王一帆+潘教文+李臻+王慶國(guó)+李穎秀+管延安+劉煒

摘要：本研究以谷子 “豫谷1號(hào)”為材料，結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以谷子幼苗提取的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR特異擴(kuò)增SiRLK35上游1 893 bp調(diào)控序列，命名為SiRLK35P。結(jié)合PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)SiRLK35P進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)情況進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，SiRLK35P中含有ABRELATERD1（ACGT）、GCCCORE（GCCGCC）等多種順式作用元件，部分元件已知與不同逆境脅迫及應(yīng)答相關(guān)，預(yù)測(cè)該啟動(dòng)子可能參與谷子脅迫響應(yīng)，調(diào)控下游基因在脅迫等逆境條件下的表達(dá)水平，從而對(duì)谷子在脅迫下的應(yīng)答進(jìn)行調(diào)控。該研究為定向改良谷子抗逆特性、培育谷子抗逆新品種提供了候選材料。

關(guān)鍵詞：谷子；啟動(dòng)子；SiRLK35P；順式作用元件；抗逆；品種培育

中圖分類號(hào)：S515：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）07-0007-05

Abstract Using Yugu 1 as material， a 1 893 bp upstream regulatory sequence of SiRLK35 gene， which named SiRLK35P， was identified by database searching， and was isolated by PCR amplification using genomic DNA of foxtail millet as template. Bioinformatics analysis of SiRLK35P was carried out with PLACE database， and its expression pattern was forecasted. The results showed that several cis-acting elements， such as ABRELATERD1 （ACGT） and GCCCORE （GCCGCC）， existed in SiRLK35P， and parts of them were known to be associated with stress responsive processes， which indicated that SiRLK35P might participate in stress response and regulate the expression levels of downstream genes under stress conditions. This research would provide a candidate material for stress resistance improvement and new variety breeding of foxtail millet.

Keywords Foxtail millet； Promoter； SiRLK35P； Cis-acting element； Stress resistance； Variety cultivation

啟動(dòng)子是一段位于功能基因上游，能結(jié)合RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄因子，從而決定基因轉(zhuǎn)錄起始以及表達(dá)量的DNA序列。啟動(dòng)子作為基因上游的調(diào)控序列，其中的順式作用元件在基因的轉(zhuǎn)錄及時(shí)空表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[1]。對(duì)基因啟動(dòng)子的研究，尤其對(duì)該序列中所包含的不同調(diào)控元件的解析，將有助于預(yù)測(cè)基因的表達(dá)調(diào)控模式，為進(jìn)一步解析基因功能奠定基礎(chǔ)。

根據(jù)啟動(dòng)子所包含的關(guān)鍵調(diào)控元件的種類及功能，結(jié)合其下游調(diào)控基因的生物特性，植物中啟動(dòng)子通?？煞譃槿悾航M成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[2]，但同時(shí)很多組織特異性啟動(dòng)子和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也包含組成型啟動(dòng)子[3]。其中，脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可對(duì)逆境條件如干旱、高鹽等非生物脅迫或病蟲害等生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，從而對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[4]。

谷子在我國(guó)北方種植廣泛，是我國(guó)傳統(tǒng)糧食作物兼戰(zhàn)略儲(chǔ)備作物。但在國(guó)際科學(xué)界，其遺傳學(xué)研究相對(duì)落后。2012年，谷子測(cè)序工作的完成[5]，為解析谷子基因功能及其調(diào)控機(jī)制提供了新的途徑。本項(xiàng)目組在前期研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)與谷子抗逆相關(guān)的類受體蛋白激酶基因SiRLK35[6]。本研究擬結(jié)合谷子數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分離得到該基因啟動(dòng)子，并通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)作用元件分析，明確該啟動(dòng)子類型，以期為進(jìn)一步解析SiRLK35基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究以谷子品種“豫谷1號(hào)”為材料。pEASY BLUNT試劑盒、TransStart FastPfu DNA Polymerase試劑盒、2×EasyTaq SuperMix均購(gòu)于Transgen公司（山東濟(jì)南雨同生物科技有限公司）；薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于GENERAY Biotechnology；高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)于BioTeke公司（濟(jì)南承森貿(mào)易有限公司）；引物由上海英濰捷基公司合成；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 基因組DNA提取

將“豫谷1號(hào)” 培養(yǎng)3周至三葉期，取其幼苗，使用TPS法提取谷子基因組DNA。

1.3 啟動(dòng)子SiRLK35P的分離

檢索國(guó)家谷子數(shù)據(jù)中心（http：//www.setariadb.cn/），得到SiRLK35基因起始密碼子上游1 893 bp序列，作為基因啟動(dòng)子序列，命名為SiRLK35P。使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物SiRLK35PS1：TGCTTGTGCGTCTGCGCCGTGTGA、SiRLK35PA1：AACGGTTTATTTGCTTGGAGTACCT。以谷子幼苗基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為：基因組DNA 1 μL、引物SiRLK35PS1、SiRLK35PA1各0.5 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL、5×TransStart FastPfu Buffer 4 μL、dNTPs 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊到20 μL。反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57.5℃ 30 s，72℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收，與pEASY BLUNT載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含100 mg/L Amp抗性的LB平板， 37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取陽(yáng)性的單克隆，提取質(zhì)粒后送至山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序室測(cè)序。

1.4 啟動(dòng)子SiRLK35P中順式作用元件分析

利用PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對(duì)啟動(dòng)子所含的順式作用元件進(jìn)行分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子SiRLK35P的克隆

借助序列特異性引物，應(yīng)用PCR擴(kuò)增到一條大約2 000 bp的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示條帶大小為1 893 bp，與預(yù)測(cè)片段大小一致（圖1）。

2.2 啟動(dòng)子SiRLK35P順式作用元件分析

使用PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)SiRLK35基因啟動(dòng)子SiRLK35P中所包含的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖2，該啟動(dòng)子中除含有組成型的、序列保守的基本調(diào)控元件CAAT BOX、TATA BOX及組織特異性的胚乳醇溶蛋白元件DOFCOREZM之外[8，9]，還含有多種與植物抗逆相關(guān)的順式作用元件。其中包括參與植物抗逆以及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)的W BOX元件5個(gè)，調(diào)控ABA響應(yīng)的ABRELATERD1元件3個(gè)、DPBFCOREDCDC3元件1個(gè)，在調(diào)控茉莉酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起重要作用的GCCCORE元件5個(gè)，受SA誘導(dǎo)的GT1CONSENSUS元件1個(gè)，與致病菌鹽誘導(dǎo)相關(guān)GT1GMSCAM4元件1個(gè)，以及赤霉素響應(yīng)元件PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 2個(gè)， 與氧化反應(yīng)相關(guān)的CURECORECR元件 6個(gè)（表1）。

3 討論與結(jié)論

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，可以被外界信號(hào)誘導(dǎo)表達(dá)，從而啟動(dòng)其對(duì)下游基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在各物種中都有發(fā)現(xiàn)且研究較多，但在谷子中的研究相對(duì)較少。rd29A啟動(dòng)子是目前研究最廣泛的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子之一，楊春霞等[10]通過(guò)構(gòu)建rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)經(jīng)脅迫處理后，GUS基因表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明脅迫環(huán)境可誘導(dǎo)rd29A啟動(dòng)子活性；Xu等[11]通過(guò)構(gòu)建含有PsPR10啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)入煙草，結(jié)果顯示，SA、ABA以及MeJA處理均可誘導(dǎo)其活性；李鵬麗等[12]通過(guò)對(duì)大豆中與衰老相關(guān)的類受體蛋白激酶基因rlpk2上游啟動(dòng)子區(qū)域研究發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子能夠在番茄愈傷組織生長(zhǎng)中瞬時(shí)表達(dá)； Li等[13]從山葡萄葉片中發(fā)現(xiàn)在幾丁質(zhì)酶基因VCH3的上游存在兩個(gè)SA順式作用元件，其表達(dá)受SA誘導(dǎo)；彭建令等[14]克隆了3個(gè)含有細(xì)菌誘導(dǎo)元件的啟動(dòng)子PPP1、PPP2、PPP3，轉(zhuǎn)入煙草植株后均可受青枯菌誘導(dǎo)；姜驍?shù)萚15]通過(guò)構(gòu)建NTORK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，結(jié)果NTORK1啟動(dòng)子可被低濃度的NAA和高濃度SA誘導(dǎo)表達(dá)。

本研究借助PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)啟動(dòng)子SiRLK35P進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該區(qū)域中含有大量參與脅迫響應(yīng)、功能行使的順式作用元件，其中包括參與植物抗逆響應(yīng)的W BOX，說(shuō)明該啟動(dòng)子可能對(duì)逆境產(chǎn)生響應(yīng)，從而調(diào)控下游基因表達(dá)；另外還含有GA響應(yīng)元件PYRIMIDINEBOXOSRA MY1A，調(diào)控ABA響應(yīng)的ABRELATERD1元件、 DPBFCOREDCDC3元件，在調(diào)控茉莉酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起重要作用的GCCCORE元件，受SA誘導(dǎo)的GT1CONSENSUS元件以及與致病菌鹽誘導(dǎo)相關(guān)GT1GMSCAM4元件，說(shuō)明該啟動(dòng)子可能受GA、ABA等多種激素誘導(dǎo)并調(diào)控下游基因表達(dá)。因此，啟動(dòng)子SiRLK35P具有多重因子誘導(dǎo)的活性，其下游基因SiRLK35可能在谷子的脅迫及誘導(dǎo)響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

以上結(jié)果顯示，啟動(dòng)子SiRLK35P為脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，具有被多種脅迫誘導(dǎo)的活性，推測(cè)在植物受到干旱、鹽等脅迫時(shí)，SiRLK35P可以通過(guò)調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，從而使植物對(duì)逆境脅迫做出響應(yīng)，減少脅迫對(duì)植物的傷害。目前，該啟動(dòng)子下游調(diào)控基因SiRLK35的植物雙元表達(dá)載體已構(gòu)建成功，擬借助基因工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而對(duì)該基因的生物學(xué)功能及其在植物抗旱抗逆等方面的應(yīng)用進(jìn)行研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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