徐弢+鄭雪+張曉林+陳永對+穆野+陳勇+鄭寬瑜+趙立華+劉小燭+張潔

摘要：本研究根據(jù)番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV）保守N基因（GenBank登錄號： 13YV639）設(shè)計一對特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，構(gòu)建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR檢測方法。該方法穩(wěn)定可靠，組內(nèi)和組間的變異系數(shù)都小于2%；標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)分別為-3.39和0.996，擴(kuò)增效率為97.44%；最低能檢測到1.07×104 copies/μL的陽性質(zhì)粒，靈敏度為常規(guī)PCR的1 000倍。同時利用構(gòu)建的RT-qPCR方法檢測TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV四種病毒，只有TZSV有特異擴(kuò)增曲線，表明該方法特異性良好。本研究構(gòu)建的RT-qPCR方法能夠為TZSV的早期預(yù)警與動態(tài)監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：番茄環(huán)紋斑點病毒；實時熒光定量 PCR；檢測方法

中圖分類號：S41-30：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0139-06

Abstract The real-time PCR specific primers were designed according to the coat protein N gene sequence （GenBank accession number 13YV639） of Tomato zonate spot virus （TZSV）. By optimizing the reaction conditions and reaction system， the SYBR Green real-time PCR method was established to detect the TZSV. This method was stable and reliable， and the CV between and among groups were both less than 2%. The slope and correlation coefficient of the standard curve were -3.39 and 0.996 respectively， and the amplification efficiency was 97.44%. The positive plasmid of 1.07×104 copies/μL could be detected， and the sensitivity was 1 000 times of conventional PCR. When TSWV， TNSaV， PCSV and TZSV were detected by the method， only TZSV had a specific amplification curve， which indicated that the method was specific. This research would provide technical supports for the early warning and dynamic monitoring of TZSV.

Keywords Tomato zonate spot virus； Real-time fluorescence quantitative PCR； Detection method

番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV）屬于布尼亞科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）。2008年，TZSV首次在云南辣椒上發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在鳶尾上也有報道[2]。該病毒是RNA病毒，其基因組由三條RNA鏈組成：ssRNA-L、ssRNA-M和ssRNA-S。其中，ssRNA-L是反向負(fù)義鏈，編碼依賴RNA的RNA酶；ssRNA-M編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm；ssRNA-S編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。感染TZSV后的植物，新葉上首先出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋或環(huán)形帶狀褪綠斑點，之后由黃斑轉(zhuǎn)變?yōu)榭莅?，葉片出現(xiàn)黃化、凋零，造成整葉或半葉呈紅褐色壞死；受病植株還會出現(xiàn)矮化、頂芽萎蔫下垂、葉片皺縮退綠等癥狀，嚴(yán)重者在幾周內(nèi)就會死亡從而導(dǎo)致絕收[1，3]，對云南地區(qū)的辣椒、番茄、煙草等經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重?fù)p失[1，3-5]。目前，TZSV只在我國云南紅河、文山、石林等地有報道，是云南地區(qū)的優(yōu)勢種[1，4]，還未擴(kuò)散至其他省市地區(qū)，因此對TZSV的預(yù)防尤為重要。

TZSV主要是由薊馬傳播。本課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病區(qū)西花薊馬（Franiklinella ocicdentalis）是優(yōu)勢種群，此外還發(fā)現(xiàn)有棕櫚薊馬（T. palmi）、梳缺花薊馬（F. shculetzi ）[4，6]，推測這三種薊馬均能傳播該病毒。目前對于TZSV病害尚無有效的防治手段，建立TZSV的早期診斷技術(shù)，加強對TZSV的預(yù)警與監(jiān)測，在早期能及時發(fā)現(xiàn)并及早采取有效控制措施，對延緩病情的蔓延具有重要意義。目前，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和常規(guī)PCR技術(shù)是病毒病的主要檢測手段。但這兩種檢測技術(shù)都存在不足：前者檢測靈敏度低，特異性差；后者不能對病毒準(zhǔn)確定量分析。實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）技術(shù)既能準(zhǔn)確快速檢測病毒，還可對病毒進(jìn)行定量分析[7，8]。與TaqMan RT-qPCR相比，基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR測定具有成本低、易于設(shè)計、更靈敏和產(chǎn)生線性圖等優(yōu)點[9]。迄今為止還沒有將基于N基因的SYBR Green RT-qPCR技術(shù)用于TZSV分子診斷的報道。本研究針對TZSV的N基因設(shè)計用于RT-qPCR檢測的引物，構(gòu)建了TZSV RT-qPCR檢測方法，擬為TZSV的流行檢測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒為遵辣1號，種子由貴州省遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，栽培于玻璃溫室中，培養(yǎng)條件：溫度24～26℃，濕度60%，光周期16 h。辣椒褪綠斑病毒（Pepper chlorotic spot virus， PCSV） 、番茄壞死斑點相關(guān)病毒（Tomato necrotic spot-associated virus， TNSaV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）和番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV）由本實驗室保存。

Tripure Isolation Reagent RNA提取液和FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）試劑盒購自Roche（德國）（以下簡稱MIX）；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Trans）、質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Trans）、dNTP和Taq酶均購自TaKaRa（日本）；超微量紫外可見分光光度計（Thermo Nandrop 2000）購自美國。

1.2 病毒接種

將保存于-80℃冰箱的TZSV、PCSV、TSWV和TNSaV接種于幼嫩的辣椒葉片上。步驟如下：采集發(fā)病葉，加入接種緩沖液研磨直至汁液溢出，用棉簽蘸取少量病樣汁液，在灑了少許金剛砂的待接種辣椒葉面上摩擦2～3次，15～20 min后用清水沖洗葉片。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的TZSV N基因序列（登錄號：13YV639），設(shè)計TZSV N基因的特異性引物TZSV-Q-3F：5′-ATGAGGAGAACAAGGCTAA-3′、TZSV-Q-3R：5′-GAATGTCAGTCTGTAGCA-3′，并送Invitrogen公司合成。RT-PCR及實時熒光定量PCR均可采用此引物。

1.4 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

稱取約0.1 g感染TZSV的辣椒葉片，根據(jù)TriPure Isolation Reagent提取液說明書提取植物總RNA，溶于30 μL RNase-free Water中。用超微量紫外可見分光光度計檢測其在260、280 nm處的吸光度，評估RNA質(zhì)量。將質(zhì)量合格的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Trans）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因擴(kuò)增

利用設(shè)計的引物，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增TZSV N基因。

PCR體系：5 μL cDNA，2 μL引物（濃度10 μmol/L，反向和正向各1 μL），36.5 μL水，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.5 μL Taq酶（5 U/μL）和5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）。

PCR擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，62℃ 15 s，72℃ 15 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)（Genegenius，美國）拍照觀察，并將目的片段膠回收測序。

1.6 實時熒光定量PCR方法的建立

1.6.1 TZSV病毒質(zhì)粒的制備 將膠回收后的產(chǎn)物用pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌，37℃培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒DNA。利用超微量紫外可見分光光度計（Thermo Nandrop 2000）檢測質(zhì)粒濃度（OD260/OD280和OD260/OD230），并計算拷貝數(shù)。再將質(zhì)粒梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，以此作為TZSV陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件 以TZSV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為：1 μL模板、上下游引物各1 μL（濃度為10 μmol/L）、10 μL MIX和8 μL RNase-free Water。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)；熔解曲線條件為：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

1.6.3 重復(fù)性試驗 以4組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA（濃度梯度10-2、10-3、10-4和10-5）為模板，同一濃度做3次重復(fù)，分析組內(nèi)差異；以4組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA（濃度梯度10-2、10-3、10-4和10-5）為模板重復(fù)3次獨立試驗，分析不同批次試驗之間的重復(fù)性。

1.6.4 靈敏度試驗 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA稀釋9個濃度梯度（10-2～10-10），用實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增，以檢測實時熒光定量PCR的靈敏度。

1.6.5 特異性試驗 將含有TSWV、TNSaV、PCSV、TZSV病毒的辣椒葉片各稱取0.1 g，分別提取總RNA后，采用上述構(gòu)建的RT-qPCR技術(shù)檢測，以驗證所構(gòu)建的RT-qPCR方法的特異性。

1.6.6 實時熒光定量PCR的初步運用 分別用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR檢測實驗室摩擦接毒辣椒樣品，比較三種方法的差異，以檢驗構(gòu)建的RT-qPCR方法的實用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因獲得及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的制備

利用特異引物擴(kuò)增TZSV的N基因片段（圖1），膠回收后連接到pMD18-T質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，一致性為98%，序列全長164 bp。

提取大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA，用超微量紫外可見分光光度計（Thermo Nandrop 2000）檢測質(zhì)粒濃度及質(zhì)量（表1），濃度為163.4 ng/μL，純度符合RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。根據(jù)公式計算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.07×1012 copies/μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA（1.07×1011 ～1.07×107 copies/μL）為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，得到RT-qPCR的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= -3.39X+23.10（R2=0.996）。計算可得擴(kuò)增效率為97.44%，且標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2、3）。

2.3 重復(fù)性試驗

以1.07×1010 ～1.07×107 copies/μL 4個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR，同一個試驗中，每個稀釋度重復(fù)3次，組內(nèi)3次結(jié)果（表2）表明，4組不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA Ct值的變異系數(shù)為0.20%～0.48%；再以同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行3次獨立的重復(fù)試驗，結(jié)果（表3）表明，組間變異系數(shù)小于2%。組內(nèi)組間變異系數(shù)均在可變范圍內(nèi)，說明該方法穩(wěn)定可靠。

2.4 靈敏度試驗

分別用RT-qPCR與常規(guī)PCR檢測稀釋不同倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（1.07×1010 ～1.07×102 copies/μL），發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR檢測范圍為1.07×1010 ～1.07×107 copies/μL （圖4），而RT-qPCR在1.07×104 copies/μL仍能得到良好的擴(kuò)增曲線（圖5），說明RT-qPCR的靈敏度比常規(guī)PCR高103倍左右。

2.5 特異性試驗

為驗證本方法的特異性，利用RT-qPCR分別檢測辣椒中的TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV。結(jié)果表明，TSWV、TNSaV和PCSV都未出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線，只有TZSV出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線（圖6），表明本研究所構(gòu)建的檢測方法具有良好的特異性。

2.6 熒光定量PCR的初步運用

分別用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR檢測實驗室摩擦接毒辣椒樣品，結(jié)果表明，檢測的6份樣品中，DOT-ELISA和RT-PCR檢測出2個陽性樣品，而RT-qPCR檢測出4個樣品呈陽性（表4），說明RT-qPCR靈敏度高于DOT-ELISA和RT-PCR。

3 討論與結(jié)論

隨著社會科技的發(fā)展，病毒檢測手段也越來越多，如血清免疫學(xué)和生物學(xué)技術(shù)。血清學(xué)包括Immuno Strip和ELISA法；生物學(xué)技術(shù)主要利用特異性引物或者簡并性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增[10，11]，之后再利用分子克隆技術(shù)進(jìn)行測序、序列比對分析。鄭寬瑜等[12]通過構(gòu)建TZSV NSs血清，應(yīng)用ELISA法檢測植物中的TZSV。血清學(xué)雖能快速檢測病毒，但這種方法缺點明顯。張等[13]發(fā)現(xiàn)， INSV感染的文心蘭（Oncidium luridum）樣品ELISA檢測結(jié)果為陰性，但RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，表明植物中INSV分布不均勻，應(yīng)用ELISA 檢測會造成誤差，ELISA 法不能準(zhǔn)確檢測低濃度的INSV。

實時熒光定量PCR是近年來比較流行的檢測手段，由于其靈敏度高、特異性強的特點越來越受到關(guān)注，已廣泛運用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、海關(guān)檢疫等領(lǐng)域，如甘薯退綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）[14]、小反芻獸疫病毒（Pestedes petits ruminants virus，PPRV）[15]、禽腦脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV）的檢測[16]。實時熒光定量PCR包括探針類和染料類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；染料類如SYBR Green Ⅰ則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者操作簡便易行，成本較低。

實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比具有許多優(yōu)點。首先，實時熒光定量PCR使用新的溫度控制機制，顯著減少擴(kuò)增時間。其次，常規(guī)PCR擴(kuò)增后電泳和染色步驟耗時、污染環(huán)境，對人體有害。第三，實時熒光定量PCR方法數(shù)據(jù)分析快速且具有良好的再現(xiàn)性，可以同時進(jìn)行96個樣品的數(shù)據(jù)分析，高效快速。本試驗根據(jù)TZSV N基因的保守區(qū)設(shè)計特異性引物，構(gòu)建了TZSV N基因的實時熒光定量PCR檢測方法。該方法的靈敏度、重復(fù)性、特異性良好，能用于檢測實驗室接毒辣椒樣品。該檢測方法的構(gòu)建將為早期TZSV的傳播、蔓延提供可靠的預(yù)測預(yù)報手段。

參 考 文 獻(xiàn)：

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