李全生，張正杰，楊世海

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

不同產(chǎn)地防己藥材HPLC指紋圖譜的研究

李全生，張正杰，楊世海

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

建立防己藥材的高效液相色譜指紋圖譜，為評(píng)價(jià)及有效控制其質(zhì)量提供參考。利用HPLC方法，測(cè)定了14個(gè)不同產(chǎn)地防己藥材樣品，選用Ultimmate XB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）- 0.1%甲酸（B），設(shè)定流速0.8 mL/min、柱溫30℃、檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm。采用國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)各產(chǎn)地防己藥材進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，14個(gè)產(chǎn)地防己藥材的HPLC指紋圖譜有9個(gè)共有峰，所有產(chǎn)地指紋圖譜相似度均在0.9以上，不同產(chǎn)地防己質(zhì)量相似性較好。

防己；產(chǎn)地；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析

防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandraS.Moore的干燥根，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，分屬于中品，名曰“解離”，具有利水消腫、祛風(fēng)止痛的作用。目前，粉防己為常用的重要中藥，具有解熱鎮(zhèn)痛、風(fēng)濕止痛、利尿消腫之功效，主要用于治療水腫鼓脹、濕熱腳氣、手足攣痛、癬疥瘡腫、高血壓等癥［1-2］。野生防己生于山野丘陵地、草叢或矮林邊緣下，一般生長(zhǎng)5～10年能起挖，采挖后自我恢復(fù)能力弱。防己完全依靠野生資源供應(yīng)市場(chǎng)，近幾年由于防己持續(xù)高價(jià)，大量的粉防己被無(wú)序地狂采亂挖，造成防己藥材質(zhì)量出現(xiàn)變化。因此對(duì)不同產(chǎn)地防己藥材的質(zhì)量進(jìn)行分析，明確產(chǎn)地間藥材的差異，為防己藥材人工種植提供優(yōu)選種質(zhì)資源十分必要。在質(zhì)量控制上，常以組織學(xué)和薄層色譜法為手段，通過(guò)描述顯微特征以及檢測(cè)粉防己堿和防己諾林堿的TLC斑點(diǎn)達(dá)到鑒別粉防己藥材基源的目的，再用HPLC方法測(cè)定粉防己藥材中粉防己堿的含量來(lái)控制粉防己藥材的質(zhì)量，限定其含量不得低于1.6%［3］。中藥指紋圖譜建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，是一種可量化的綜合鑒定手段，目前廣泛用于中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的控制與評(píng)價(jià)上［4-8］。

本試驗(yàn)采用HPLC法，研究并建立防己藥材的指紋圖譜，并對(duì)不同產(chǎn)地的防己藥材進(jìn)行比較研究，以期明確各產(chǎn)地防己藥材的質(zhì)量，為防己藥材的鑒別和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的防己藥材樣品由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)楊世海教授鑒定為防己藥材正品。樣品編號(hào)為S1～S14，產(chǎn)地分別為浙江常山、蘭溪、余潛、金華，湖北陽(yáng)新、黃石，安徽黃山、安慶、徽州、寧國(guó)，江西永豐、上饒、信豐、宜春。

粉防己堿對(duì)照品（純度9 8%，批號(hào)111637-201308）、防己諾林堿對(duì)照品（純度98%，批號(hào)100416-201506）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸、鹽酸均為分析純，購(gòu)自北京化工廠；色譜甲醇和乙腈均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，試驗(yàn)用水為超純水。

試驗(yàn)主要儀器包括Dionex Uitimate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司）、AB265-S型雙量程電子天平（瑞士Mettler公司）、Milli-Q純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）、SB25-12DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取粉防己堿對(duì)照品、防己諾林堿對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，各量取1 mL置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成各含100 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取過(guò)3號(hào)篩的防己粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入2 mL濃氨水潤(rùn)濕，再加入甲醇25 mL，水浴回流提取60 min，放冷，過(guò)濾，蒸干濾液，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

1.2.3 測(cè)定方法 分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄 60 min的色譜圖。色譜條件：Ultimmate XB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇（A）- 0.1%甲酸（B）梯度洗脫（0～10 min，5%～15% A；10～25 min，15%～30% A；25～45 min，30%～53% A；45～60 min，53%～20% A），流速0.8 mL/min，柱溫 30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，進(jìn)樣量10 μL，所有組分均在60 min內(nèi)被洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.1.1 精密度 取同一批樣品（樣品S1），按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜1%，相對(duì)峰面積RSD均＜5%。符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性 取同一樣品（樣品S1），平行制備6份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.5%，相對(duì)峰面積RSD均＜3.2 %，有較高的相似度，重現(xiàn)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性 取同一樣品（樣品S1），制備的供試品溶液分別在0、2、4、12、18、24 h進(jìn)樣，測(cè)定并記錄指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.3%，相對(duì)峰面積RSD均＜2.0%，說(shuō)明供試品溶液中成分在24 h以內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 防己藥材指紋圖譜共有模式的建立及部分共有峰的標(biāo)定

將14個(gè)樣品的指紋圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版）”，生成指紋圖譜共有模式，其中共有峰9個(gè)，且共有峰的峰面積占總峰面積的90%以上，符合指紋圖譜技術(shù)要求。通過(guò)與混合對(duì)照品對(duì)比分析，確定6號(hào)峰為防己諾林堿，7號(hào)峰為粉防己堿（圖1）。

2.3 不同產(chǎn)地防己藥材指紋圖譜相似度比較

采用平均矢量法對(duì)14個(gè)不同產(chǎn)地防己藥材指紋圖建立共有模式，作為對(duì)照指紋圖譜，將每張指紋圖譜與其進(jìn)行比較，并計(jì)算各個(gè)樣本與基準(zhǔn)樣本的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)，得到各圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，分析結(jié)果見(jiàn)表1～表3。14個(gè)產(chǎn)地防己藥材指紋圖譜的相似度良好，均在0.90以上（表3），說(shuō)明大多數(shù)產(chǎn)地的防己藥材質(zhì)量具有很高的一致性。

圖1 14個(gè)不同產(chǎn)地防己藥材及對(duì)照的高效液相指紋色譜圖

2.4 各產(chǎn)地防己藥材的指紋圖譜聚類分析

應(yīng)用Spass 19.0分析軟件，以14批防己藥材的9個(gè)共有峰的峰面積為指標(biāo)，構(gòu)造14×9的原始數(shù)據(jù)矩陣，采用離差平方和法，利用歐氏距離作為樣品的測(cè)度對(duì)其進(jìn)行聚類分析［9-10］，結(jié)果（圖2）表明，通過(guò)9個(gè)指標(biāo)性成分可將14個(gè)產(chǎn)地的防己藥材分為4大類：第一類包括浙江金華、江西宜春，第二類包括浙江余潛、江西信豐、浙江常山、江西永豐、安徽徽州、安徽寧國(guó)，第三類包括浙江蘭溪、江西上饒、安徽安慶、湖北黃石，第四類包括湖北陽(yáng)新及安徽黃山。聚類分析結(jié)果和指紋圖譜相似度結(jié)果相似。

表1 不同產(chǎn)地防己藥材共有峰相對(duì)保留時(shí)間（s）

表2 不同產(chǎn)地防己藥材共有峰相對(duì)峰面積

表3 不同產(chǎn)地防己藥材指紋圖譜相似度

圖2 不同產(chǎn)地防己藥材的指紋圖譜聚類結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在防己藥材的指紋圖譜分析中比較了Ultimmate XB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），結(jié)果表明，前者的分離度較好，譜峰信息豐富，保留時(shí)間適中，因此選Ultimmate XB C18色譜柱作為防己藥材的HPLC指紋圖譜檢測(cè)色譜柱。在波長(zhǎng)選擇上，應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)200～400 nm的波段進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組分在檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm處有最大吸收，色譜信息豐富，基線基本平穩(wěn)，故波長(zhǎng)選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)，比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，最終確定甲醇（A）- 0.1%甲酸（B）流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫分離度好，峰型對(duì)稱，穩(wěn)定性好。在柱溫的選擇上，選擇了30、35、40℃ 3種柱溫進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，色譜峰的保留時(shí)間略微提前，總體上觀察，兼顧所有色譜峰的分離情況，最終選擇柱溫為30℃。在流速的選擇上，分別比較了0.8、1.0、1.2 mL/min 3種流速，按照乙腈-水的色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。結(jié)果表明，流速為0.8 mL/min時(shí)，各色譜峰分離度較好，故選用0.8 mL/min的流速。

防己藥材為我國(guó)大宗型常用藥材，在2015版中國(guó)藥典一部中有11個(gè)制劑含有防己藥材，其功效作用涉及較廣［1］。研究表明，粉防己含有豐富的雙芐基異喹啉類生物堿，是粉防己的主要活性成分。該類成分具有顯著的藥用價(jià)值，能夠祛風(fēng)止痛，清熱解毒。粉防己的干燥根中含有1.2%生物堿，李行諾等［11］分離鑒定出粉防己堿（Tetrandrine，漢防己甲素）、防己諾林堿（Fangchinoline，漢防己乙素）、氧化防己堿（oxofangchirine）、粉防己堿D鹽酸鹽（fenfangjine Dhydrochioride）、荷苞牡丹堿〔（+）-dicenrine）〕等。Si等［12］首次從粉防己中分離得到黃酮類化合物。同時(shí)，在粉防己植物的根中分離得到黃酮苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油、酚類及糖類等物質(zhì)。研究表明，防己諾林堿及防己堿為主要有效成分［13-14］，2015版藥典也以這兩種成分為含量測(cè)定指標(biāo)。鞏江等［15］采用GCMS技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)漢防己揮發(fā)油的主要成分是2-甲氧基-4-乙基-苯酚（19.58%）、環(huán)己酮（13.07%）、3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3-醇（10.01%）、2，2-二羥基-苯并咲喃（3.96%）。吳慧勤等［16］在廣防己中研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)流感病毒有明顯抑制作用的β-古蕓稀。

本研究首次對(duì)防己藥材 HPLC指紋圖譜進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)和主成分聚類分析，通過(guò)對(duì)比不同產(chǎn)地防己指紋圖譜的相似度發(fā)現(xiàn)，14個(gè)產(chǎn)地防己藥材的HPLC指紋圖譜相似度均在0.9以上，其化學(xué)成分相同，說(shuō)明其種質(zhì)穩(wěn)定，未受到種植環(huán)境的影響，但共有峰的相對(duì)峰面積有所差異，說(shuō)明有效成分含量受地域影響，產(chǎn)生差異。采用9個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果未將相同產(chǎn)地的藥材聚為一類，說(shuō)明不同產(chǎn)地化學(xué)成分雖有差異，但這種差異還不能將該產(chǎn)地藥材完全獨(dú)立出來(lái)，且可更明顯地看出防己藥材的化學(xué)成分受到環(huán)境的影響較小。通過(guò)指紋圖譜結(jié)合聚類分析可較好地對(duì)各產(chǎn)地防己藥材的質(zhì)量進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，對(duì)防己藥材的合理栽培和產(chǎn)地的科學(xué)規(guī)劃提供參考。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典（一部）［S］. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：149.

［2］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志. 第 30卷. 第1分冊(cè)［M］. 北京：科學(xué)出版社，1996.

［3］ 劉瑩，鄧安珺，李喜鳳，等. 粉防己專屬性對(duì)照物質(zhì)的研究［J］. 中國(guó)中藥雜志，2009，34（15）：1943-1949.

［4］ 肖小河，金城，鄢丹，等. 中藥大質(zhì)量觀及實(shí)踐［J］. 中草藥，2010，41（4）：505-511.

［5］ 房德敏. 中藥指紋圖譜技術(shù)的研究與應(yīng)用［J］.中草藥，2005，36（4）：236-243.

［6］ 袁亞洲. 紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)在中藥質(zhì)量控制中的研究［D］. 南昌：南昌大學(xué)，2008.

［7］ Cui J X，Hong W X，Zhou R J，et al. Feature extraction of Chinese materia medica fingerprint based on star plot representation of multivariate data［J］. Chin Herb Med，2011，3（2）：140-143.

［8］ Yu F，Kong L，Zou H，et al. Progress on the screening and analysis of bioactive compounds in traditional Chinese medicines by biological fingerprinting analysis［J］. Comb Chem High Throughput Screen，2010，13（10）：855-858.

［9］ 李亞偉，陳守煜，聶相田. 基于PCA和聚類分析的相似流域選擇方法［J］. 東北水利水電，2004，22（7）：1-6.

［10］ 陳軍輝，謝明勇，王鳳美，等. 聚類分析法用于西洋參樣品分類研究［J］. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006，25 （2）：20-25.

［11］ 李行諾，閆海霞，沙娜，等. 粉防己生物誠(chéng)化學(xué)成分的分離與鑒定［J］. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（6）：430-433.

［12］ Si D Y，Zhong D F. Biflavonoids from the aerial of Stephania teteandra［J］. Phytochemistry，2001，58：563-566.

［13］ 劉孝昌，肖培根. 雙節(jié)基異喹琳類生物堿的生物活性及其國(guó)內(nèi)資源［J］. 藥學(xué)通報(bào)，1983，18（5）：287.

［14］ 高光躍，肖培根. 雙節(jié)基異喹琳類生物堿在植物界的分布及生理活性研究概況［J］. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1999，11（3）：96.

［15］ 鞏江，愧士峰，路蓉芳，等. 漢防己葉揮發(fā)油成分GC-MS分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（12）：7076-7077.

［16］ 吳惠勤，林曉珊，黃曉蘭，等. 廣防己揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜研究［J］. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2004，23（1）：95-97.

（責(zé)任編輯 崔建勛）

HPLC fingerprint analysis of Fangji from different habitats

LI Quan-sheng，ZHANG Zheng-jie，YANG Shi-hai
（College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

To estimate HPLC fingerprint of Fangji for evaluating the differences of chemical composition from different habitats，and provide a reference for evaluating the quality of Fangji，the fingerprints of 14 batches of Fangji from different places were determined by HPLC method. The Ultimmate XB C18column （250 mm × 4.6 mm，5 μm）with methanol （A） - 0.1% formic acid-water （B） as mobile phase was used，the flow-rate was set at 0.8 mL/min，the column temperature was set at 30℃ and the detecting wavelength was set at 282 nm. The fingerprints were compared for similarity by using “Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System”（2004A） issued by Chinese Pharmacopoeia commission and cluster analysis. The result showed that 9 common fingerprint peaks were identified from 14 habitats of Fangji，and the similarity of all fingerprints was above 0.9，which showed the quality of Fangji from different habitats was good in similarity.

Fangji；habitat；HPLC；fingerprint；cluster analysis

R282.5

A

1004-874X（2017）04-0125-06

李全生，張正杰，楊世海. 不同產(chǎn)地防己藥材HPLC指紋圖譜的研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（4）：125-130.

2017-02-23

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重大項(xiàng)目（20126046）

李全生（1990-），男，在讀碩士生，E-mail：liquanshengmail@163.com

楊世海（1962-），男，博士，教授，E-mail：jlyangs@163.com