喛浦参镩g的DNA含量對擴(kuò)增反應(yīng)的影響也是有差別的。

在ISSR-PCR反應(yīng)的建立和優(yōu)化中，通常采用單因素試驗(yàn)方法和正交試驗(yàn)方法[19-25]。本試驗(yàn)分別采用2種方法，對反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行和優(yōu)化，確定各影響因素濃度和循環(huán)次數(shù)，并在建立好的體系上對有效引物進(jìn)行篩選。通過對2種試驗(yàn)方法的比較證實(shí)了單因素試驗(yàn)可以直接地反應(yīng)出各[FL）]

[FL（2K2]影響因素的濃度或含量大小對反應(yīng)體系的影響，試驗(yàn)操作要求比較簡單。正交試驗(yàn)可以考慮到各因素的交互作用，確定各因素的主次關(guān)系，但操作比較復(fù)雜，試驗(yàn)時(shí)間過長，影響酶等主要成分的活性[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)試驗(yàn)方法所得到結(jié)果差異比較明顯，且正交試驗(yàn)方法，有部分產(chǎn)物未能擴(kuò)增出來。因此選擇較為常用的單因素試驗(yàn)方法來進(jìn)行ISSR-PCR體系建立與優(yōu)化。

綜上，本試驗(yàn)建立了大頭典竹最佳優(yōu)化體系：20 μL的反應(yīng)液中含2.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，10 ng模板DNA，2 μL 10×Buffer，10.55 μL ddH2O，該體系將為大頭典竹不同地理種源的遺傳多樣性研究和親緣關(guān)系評價(jià)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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