張會(huì)+鄭玲+萬書波+李新國+郭峰+單雷+高文偉+彭振英

摘要：二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是三酰基甘油（TAG）生物合成過程的限速酶。在本研究中，通過染色體步移法從栽培花生品種魯花14基因組中克隆了AhDGAT1的啟動(dòng)子（pAhDGAT1）序列，并通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有多個(gè) TATA-box、CAAT-box、光調(diào)控元件、脅迫防御相關(guān)元件和激素響應(yīng)元件。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pAhDGAT1∶GUS植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片。通過GUS染色發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草營養(yǎng)器官和生殖器官中均檢測(cè)到GUS表達(dá)，在花絲和花柱中表達(dá)較低，而在柱頭、花藥和種子中表達(dá)較高，表明pAhDGAT1表達(dá)沒有組織特異性，具有組成型啟動(dòng)子的特征。

關(guān)鍵詞：花生；AhDGAT1基因；啟動(dòng)子；GUS染色；功能驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：S565.2：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）07-0001-07

Abstract Diacylglycerol acyltransferase （DGAT） is a rate-limiting enzyme in the biosynthesis pathway of triacylglycerol （TAG）. In this study， with peanut cultivar Luhua 14 as material， we cloned the promoter sequence of AhDGAT1 gene （pAhDGAT1） by genome walking method. By bioinformatics analysis， we found that the pAhDGAT1 had many TATA-box， CAAT-box， light regulation， stress and defense response and hormone response elements. The constructed pAhDGAT1∶GUS plant expression vector was transformed into tobacco leaves by Agrobacterium tumefaciens-mediated method. By GUS staining，we found the GUS enzyme activity were detected in all organs of the positive transgenic tobacco lines， while in stigma， anther and young seed， the expression levels were higher than those in filament and style. It indicated that pAhDGAT1 was not tissue-specific promoter and had constitutive promoter feature.

Keywords Peanut； AhDGAT1 gene； Promoter； GUS staining； Function identification

我國花生不僅總產(chǎn)量在世界占據(jù)首位而且有近500萬公頃的種植面積，是主要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。食用油脂主要來源于動(dòng)植物油脂[2]，其中75%的脂類消耗是植物油脂，但其不飽和脂肪酸含量高，不宜長時(shí)間儲(chǔ)存。油料作物中單位脂肪含量最高的是芝麻[3]，花生以50%的脂肪含量排在第二位?；ㄉ秃伙柡椭舅?0%以上，其中油酸含量40%左右，亞油酸含量38%左右（油亞比隨品種不同而變化），能有效降低有害膽固醇，不降低或相對(duì)提高有益膽固醇，阻止動(dòng)脈粥樣硬化[4]。

三酰甘油（triacylgycerol，TAG）主要以3-磷酸甘油和脂酰輔酶A為前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，是動(dòng)植物脂類的主要儲(chǔ)存形式。二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是三酰甘油（TAG）合成途徑的限速酶，它控制TAG的合成速度與量的積累[5]。到目前為止，共有四種類型的DGAT：DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞質(zhì)內(nèi)DGAT，主要是根據(jù)它們的蛋白結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位的不同而劃分的。DGAT1屬于包括?；o酶A、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶ACAT1和ACAT2在內(nèi)的蛋白家族[6]。DGAT2是一種與DGAT1蛋白家族相似性較低的單酰甘油?；D(zhuǎn)移酶家族，普遍存在于動(dòng)物[7]、植物[8]和酵母[9]中。近年，又發(fā)現(xiàn)了WS/DGAT和胞質(zhì)DGAT，但對(duì)它們的研究還比較少。Saha等從花生未成熟種子中克隆獲得一類沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽序列的新型DGAT[10]，即胞質(zhì)DGAT，其氨基酸序列與WS/DGAT具有13%的相似性，與DGAT1和DGAT2基因的核苷酸序列相似性不到10%。DGAT1和DGAT2蛋白大多定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[7，8]，較小部分存在于葉綠體、微粒體中，而胞質(zhì)DGAT定位于細(xì)胞質(zhì)中[10]，含有345個(gè)氨基酸。

油脂合成主要是由DGAT1和DGAT2參與完成的[11，12]，二者在動(dòng)物、植物細(xì)胞中普遍存在。目前DGAT1基因在旱金蓮[13]、煙草[14]、蓖麻[15]、玉米[8]、油菜[16]等植物中被鑒定出，DGAT2基因也在擬南芥[17]、油桐[18]、蓖麻[19]中被克隆出。DGAT1基因在野生型擬南芥中過量表達(dá)可使DGAT1的轉(zhuǎn)錄水平提高10%～70%[20]，其種子含油量也顯著增加。在大豆等轉(zhuǎn)基因油料作物中過量表達(dá)DGAT2基因能使種子含油量得到顯著提高[21，22]。

隨著人們對(duì)DGAT基因越來越多的關(guān)注，近幾年花生DGAT基因的研究也取得一定成效[22-25]，但是對(duì)于其啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)理還不是很清楚。本課題組從花生中克隆了AhDGAT2基因并進(jìn)行了功能驗(yàn)證，結(jié)果表明在大腸桿菌中過量表達(dá)該基因可以提高菌體的脂肪酸含量[24]。隨后又克隆了花生AhDGAT2a的啟動(dòng)子序列，并用GUS染色的方法證明其在各個(gè)組織器官均有表達(dá)[26]。本研究擬克隆花生AhDGAT1基因的啟動(dòng)子序列（pAhDGAT1），構(gòu)建pAhDGAT1∶GUS植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草驗(yàn)證其功能，為研究DGAT基因的表達(dá)調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料：栽培花生品種魯花14、煙草品種SR1。細(xì)菌材料：大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α，購于天根生化科技有限公司；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404、植物表達(dá)載體pCAMBIA2301 均為本實(shí)驗(yàn)室自存。

1.2 花生基因組DNA的提取

以魯花14的幼嫩葉片為材料，采用CTAB法提取葉片基因組DNA[23]。

1.3 AhDGAT1啟動(dòng)子克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的AhDGAT1基因序列（登錄號(hào)：XM_016346854.2）設(shè)計(jì)啟動(dòng)子 genome walking引物D1W1： 5′-TCTGTTTGAAAATGTTGCC-3′，D1W2： 5′-TCCGCCTTCTCCAACGGCGTA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照 genome walking 試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行兩輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系含基因組 DNA 1 μg、2.5 mmol/L dNTPs混合物8 μL、10×LA PCR buffer Ⅱ 5 μL、TaKaRa LA Taq 0.5 μL、100 μmol/L AP1 Primer （5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′）和10 μmol/L D1W1引物各1 μL，ddH2O 33.5 μL。反應(yīng)條件為94℃ 1 min，98℃ 1 min；5個(gè)循環(huán)的94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min；然后94℃ 30 s，25℃ 3 min，72℃ 2 min；15個(gè)循環(huán)的94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min；94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min；94℃ 30 s，44℃ 1 min，72℃ 2 min；最后72℃延伸10 min。取1 μL PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪反應(yīng)的模板，以AP1 Primer 為上游引物，D1W2 為下游引物，其余同第一輪擴(kuò)增體系。反應(yīng)條件為15個(gè)循環(huán)的94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min；94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min；94℃ 30 s，44℃ 1 min，72℃ 2 min；最后72℃延伸10 min。將第二輪得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，回收純化目的條帶，連接到克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)。將有正確條帶的質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 pAhDGAT1∶GUS植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用得到的pAhDGAT1序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（PD1aF：5′-CGCTCTAGACGGTATAAACTTCCAAAGCAT-3′，PD1aR：5′-CCATGGCGAAGAATAAAGAATGAAAAAG-3′），兩端分別引入XbaⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，然后以花生基因組DNA為模板對(duì)pAhDGAT1序列進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的pAhDGAT1序列進(jìn)行雙酶切，并利用T4連接酶連接到同樣經(jīng)XbaⅠ和NcoⅠ雙酶切的pCAMBIA2301載體上，將載體中的CaMV35S 啟動(dòng)子替換掉，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí)pAhDGAT1∶GUS表達(dá)載體構(gòu)建完全正確。

1.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的pAhDGAT1∶GUS載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證并保存陽性菌液。將煙草種子放在75%乙醇中消毒1 min，無菌水沖洗3～5次，再用0.1%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水洗凈后均勻鋪灑于1/2 MS0基本培養(yǎng)基上生長4～5周，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草葉片。將攜帶pAhDGAT1∶GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種于含有50 μg/mL那霉素、50 μg/mL利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。將煙草葉片剪成小塊（0.5 cm × 0.5 cm）置于MS0重懸的菌液中1.5 min，無菌濾紙吸干水分后，在28℃ MS分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)兩天。將葉片松散排列在MS選擇培養(yǎng)基上，待其長出叢生芽時(shí)切下放入伸長培養(yǎng)基。當(dāng)叢生芽長至3～5 cm 時(shí)，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。將生根的幼苗進(jìn)行煉苗然后移栽入花盆，溫室常規(guī)管理。

1.6 陽性植株的分子檢測(cè)和GUS染色

將篩選出的抗性轉(zhuǎn)基因煙草株系提取基因組DNA，用引物 PD1aF/PD1aR 進(jìn)行PCR分子檢測(cè)。將陽性煙草的幼苗和各組織器官浸泡在GUS染色液中，置于37℃恒溫箱中染色16 h，用70%乙醇將材料洗成白色，在體視鏡下拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子克隆與序列分析

運(yùn)用genome walking方法，經(jīng)過兩輪擴(kuò)增得到長度為1 258 bp的pAhDGAT1核苷酸序列片段，通過測(cè)序確定所得片段為AhDGAT1的啟動(dòng)子序列。通過在線分析軟件PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子序列區(qū)域調(diào)控元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域含有許多高等植物重要的順式調(diào)控元件和組織器官表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)?；▓D1）。其中包括64個(gè)TATA-box和19個(gè)CAAT-box元件，表明該啟動(dòng)子具有較高的啟動(dòng)子活性。光是影響植物生長的重要因子，光調(diào)節(jié)基因主要是通過一些光響應(yīng)元件進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，該啟動(dòng)子含有14個(gè)光響應(yīng)元件，表明它對(duì)光信號(hào)的敏感性。另外，該啟動(dòng)子序列還包含一個(gè)赤霉素應(yīng)答元件、一個(gè)參與脫落酸應(yīng)答反應(yīng)的元件、一個(gè)干旱應(yīng)答元件和五個(gè)參與水楊酸應(yīng)答的元件，表明該基因的表達(dá)可能與激素和脅迫誘導(dǎo)有關(guān)。

2.2 pAhDGAT1∶GUS植物表達(dá)載體構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化

以花生基因組DNA為模板，利用攜帶XbaⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)的引物PD1aF/PD1aR對(duì)pAhDGAT1序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的序列進(jìn)行雙酶切，利用T4連接酶連接到pCAMBIA2301載體，替換載體上的CaMV35S 啟動(dòng)子，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到陽性克隆并提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和NcoⅠ雙酶切質(zhì)粒，產(chǎn)生1 200 bp左右的條帶，說明pAhDGAT1已成功克隆到pCAMBIA2301載體中。

將構(gòu)建好的pAhDGAT1∶GUS載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)

利用卡那霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行篩選，將白化苗去掉，得到12個(gè)抗性株系。提取12個(gè)株系煙草葉片DNA作為模板進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，結(jié)果表明，有11個(gè)株系在1 200 bp左右出現(xiàn)了特異性條帶（圖2），即為陽性轉(zhuǎn)基因煙草株系。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS 活性檢測(cè)

利用GUS染色方法檢驗(yàn)pAhDGAT1啟動(dòng)子的活性。從圖3可以看出該啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的啟動(dòng)GUS基因表達(dá)的能力，在營養(yǎng)器官和生殖器官中均能檢測(cè)到GUS表達(dá)（圖3E-H），但是花絲和花柱中GUS表達(dá)很低（圖3G），柱頭、花藥和種子中表達(dá)較高（圖3G、H）。表明pAhDGAT1的表達(dá)沒有組織器官特異性，具有組成型啟動(dòng)子的特性。

3 討論與結(jié)論

DGAT催化?；o酶A酰化sn-1，2二?；视托纬蒚AG，也是該途徑的限速酶和關(guān)鍵酶[5]，這就是肯尼迪（Kennedy）途徑。DGAT在植物和動(dòng)物的油脂合成中具有非常重要的作用。油茶中油脂的合成主要受DGAT1基因表達(dá)的影響，但是DGAT1對(duì)其脂肪酸成分變化的影響較小[27]，甚至不影響脂肪酸組成。我們前期從花生中克隆得到了DGAT1和DGAT2基因，將其轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草種子的總脂肪酸含量顯著增加[23，24]。

基因啟動(dòng)子位于基因上游的非編碼區(qū)，能夠活化RNA聚合酶并準(zhǔn)確結(jié)合模板DNA，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)錄起始的特異性[28]。啟動(dòng)子主要由核心啟動(dòng)區(qū)、上游元件和應(yīng)答元件三部分組成。上游元件包括TATA-box、CAAT-box和GC-box等，其中TATA-box是植物啟動(dòng)子最典型的特征。本研究克隆獲得的pAhDGAT1序列含有64個(gè)TATA-box和19個(gè)CAAT-box元件，說明pAhDGAT1具有典型啟動(dòng)子特性。另外還發(fā)現(xiàn)，pAhDGAT1含有一些光應(yīng)答、激素誘導(dǎo)和脅迫誘導(dǎo)等調(diào)控元件，推測(cè)AhDGAT1的表達(dá)可能會(huì)受這些因素的影響。前期研究發(fā)現(xiàn)在冷、紫外損傷以及機(jī)械損傷前提下，AhDGAT1基因表達(dá)明顯降低，說明冷、紫外損傷和機(jī)械損傷對(duì)其影響較大[23]，該結(jié)果與本研究相符。

DGAT的表達(dá)差異對(duì)植物中油脂的合成具有重要作用[29]。DGAT1基因在大多數(shù)高等植物的各組織器官中都有表達(dá)，但是表達(dá)模式卻存在很大的差異。例如在擬南芥發(fā)育中的種子、花瓣、花芽中DGAT1表達(dá)量相比葉和莖中表達(dá)量高[20]，而且在擬南芥衰老葉片中DGAT1轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，導(dǎo)致蛋白含量和TAG含量的提高[30]。對(duì)其他雙子葉植物DGAT的研究表明，它們的表達(dá)模式與在擬南芥中相似[9，11，31]，但旱金蓮DGAT1只在發(fā)育的種子中表達(dá)[13]，在其他組織中沒有表達(dá)。前期我們對(duì)AhDGAT1表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)該基因在花生的各個(gè)組織中都有表達(dá)，但在花中表達(dá)量最高，未成熟種子和萌發(fā)種子中的表達(dá)量高于根、莖、葉中的表達(dá)量[23]。隨后又在花生中克隆了AhDGAT2a的啟動(dòng)子序列并對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證，結(jié)果表明AhDGAT2a的啟動(dòng)子在各個(gè)組織器官均有表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)pAhDGAT1在花絲和花柱中表達(dá)量較低，而在柱頭、花藥和種子中表達(dá)較高。這些研究與前人研究結(jié)果類似，說明DGAT1不僅對(duì)植物種子脂肪酸合成起重要作用，還對(duì)其他組織器官的脂肪酸合成起重要作用。

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