馬廣瑩，朱開(kāi)元，史小華，鄒清成，劉慧春，詹 菁，田丹青*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開(kāi)發(fā)中心，杭州311202；2.浙江省杭州蕭山技師學(xué)院，杭州311202）

紅掌2個(gè)SOC1基因的克隆、序列與表達(dá)分析

馬廣瑩1，朱開(kāi)元1，史小華1，鄒清成1，劉慧春1，詹 菁2，田丹青1*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開(kāi)發(fā)中心，杭州311202；2.浙江省杭州蕭山技師學(xué)院，杭州311202）

為了明確SOC1轉(zhuǎn)錄因子在紅掌中的成員及作用機(jī)制，采用5＇/3＇末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得這2個(gè)SOC1基因的完整編碼區(qū)，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析這2個(gè)基因的相關(guān)信息，并結(jié)合熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證這2個(gè)基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示：獲得的2個(gè)基因核苷酸長(zhǎng)度分別為651 bp和642 bp，命名為AaSOC1-1和AaSOC1-2；2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在二級(jí)結(jié)構(gòu)上均有螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角，未發(fā)現(xiàn)其他結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，二者與單子葉植物同類蛋白距離較近，與紅掌的植物學(xué)分類地位一致。表達(dá)分析結(jié)果顯示，2個(gè)基因均在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中表達(dá)，但表達(dá)水平略有差異。研究認(rèn)為，從紅掌中克隆的2個(gè)SOC1轉(zhuǎn)錄因子可能定位于線粒體而非細(xì)胞核中，二者在序列組成和表達(dá)模式上既有保守性也存在一定的差異性，預(yù)示它們?cè)诠δ苌峡赡芤泊嬖谝欢ǖ膮^(qū)別。

紅掌；SOC1基因；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

Summary SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1(SOC1)is a flowering integration factor that widely existed in flowering plants,which is necessary in multiple flowering induction pathways,including vernalization,photoperiod,gibberellin, and otherendogenousorexogenousenvironmentalsignals.Therefore,research oftheeffectof SOC1 on plantgrowth and development can reveal the plant flowering mechanism and direct molecular breeding.Anthurium is a kind of high?grade potted flower in the worldwide.However,molecular biology research on this plant had just started.As a flowering integration factor,SOC1 in Anthurium may be a key to deeply understand the flower conversion process.

In this study,rapid amplification ofcDNA ends(RACE)technology was used to obtain the fulllength oftwo SOC1 genes of Anthurium.Severalbiologicalsoftwares were used to analyze the biologicalinformation,including NCBIBlast,NCBIConserved Domain Search,ProtParam,TMHMM Server version 2.0,SignalP 4.1 Server,iPSORT,PSIPRED,DNAman,and MEGA 6.0. Gene expression levels of the two SOC1 genes were detected by real?time reverse transcription?polymerase chain reaction(RT?PCR).

The main results were as follows:AaSOC1-1 and AaSOC1-2 were obtained from two independent SOC1 full codingsequence(CDS)regions,which shared 75.6%similarity at the nucleotide level.Their encoded proteins were composed of 216 and 213 amino acid residues,respectively.Both ofthe putative proteins had secondary structures such as helix,sheet,and turn, but no other special structures were found.Based on the online software analysis results,it was concluded that AaSOC1-1 and AaSOC1-2 were located in the mitochondria but not in the nucleus.Phylogenetic tree analysis showed that the two SOC1 transcription factors from Anthurium were tightly clustered with each other,and also with other monocotyledons.Fluorescence quantitative RT?PCR analysis revealed that both genes from Anthurium were ubiquitously expressed in the vegetative and reproductive organs,but different in the expression patterns.Particularly,AaSOC1-1 was mainly expressed in the bract and tepal,whereas AaSOC1-2 was mainly expressed in the stem and pedicel.

In sum,this study reported the nucleotide and deduced amino acid composition of the two SOC1 transcription factors. Preliminary analysis of their characteristics,structure,and potential function were performed through bioinformatics software, combined with multiple sequence alignment and phylogenetic tree construction.Based on the results,the two genes found in Anthurium were identified asmembersof SOC1 gene family.Gene expression experimentsconfirmed the similaritiesand differences of their expression patterns,which were relatively conservative compared with other species.This study lays the foundation for understanding the functional properties of these two transcription factors,which also requires in?depth research to verify the above speculation and views.

植物需要一個(gè)精準(zhǔn)的調(diào)控系統(tǒng)來(lái)完成由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。植物在進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)形成了這種精準(zhǔn)的調(diào)控體系，其中以MADS盒（MADS?box）為主的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮了十分重要的作用。近30年來(lái)，植物學(xué)家和分子生物學(xué)家在對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、矮牽牛（Petunia hybrida）、金魚(yú)草（Antirrhinum majus）等植物的研究中，逐漸總結(jié)出植物開(kāi)花所涉及的4種途徑：光周期途徑、自主控制途徑、低溫春化途徑和赤霉素途徑[1-3]。植物在受到外界環(huán)境或內(nèi)源物質(zhì)等成花信號(hào)的刺激后，會(huì)通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，匯總到已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的FT(FLOWERING LO?CUS T)、LFY(LEAFY)、SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1)這3種成花整合因子中，它們隨后再將成花信號(hào)傳遞給花器官?zèng)Q定基因，從而誘導(dǎo)成花，實(shí)現(xiàn)由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變[4]。

SOC1是MADS盒轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其氨基酸組成較為保守，具有典型的M、I、K、C區(qū)段[5]。該轉(zhuǎn)錄因子最早在篩選過(guò)表達(dá)CO基因的突變體時(shí)在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[6]。SOC1功能缺失會(huì)嚴(yán)重抑制35S::CO植株的早花現(xiàn)象，說(shuō)明SOC1作為CO基因的下游調(diào)控者，參與成花誘導(dǎo)，并且先于花原基出現(xiàn)，在部分營(yíng)養(yǎng)器官如莖頂端分生組織、葉片、莖段，甚至根部中均有表達(dá)[7]。在擬南芥以外的其他物種中也存在類似的表達(dá)模式[8-10]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，它也在花器官形成初期表達(dá)，并參與花器官的決定[11-12]。所以，SOC1從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段到生殖發(fā)育階段，都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在擬南芥中，SOC1的表達(dá)會(huì)對(duì)B功能基因造成壓制[13]，但在花分生組織出現(xiàn)后，SOC1的表達(dá)會(huì)受到短時(shí)的抑制，以利于其他花器官?zèng)Q定基因的表達(dá)，然而這種短時(shí)的抑制會(huì)很快消失，所以在擬南芥的雌雄蕊中，也可以檢測(cè)到該基因的表達(dá)[14-15]。在調(diào)控方式上，SOC1的表達(dá)受到自身及其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。有研究證明，SOC1本身可以與AG和AP1轉(zhuǎn)錄因子形成蛋白復(fù)合體，反過(guò)來(lái)結(jié)合于自身順式元件上，抑制自身的表達(dá)[16-17]。除了AG和AP1這2個(gè)同源異型轉(zhuǎn)錄因子，SVP和FLC作為MADS家族一員，也可以蛋白二聚體的形式調(diào)控SOC1的表達(dá)，表現(xiàn)為與SOC1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來(lái)抑制它的活性[18]。擬南芥SOC1雖然是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，但是其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，必須依靠MADS轉(zhuǎn)錄因子AGL24的協(xié)助才能順利進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其調(diào)控功能?？梢?jiàn)，AGL24在SOC1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有十分重要的作用[19]。

鑒于SOC1的重要調(diào)控功能及其在花器官發(fā)育過(guò)程中扮演的重要角色，近年來(lái)，有越來(lái)越多的同源基因被發(fā)掘研究，如牡丹（Paeonia suffruticosa）、矮牽牛、石斛蘭（Dendrobium）、草莓（Fragaria ananassa）、棉花（Gossypium hirsutum）等，涉及草本、木本、單子葉、雙子葉植物，已為深入研究SOC1轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化、調(diào)控、功能等工作做了積極探索[10-11,20-22]。本課題組已經(jīng)對(duì)紅掌中其他MADS基因的研究取得了一定的進(jìn)展[23]。在此基礎(chǔ)上開(kāi)展SOC1基因的研究，既能豐富紅掌MADS盒轉(zhuǎn)錄因子家族信息，也是解析該家族調(diào)控紅掌器官發(fā)生、成花轉(zhuǎn)換的必要環(huán)節(jié)，對(duì)深入開(kāi)展紅掌分子育種工作意義重大。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅掌品種“阿拉巴馬”為第一作者所在單位的組培品種，取樣時(shí)間為初花期。LA taq酶、pMD-18T載體、5＇/3＇末端快速擴(kuò)增（rapid amplification ofcDNA ends，RACE）試劑盒購(gòu)自TaKaRa（大連）公司，RNA提取試劑（Plant RNA Reagent）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄cDNA第1鏈合成使用天根公司（北京）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastquantRT Kit）。熒光定量分析采用TaKaRa（大連）公司熒光染料混合液（SYBR Fast qRT?PCR Mix），使用儀器為7500 Fast型熒光定量PCR儀（AB公司，美國(guó)）。其他耗材、生化試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用于基因克隆的總RNA提取自紅掌幼嫩的花梗、苞片、花序復(fù)合體?？俁NA分為2份，1份用于合成5＇RACE模板，1份用于合成3＇RACE模板，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。模板合成后，保存?zhèn)溆?。表達(dá)分析用總RNA提取自紅掌各幼嫩器官，包括根（根尖）、莖、葉（未展開(kāi)）、花梗（托葉包裹中）、苞片（托葉包裹中）、花被片（顯微可見(jiàn)）、雄蕊（顯微可見(jiàn)）、雌蕊（顯微可見(jiàn)）、果實(shí)（未成熟），然后經(jīng)由DNase處理，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，備用。

1.3 基因克隆及表達(dá)分析

在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上，已經(jīng)獲得了2個(gè)SOC1基因的表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST），分別長(zhǎng)294 bp和280 bp。以此序列為核心，設(shè)計(jì)特異引物（P1-5＇和P1-3＇擴(kuò)增AaSOC1-1；P2-5＇和P2-3＇擴(kuò)增AaSOC1-2），結(jié)合試劑盒通用引物UPM，采用LA taq酶并嚴(yán)格按照其擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，獲得2個(gè)基因的兩端序列，然后通過(guò)拼接、驗(yàn)證，得到2個(gè)基因的完整編碼區(qū)。所用引物序列如下。P1-5＇：ACATGATCCCAAACTTTCCCCCAGCAG，P1-3＇：TCTACGAGTTCTCCAGCAACAGCAT；P2-5＇：CAGCCTCTCCTTTTCCTTCAGCAGCGT；P2-3＇：TC ACGCTGCTGAAGGAAAAGGAGAGGC。通用引物為UPM：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAG TGGTAT CAACGCAGAGT。

在獲得2個(gè)基因的完整編碼區(qū)后，以2個(gè)基因C-端不保守區(qū)段為模板，設(shè)計(jì)特異引物（GSP1-F：AGCAGATTACATCGCTGAAGG，GSP1-R：TTCCCG CTGTCATTGTCATAG，產(chǎn)物長(zhǎng)127 bp；GSP2-F：GG AAAAGGAGAGGCTGCTGTT，GSP2-R：ATCAA CG GTGTCCAGAGCATC，產(chǎn)物長(zhǎng)97 bp），用于熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription?polymerase chain reaction，RT-PCR）。內(nèi)參基因采用紅掌UBQ基因，引物序列為UBQ-F：GGATT CTAGCT GCCAGGTTTG，UBQ-R：CGGGCATAATC GCAACTTG。反應(yīng)體系（20μL）嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30 s；95℃5 s，58℃10 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。表達(dá)水平采用2－△△CT法計(jì)算。

1.4 序列生物信息學(xué)分析

對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其中編碼區(qū)分析采用NCBI在線網(wǎng)站ORF Finder(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，編碼蛋白質(zhì)的保守區(qū)段分析采用NCBIConserved Domain Search軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，編碼區(qū)蛋白質(zhì)特征分析采用在線軟件ProtParam(http: //web.expasy.org/protparam/),TMHMM Server v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，iPSORT(http://ipsort.hgc.jp/)，PSIPRED(http://bioinf. cs.ucl.ac.uk/psipred/)。多序列比對(duì)采用軟件DNAman；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用Clustal X+MEGA 6.0：氨基酸全序列參與分析，選擇鄰位連接法（neighbor?joining method），用Bootstrap法檢驗(yàn)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅掌2個(gè)SOC1基因的克隆

通過(guò)RACE技術(shù)，在已知2個(gè)SOC1片段的基礎(chǔ)上，分別獲得了每個(gè)基因的上、下游序列，通過(guò)拼接以及全長(zhǎng)PCR驗(yàn)證，確認(rèn)了2個(gè)基因的核苷酸組成，分別命名為AaSOC1-1和AaSOC1-2。AaSOC1-1編碼區(qū)長(zhǎng)651 bp，AaSOC1-2編碼區(qū)長(zhǎng)642 bp（圖1）。從軟件分析結(jié)果得出，2個(gè)基因序列的一致性只有75.6%，基本排除是同一基因不同剪接體的可能。

圖1 AaSOC1-1和AaSOC1-2基因編碼區(qū)核苷酸序列比對(duì)Fig.1 Necleotide sequence alignmentofgene coding region of AaSOC1-1 and AaSOC1-2

2.2 AaSOC1-1和AaSOC1-2的生物信息學(xué)分析

在獲得2個(gè)SOC1基因核苷酸序列的基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的氨基酸以及相關(guān)特征屬性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，AaSOC1-1編碼216個(gè)氨基酸殘基，其中谷氨酸（Glu）共23個(gè)，占比10.6%，比例最高，其次為亮氨酸（Leu），共計(jì)20個(gè)，占比9.3%，最少的為色氨酸（Trp），共1個(gè)，占比0.5%；所有負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）共計(jì)29個(gè)，正電荷氨基酸（Arg+Lys+His）共計(jì)38個(gè)。AaSOC1-1編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為24 896.2，理論等電點(diǎn)pI=9.16，理論化學(xué)分子式為C1064H1736N322O340S13，預(yù)測(cè)的親水性平均系數(shù)（GRAVY)為－0.929：說(shuō)明該結(jié)構(gòu)親水性能較好，屬于親水性蛋白質(zhì)。通過(guò)TMHMM 2.0在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該編碼蛋白不具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，可認(rèn)為是非跨膜蛋白。SignalP 4.1 Server和iPSORT軟件分析顯示，該蛋白不含有核定位信號(hào)，而含有線粒體定位信號(hào)，預(yù)測(cè)該基因編碼產(chǎn)物可能定位于線粒體，通過(guò)其他途徑（例如與互作蛋白結(jié)合）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核發(fā)揮作用。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含有常見(jiàn)的螺旋（粉紅色）和折疊（黃色）結(jié)構(gòu)以及卷曲（無(wú)陰影）結(jié)構(gòu)（圖2A）；預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3A所示。

AaSOC1-2編碼213個(gè)氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高，共計(jì)29個(gè)，占比13.6%，其次為谷氨酸（Glu），共計(jì)27個(gè)，占比12.7%，含量最少的為色氨酸（Trp），共1個(gè)，占比0.5%；在該組成中，帶負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）共計(jì)35個(gè)，帶正電荷氨基酸（Arg+Lys+His）共計(jì)41個(gè)。預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量為24 546.0，理論等電點(diǎn)pI=6.68，理論化學(xué)分子式為C1064H1754N314O334S8，預(yù)測(cè)的親水性平均系數(shù)（GRAVY)為－0.642：說(shuō)明AaSOC1-2編碼蛋白也屬于親水性蛋白。通過(guò)TMHMM 2.0在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白不具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，也可認(rèn)為是非跨膜蛋白。SignalP 4.1 Server軟件分析顯示，該蛋白不含有信號(hào)肽。SignalP 4.1 Server和iPSORT軟件分析顯示，該蛋白不含有核定位信號(hào)，而含有線粒體定位信號(hào)，預(yù)測(cè)該基因編碼產(chǎn)物定位于線粒體，也是通過(guò)其他途徑轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。從圖2B可看出，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣含有常見(jiàn)的螺旋、折疊和卷曲結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3B所示。

圖2 AaSOC1-1(A)和AaSOC1-2(B)預(yù)測(cè)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Fig.2 Secondary structure composition ofdeduced amino acid from AaSOC1-1(A)and AaSOC1-2(B)

圖3 AaSOC1-1(A)和AaSOC1-2(B)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Deduced protein tertiary structure of AaSOC1-1(A)and AaSOC1-2(B)

運(yùn)用DNAman軟件對(duì)這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及不同物種的同源蛋白進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖4所示。從中可見(jiàn)：紅掌和其他物種的SOC1轉(zhuǎn)錄因子普遍具有氨基酸組成保守性，尤其在MADS區(qū)，無(wú)論是氨基酸數(shù)目還是組成，都保持了高度的保守性；在K區(qū)各序列之間保守區(qū)段較少，主要存在于零星的氨基酸殘基中；在相對(duì)不保守的C端，各序列均含有一個(gè)較為保守的DVETELFIGLP區(qū)段，該區(qū)段被認(rèn)為是SOC1家族共有的識(shí)別特征，本研究報(bào)道的2個(gè)SOC1序列均含有此保守區(qū)段，可以認(rèn)定這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子確為紅掌的SOC1同源成員。

為了更好地說(shuō)明紅掌中2個(gè)SOC1轉(zhuǎn)錄因子與其他物種同源基因的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建了不同物種SOC1轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析了總共25個(gè)不同來(lái)源的SOC1同源轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果（圖5）顯示：?jiǎn)巍㈦p子葉植物區(qū)分明顯，來(lái)源于棕櫚、石斛、玉米、小麥、紅掌的序列都?xì)w于單子葉植物組，其余都?xì)w于雙子葉植物組，序列的聚類信息與植物所屬類別完全一致；來(lái)源于紅掌的2個(gè)SOC1，雖然聚于同一分支，然而置信分值只有86，間接說(shuō)明二者在氨基酸組成、功能等方面存在較顯著的差異。

圖4 紅掌SOC1與其他物種同源蛋白多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignmentofhomologous SOC1 proteins from Anthurium and otherspecies

2.3 AaSOC1-1和AaSOC1-2的表達(dá)分析

為明確紅掌中2個(gè)SOC1基因的表達(dá)情況，對(duì)根、莖、葉等9個(gè)有代表性的部位進(jìn)行了熒光定量RT?PCR分析。結(jié)果（圖6）表明：AaSOC1-1的轉(zhuǎn)錄本在所檢測(cè)的各部位都有表達(dá)，其中在根部表達(dá)水平極低，在苞片中表達(dá)水平最高，在剛剛形成的果實(shí)中也存在低水平表達(dá)；AaSOC1-2的最低表達(dá)同樣在根部，其次是幼嫩的果實(shí)，而最高表達(dá)出現(xiàn)在花梗處；2個(gè)基因的表達(dá)在花器官中由外向內(nèi)逐漸遞減，表達(dá)主要集中于營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官過(guò)渡的部位。

圖5 不同來(lái)源SOC1轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of SOC1 transcription factors from differentsources

圖6 AaSOC1-1和AaSOC1-2在紅掌不同部位的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of AaSOC1-1 and AaSOC1-2 in differenttissues of Anthurium

3 討論

在目前報(bào)道的有關(guān)SOC1的研究中，多數(shù)植株中只發(fā)現(xiàn)了1種轉(zhuǎn)錄本，也有在1種植物中發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄本的情況[24]。在本研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SOC1基因序列的相似度并不高，預(yù)測(cè)的氨基酸序列差異也比較大，但通過(guò)多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析和氨基酸組成分析，都可以判定它們屬于SOC1轉(zhuǎn)錄因子家族成員；因此，可以認(rèn)定紅掌中至少存在2個(gè)或2個(gè)以上的SOC1同源基因。

生物信息學(xué)分析顯示，紅掌中的這2個(gè)SOC1轉(zhuǎn)錄因子都不含有核定位信號(hào)，這就意味著它們發(fā)揮調(diào)控功能需要借助外力進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。在擬南芥以及草莓等物種上，SOC1定位于細(xì)胞質(zhì)并與其他蛋白質(zhì)互作進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能已經(jīng)被多次報(bào)道[11,19]。據(jù)此推斷，本研究的2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也有可能是通過(guò)類似的途徑參與紅掌的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。

從表達(dá)分析結(jié)果看，源于紅掌的這2個(gè)SOC1基因在不同的組織部位皆有表達(dá)，包括營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官。這與前人在其他物種上報(bào)道的同源基因的表達(dá)模式類似[25-26]。特別之處在于，紅掌的生殖器官著生在一根長(zhǎng)長(zhǎng)的花梗上，包括苞片、肉穗花序、花器官。本研究結(jié)果顯示，紅掌的2個(gè)SOC1基因在花梗中都有較高的表達(dá)水平，尤其是AaSOC1-2，這說(shuō)明2個(gè)SOC1基因在成花轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用。在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中的普遍表達(dá)，暗示紅掌中2個(gè)SOC1基因除了扮演開(kāi)花整合因子的角色，也很有可能在花器官分生組織決定方面起到某種作用，這一推論前人在其他物種的相關(guān)研究中也多有報(bào)道[20,27]。

本研究雖未涉及2個(gè)SOC1轉(zhuǎn)錄因子的功能驗(yàn)證，但是從已報(bào)道的不同物種SOC1轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果來(lái)看，促進(jìn)植物開(kāi)花幾乎是絕大多數(shù)SOC1的共有功能[28-30]。此外，在擬南芥中的SOC1轉(zhuǎn)錄因子還可以通過(guò)調(diào)控一些氣孔開(kāi)放相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而間接控制氣孔的開(kāi)放[29]。對(duì)早竹SOC1的研究發(fā)現(xiàn)，它除了具有促進(jìn)開(kāi)花的功能外，還可以應(yīng)答赤霉素信號(hào)，隨赤霉素含量的增加而提高表達(dá)水平，且過(guò)表達(dá)該基因還能影響葉片的形態(tài)發(fā)育[30]。這些發(fā)現(xiàn)都豐富了SOC1的功能研究。我們對(duì)紅掌中2個(gè)SOC1基因的功能研究也正在進(jìn)行，二者是否存在功能特異性將在后續(xù)報(bào)道中呈現(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究采用經(jīng)典RACE克隆法，以2條已獲得的獨(dú)立EST序列為模板，從紅掌生殖器官cDNA中獲得了2個(gè)SOC1類基因，通過(guò)序列比較和生物信息學(xué)軟件分析，認(rèn)定這2個(gè)基因均屬于SOC1基因家族。這2個(gè)基因在長(zhǎng)度、核苷酸相似度和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相似度方面的差異都可佐證二者不是由同一個(gè)RNA剪接而來(lái)。

將紅掌的2個(gè)SOC1與其他物種的同源蛋白比較表明，它們均含有保守的SOC1模體（motif），系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與紅掌所處的植物學(xué)分類地位一致。本研究還分析了2個(gè)SOC1基因在紅掌不同組織部位的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)它們?cè)跔I(yíng)養(yǎng)和生殖器官中均有表達(dá)，且在花器官中的表達(dá)水平由外向內(nèi)遞減，但它們的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度不一致。至于二者在組成、表達(dá)上的異同是否會(huì)導(dǎo)致其功能差異，尚有待進(jìn)一步研究。

[1]SIMPSONGG,DEANC.Arabidopsis,the Rosetta stone offlowering time?Science,2002,296(5566):285-289.

[2]SUNG S,AMASINO R M.Vernalization and epigenetics:How plants rememberwinter.Current Opinion in Plant Biology,2004,7 (1):4-10.

[3]B?URLE I,DEAN C.The timing of developmental transitions in plants.Cell,2006,125(4):655-664.

[4]PARCY F.Flowering:A time forintegration.International Journal of Development Biology,2005,49(5/6):585-593.

[5]LEE H,SUH S S,PARK E,etal.The AGAMOUS?LIKE 20 MADS domain protein integrates floralinductive pathways in Arabidopsis. Genes and Development,2000,14(18):2366-2376.

[6]ONOUCHIH,IGE?O M I,PéRILLEUX C,et al.Mutagenesis of plants overexpressing CONSTANS demonstrates novelinteractions among Arabidopsis flowering?time genes.The Plant Cell,2000,12 (6):885-900.

[7]SAMACH A,ONOUCHI H,GOLD S E,et al.Distinct roles of CONSTANS target genes in reproductive development of Arabidopsis.Science,2000,288(5471):1613-1616.

[8]NAKAMURA T,SONG I J,FUKUDA T,et al.Characterization of TrcMADS1 gene of Trillium camtschatcense(Trilliaceae)reveals functional evolution of the SOC1/TM3?like gene family.Journal of Plant Research,2005,118(3):229-234.

[9]ZHONG XF,DAIX,XUJH,etal.Cloning and expression analysis of GmGAL1,SOC1 homolog gene in soybean.Molecular Biology Reports,2012,39(6):6967-6974.

[10]WANG S L,BERUTO M,XUE J Q,et al.Molecular cloning and potential function prediction of homologous SOC1 genes in tree peony.Plant Cell Reports,2015,34(8):1459-1471.

[11]LEIHJ,YUANHZ,LIUY,etal.Identification and characterization of FaSOC 1,a homolog of SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 from strawberry.Gene,2013,531(2):158-167.

[12]SREEKANTAN L,THOMAS M R.VvFT and VvMADS8,the grapevine homologues ofthe floralintegrators FT and SOC1,have unique expression patterns in grapevine and hasten flowering in Arabidopsis.Functional Plant Biology,2006,33(12):1129-1139.

[13]GREGIS V,SESSAA,DORCA?FORNELL C,etal.The Arabidopsis floralmeristem identity genes AP1,AGL24 and SVP directly repress class B and C floral homeotic genes.The Plant Journal,2009,60 (4):626-637.

[14]BORNER R,KAMPMANN G,CHANDLER J,et al.A MADS domain gene involved in the transition to flowering in Arabidopsis. The Plant Journal,2000,24(5):591-599.

[15]LIU C,ZHOU J,BRACHA?DRORI K,et al.Specification ofArabidopsis floral meristem identity by repression of flowering time genes.Development,2007,134(10):1901-1910.

[16]LIU C,CHEN H,ER H L,et al.Direct interaction of AGL24 and SOC1 integrates flowering signals in Arabidopsis.Development, 2008,135(8):1481-1491.

[17]IMMINK R G H,POSéD,FERRARIO S,etal.Characterization of SOC1's central role in flowering by the identification of its upstream and downstream regulators.Plant Physiology,2012,160 (1):433-449.

[18]LI D,LIU C,SHEN L S,et al.A repressor complex governs the integration of flowering signals in Arabidopsis.Developmental Cell,2008,15(1):110-120.

[19]LEE J,OH M,PARK H,et al.SOC1 translocated to the nucleus by interaction with AGL24 directly regulates LEAFY.The Plant Journal,2008,55(5):832-843.

[20]MA G Y,NING G G,ZHANG W,et al.Overexpression of Petunia SOC1?like gene FBP21 in tobacco promotes flowering without decreasing flower or fruit quantity.Plant Molecular Biology Reporter,2011,29(3):573-581.

[21]DING L H,WANG Y W,YU H.Overexpression of DOSOC1,an ortholog of Arabidopsis SOC1,promotes flowering in the orchid Dendrobium Chao Parya Smile.Plant and Cell Physiology,2013, 54(4):595-608.

[22]ZHANG X H,WEIJH,FAN S L,etal.Functionalcharacterization of GhSOC1 and GhMADS42 homologs from upland cotton (Gossypium hirsutum L.).Plant Science,2016,242:178-186.

[23]馬廣瑩,劉慧春,鄒清成,等.紅掌花發(fā)育B類基因AaPI的克隆及表達(dá)分析.分子植物育種,2014,12(5):950-955. MA G Y,LIU H C,ZOU Q C,etal.Cloning and expression analysis of B class gene AaPI from Anthurium andraeanum.Molecular Plant Breeding,2014,12(5):950-955.(in Chinese with English abstract)

[24]VOOGD C,WANG T C,VARKONYI?GASIC E.Functional and expression analyses ofkiwifruit SOC1?like genes suggestthatthey may nothave a role in the transition to flowering butmay affect the duration of dormancy.Journal of Experimental Botany,2015,66 (15):4699-4710.

[25]LIU C,ZHU C,ZENG H M.Key KdSOC1 gene expression profiles during plantlet morphogenesis under hormone,photoperiod,and droughttreatments.Genetics and Molecular Research,2016,15(1): gmr.15017579.

[26]NA X F,JIAN B,YAO WW,etal.Cloning and functionalanalysis ofthe flowering gene GmSOC 1?like,a putative SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION CO1/AGAMOUS?LIKE 20(SOC1/AGL 20) ortholog in soybean.PlantCellReports,2013,32(8):1219-1229.

[27]RUOKOLAINENS,YANPN,ALBERTVA,etal.Over?expression ofthe Gerbera hybrida At?SOC1?like1 gene Gh?SOC1 leadsto floral organ identity deterioration.Annals of Botany,2011,107(9):1491-1499.

[28]ZHAO S Z,LUO Y Z,ZHANG Z L,et al.ZmSOC1,a MADS?box transcription factor from Zea mays,promotes flowering in Arabidopsis.International Journal of Molecular Sciences,2014,15 (11):19987-20003.

[29]KIMURA Y,AOKI S,ANDO E,et al.A flowering integrator, SOC1,affects stomatal opening in Arabidopsis thaliana.Plant and Cell Physiology,2015,56(4):640-649.

[30]LIU S N,MA T F,MA L Y,et al.Ectopic expression of PvSOC1, a homolog of SOC1,from Phyllostachys violascens,promotes flowering in Arabidopsis and rice.Acta Physiologiae Plantarum, 2016,38(7):166.

Cloning,sequence and expression analysis of two SOC1 genes from Anthurium.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(3):289-297

MA Guangying1,ZHU Kaiyuan1,SHI Xiaohua1,ZOU Qingcheng1,LIU Huichun1,ZHAN Jing2,TIAN Danqing1*
(1.Flower Research and Development Center,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 311202,China;2.Hangzhou Xiaoshan Technician College of Zhejiang Province,Hangzhou 311202,China)

Anthurium;SOC1 gene;bioinformatics;expression analysis

）：馬廣瑩(http://orcid.org/0000-0002-4081-7870)，E?mail:mgyflower@163.com

2016-10-11；接受日期(Accepted)：2017-04-28

S 682.14；Q 943.2

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.10.111

國(guó)家自然科學(xué)基金（31200527）；浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(xiàng)（2016C02056-13）。

田丹青(http://orcid.org/0000-0002-8646-4206)，Tel:+86-571-82704525，E?mail:tdq0123@163.com

（