何華偉，王葉菁，趙敏健，位曙光，趙朋，蔣文超，劉莉娜，趙萍

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家蠶精氨酸激酶原核表達(dá)純化、結(jié)構(gòu)與活性分析

何華偉1，王葉菁2，趙敏健2，位曙光1，趙朋1，蔣文超1，劉莉娜1，趙萍1

1 西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715 2 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715

何華偉, 王葉菁, 趙敏健, 等. 家蠶精氨酸激酶原核表達(dá)純化、結(jié)構(gòu)與活性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1109–1123.He HW, Wang YJ, Zhao MJ, et al. Prokaryotic expression, purification and characterization of arginine kinase of Bombyx mori. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1109–1123.

精氨酸激酶(Arginine kinase，AK) 是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶，在生長發(fā)育、營養(yǎng)利用、免疫抗性、脅迫應(yīng)答等生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。家蠶精氨酸激酶BmAK與能量平衡、抗NPV病毒過程相關(guān)，但目前關(guān)于其分子結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)的研究不多?？寺×嘶騉RF序列，分析了其染色體定位、基因組結(jié)構(gòu)、mRNA結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)化分析表明AK在進(jìn)化過程中高度保守。原核表達(dá)獲得了可溶性的BmAK重組蛋白，通過Ni-NTA親和層析純化了BmAK。圓二色光譜分析顯示BmAK包含α螺旋結(jié)構(gòu)，其α螺旋結(jié)構(gòu)在pH 5–10范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。酶活分析表明BmAK的最適溫度為30 ℃，最適pH為7.5。25 ℃時(shí)BmAK的催化活性最大，在15–30 ℃范圍內(nèi)，BmAK的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，活性差別不大。BmAK的結(jié)構(gòu)在pH 7.0左右相對(duì)穩(wěn)定。這些研究為揭示BmAK的結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ)，有助于開發(fā)以AK為分子靶標(biāo)的綠色安全環(huán)保的新型殺蟲劑。

家蠶，精氨酸激酶，表達(dá)純化，結(jié)構(gòu)，活性

精氨酸激酶(Arginine kinase, AK) (EC 2.7.3.3) 是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)一種重要的磷酸原蛋白激酶。它可逆地催化ATP上的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到精氨酸上，從而形成ADP和一種具有高能鍵的儲(chǔ)能分子——磷酸精氨酸[1]。反應(yīng)方程式如下：

精氨酸+ATP·Mg磷酸精氨酸+ADP·Mg2++H+

精氨酸激酶屬于磷酸原激酶家族。磷酸原激酶催化ATP的高能磷酸基團(tuán)可逆地轉(zhuǎn)移到生物體內(nèi)天然的胍基化合物，從而在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，因此在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)能量代謝、存儲(chǔ)和利用方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。作為體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶之一，精氨酸激酶廣泛地參與了體內(nèi)的能量代謝，同時(shí)還與脅迫應(yīng)答、離子交換、免疫抗性等過程相關(guān)[4-8]。在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，精氨酸激酶的表達(dá)具有一定的時(shí)空特異性。精氨酸激酶在不同的組織中均有表達(dá)，特別是在能量需求較高的組織如腦、肌肉、神經(jīng)元、復(fù)眼或精巢等組織中高量表達(dá)[9]。除此之外，精氨酸激酶在不同組織中的表達(dá)量還受到外界因素的調(diào)控，如蛻皮激素可能參與調(diào)控家蠶精氨酸激酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致精氨酸激酶在熟蠶期表達(dá)量達(dá)到最大，在蛹期表達(dá)量下降[10]。與滯育型棉鈴蟲相比，在非滯育型棉鈴蟲腦中，精氨酸激酶具有更高的反應(yīng)活性，表明精氨酸激酶可能參與了棉鈴蟲蛹期的發(fā)育調(diào)控[11]。在煙草夜蛾中，精氨酸激酶在中腸和腹足中高量表達(dá)，可能與營養(yǎng)消化吸收和運(yùn)動(dòng)相關(guān)[12]。

由于精氨酸激酶在生命活動(dòng)過程中的重要作用，多種不同來源的精氨酸激酶基因被克隆和體外表達(dá)，其結(jié)構(gòu)和功能的研究也不斷深入。1995年，Ellington等首先克隆了美洲鱟精氨酸激酶基因，并對(duì)其序列進(jìn)行了分析[13]。隨后，Maleszka等克隆分析了蜜蜂的精氨酸激酶基因[14]。2006年，王華兵和徐豫松從家蠶中克隆了精氨酸激酶，并分析了其在不同組織和時(shí)期的表達(dá)特征[10]。之后，美洲大蠊[15]、蝗蟲[16]、凡納濱對(duì)蝦[17-18]、家蠶[19]、棉鈴蟲[9-11,20-21]、海參[22]、鋸緣青蟹[23]、煙草夜蛾[12]、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲[24]等精氨酸激酶基因相繼被克隆，并對(duì)其時(shí)空表達(dá)、結(jié)構(gòu)活性等進(jìn)行了研究。陳克平等發(fā)現(xiàn)家蠶精氨酸激酶在抗NPV的家蠶品種中高表達(dá)，推測其可能與家蠶抗NPV病毒相關(guān)[4]。

雖然家蠶精氨酸激酶的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)則知之甚少。本文從家蠶中克隆了精氨酸激酶基因，并將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)純化。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了其酶學(xué)性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)，為深入理解其分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蛋白分子量marker、硫酸卡納霉素(Kana)、T4 DNA連接酶購自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；大腸桿菌DH5α和.Transetta (DE3) 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；dNTPs、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 購自上海生工；RⅠ、d Ⅲ和Q5高保真DNA聚合酶購自New England Biolabs公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。感謝美國西南醫(yī)學(xué)中心張學(xué)武教授饋贈(zèng)表達(dá)載體pSKB2。pSKB2是基于pET-28a(+)改造的載體，將thrombin的酶切位點(diǎn)替換為prescission的酶切位點(diǎn)，其他保持不變。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB (http://silkdb.org/) 和Pubmed (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/) 分析家蠶精氨酸激酶 (BmAK) 染色體定位、基因組DNA和mRNA序列，利用Protparam (http://web.expasy.org/ protparam/)分析BmAK蛋白分子量、等電點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域，并預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。以BmAK氨基酸序列為模板進(jìn)行Blast分析，利用分子進(jìn)化軟件Mega[25]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)的cDNA序列，利用Primer Premier軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，正反向引物分別為5′-CCATGGTCGACGCCGCAACC-3′和5′-CGCCTACAGAGACTTCTCGATCTTGATGAGCT-3′，其中下劃線部分分別表示RⅠ和d Ⅲ的酶切位點(diǎn)。以5齡3天家蠶后部絲腺組織cDNA (本實(shí)驗(yàn)室提供) 為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得基因，利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。將擴(kuò)增獲得的DNA片段通過凝膠回收試劑盒純化回收，將pSKB2載體與目標(biāo)DNA片段同時(shí)進(jìn)行RⅠ和d Ⅲ雙酶切，再利用T4 DNA連接酶將二者連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，并通過菌落PCR、雙酶切和基因測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 蛋白原核表達(dá)

蛋白表達(dá)純化參考之前的方案[26-28]，此處簡述如下。選擇正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta (DE3) 細(xì)胞，首先挑取單菌落37 ℃過夜培養(yǎng)，然后接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至600約0.8–1.0，加入0.1 mmol/L IPTG在16 ℃和37 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速下分別培養(yǎng)20 h和4 h誘導(dǎo)表達(dá)，4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集菌體，加入緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10% Glycerol) 懸浮細(xì)胞，冰浴超聲破碎。破碎后的細(xì)胞于4 ℃、12 000 r/min離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳。利用考馬斯亮藍(lán)染色分析不同培養(yǎng)溫度下的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在兩種溫度下均在上清中表達(dá)，故選擇37 ℃進(jìn)行大量表達(dá)純化。

1.5 重組蛋白的純化

在37 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速下，加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h以大量表達(dá)重組BmAK蛋白。收集細(xì)胞，冰浴超聲破碎，然后在4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清。利用0.45 μm濾膜對(duì)上清過濾，然后在4 ℃下進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化，利用包含不同咪唑濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分別收集不同組分的洗脫液，進(jìn)行15% SDS-PAGE分析?？捡R斯亮藍(lán)染色后，選擇條帶單一的梯度洗脫液進(jìn)行濃縮，并利用HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 脫鹽除去咪唑，同時(shí)置換為緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5%甘油)。收集脫鹽后的蛋白溶液，濃縮后于–80 ℃凍存。

1.6 凝膠過濾分析

取凍存的重組BmAK蛋白，解凍后于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清載入Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) 凝膠層析柱進(jìn)行凝膠過濾分析，上樣體積0.5 mL，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相為緩沖液B。收集蛋白組分，進(jìn)行15% SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析。

1.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用Millipore超濾濃縮離心管將純化的BmAK蛋白置換于磷酸緩沖液PBS中，然后借助圓二色光譜儀MOS-500 (Bio-Logic，法國) 對(duì)BmAK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。測試溫度為25 ℃，波譜掃描范圍為190–250 nm，所用比色皿光程為1 mm，蛋白濃度為0.1 mg/mL，掃描速度為240 nm/min。

分別將不同pH值的緩沖溶液與純化的BmAK蛋白在室溫下孵育30 min，然后利用MOS-500進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，以不含蛋白的相應(yīng)pH緩沖溶液為空白對(duì)照。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行分析。

1.8 酶學(xué)活性檢測

BmAK的酶學(xué)活性檢測參考于振行等[29]。酶活反應(yīng)體系如下：57 mmol/L精氨酸，66 mmol/L乙酸鎂，2 mL溴百里酚藍(lán)指示劑，53.2 mg ATP鈉鹽，反應(yīng)總體積為20 mL。反應(yīng)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，并利用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5，注意避光保存。反應(yīng)溶液首先在30 ℃溫育10 min，然后取1 mL反應(yīng)液加入比色皿中，再加入10 μL純化的 1 mg/mL BmAK，利用DU 800型紫外分光光度計(jì) (BECKMAN，美國) 測定575 nm處吸光值在1 min中內(nèi)下降的數(shù)值。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，取 3次測定的平均值為BmAK的活性。

1.9 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性分析

將BmAK的酶活反應(yīng)體系分別在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃孵育10 min，然后再按照上述測活方法檢測BmAK活性。以BmAK的最高反應(yīng)活性為100%，其他溫度下活性相對(duì)最高活性作圖，從而確定BmAK的最適反應(yīng)溫度。接下來將BmAK溶液分別在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃孵育10 min，然后在最適反應(yīng)溫度下測定BmAK的活性，從而分析BmAK的熱穩(wěn)定性。

1.10 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性分析

將BmAK的酶活反應(yīng)體系分別設(shè)定為pH 6.5、6.75、7.0、7.25、7.50、7.75和8.0的緩沖溶液，其他保持不變，然后再按照上述測活方法在最適溫度下檢測BmAK活性。以BmAK的最高反應(yīng)活性為100%，其他pH下活性相對(duì)最高活性作圖，從而確定BmAK的最適反應(yīng)pH。接下來將BmAK分別在pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖溶液中孵育10 min，然后在最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH下測定BmAK的活性，從而分析BmAK的pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1基因克隆與分析

根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和PubMed數(shù)據(jù)庫，以5齡3天家蠶后部絲腺組織cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度約為1 068 bp的序列。將獲得的DNA片段與pSKB2載體通過雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化DH5α，首先通過菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，然后以RⅠ和d Ⅲ雙酶切對(duì)構(gòu)建成功的質(zhì)粒驗(yàn)證 (圖1A)，最后通過基因測序進(jìn)一步確認(rèn)克隆構(gòu)建成功。

基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)為692924，該基因定位于家蠶第5號(hào)染色體 (圖1B)。該基因全長11 377 bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成 (圖1C)。mRNA全長1 285 bp，其中包括一段編碼1 068 bp的開放閱讀編碼框 (ORF)，編碼355個(gè)氨基酸?；騧RNA的5′末端存在一段長51 bp的非翻譯區(qū)序列 (5′-UTR)，3′末端包含一段長148 bp的非翻譯區(qū)序列 (3′-UTR) 和一段由17個(gè)A組成的polyA加尾信號(hào) (圖1D)。

2006年，王華兵等利用5′ RACE法從家蠶中克隆了基因[10,30]。該基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長1 268 bp，編碼355個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為DQ272299。與本文克隆的基因相比，二者在基因結(jié)構(gòu)方面存在一定差異，但編碼的氨基酸完全相同。這種基因結(jié)構(gòu)的差異可能與家蠶的品種相關(guān)，本文采用的家蠶品種為大造，而王華兵等采用的家蠶品種為C108[10,30]。

2.2 BmAK蛋白結(jié)構(gòu)分析

Protparam分析顯示BmAK蛋白分子量約為40 kDa，等電點(diǎn)為5.87。利用在線服務(wù)器SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/) 分析發(fā)現(xiàn)BmAK蛋白包含兩個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，其中20–91位氨基酸殘基組成了ATP-胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶N末端結(jié)構(gòu)域，113–355位氨基酸殘基組成了ATP-胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域 (圖2A)。利用Pubmed分析BmAK蛋白保守的結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)BmAK屬于磷酸原激酶超家族中類精氨酸激酶家族一員，其中第62–65位、67位、193位、224位、270位、272–273位、313–314位氨基酸殘基被認(rèn)為是與精氨酸結(jié)合的保守位點(diǎn)，第121位、123位、125位、184位、220位、228位、279位、281–283位、308位、310位、312–313位、323位被認(rèn)為是與ADP結(jié)合的保守位點(diǎn)，第305–326位氨基酸殘基形成了底物特異環(huán) (圖2B)。利用PSIPRED分析BmAK蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)BmAK蛋白由2個(gè)顯著的結(jié)構(gòu)域組成，其中N末端結(jié)構(gòu)域由6段短的α螺旋結(jié)構(gòu)組成，C末端結(jié)構(gòu)域由多段α螺旋和β片層結(jié)構(gòu)組成 (圖2C–D)。

2.3 BmAK蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

將BmAK氨基酸序列通過Pubmed提交進(jìn)行BLAST分析，選取24種與BmAK序列同源的物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖3所示。進(jìn)化樹分析顯示，家蠶BmAK與同為鱗翅目的冬尺蠖蛾、小菜蛾的精氨酸激酶序列相似度最高，暗示了這些物種的精氨酸激酶具有相似的進(jìn)化起源。序列差異最大的是斑馬魚、小鼠和智人的肌酸激酶，顯示了精氨酸激酶在不同物種中的進(jìn)化差異。總體來看，精氨酸激酶在低等和高等生物中的序列相當(dāng)保守，暗示了精氨酸激酶在低等和高等生物生命活動(dòng)過程中都發(fā)揮著重要的功能。

圖1 BmAK基因的克隆和分析(A：BmAK基因克隆、菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證；B：染色體定位；C：BmAK基因組DNA示意圖；D：BmAK基因mRNA示意圖)

圖2 BmAK分析(A：結(jié)構(gòu)域預(yù)測；B：保守結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析；C：預(yù)測的BmAK二級(jí)結(jié)構(gòu)；D：預(yù)測的BmAK三級(jí)結(jié)構(gòu))

2.4 BmAK蛋白表達(dá)純化

將克隆獲得的基因與pSKB2載體連接，經(jīng)雙酶切和基因測序驗(yàn)證后，將正確構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pSKB2-轉(zhuǎn)化Transetta (DE3) 表達(dá)細(xì)胞，在16 ℃和37 ℃下，分別加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(6×His)的重組BmAK蛋白(6×His-BmAK，His6- BmAK) 表達(dá)。SDS-PAGE顯示，無論在16 ℃還是37 ℃，上清中均存在一條約為43 kDa的明顯蛋白條帶，表明成功表達(dá)了重組His6-BmAK蛋白，且目的蛋白主要以可溶性蛋白的表達(dá)形式存在于細(xì)胞裂解后的上清中，在沉淀中幾乎看不到目的蛋白的條帶 (圖4A)。因此，我們選擇在37 ℃下培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。

在37℃下，加入0.1 mmol/L IPTG大規(guī)模誘導(dǎo)重組BmAK蛋白表達(dá)，然后在4℃下通過Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，分別利用包含20–500 mmol/L咪唑濃度的緩沖溶液梯度洗脫。SDS-PAGE結(jié)果顯示，大多數(shù)洗脫組分獲得的目的蛋白純度都超過了90%，其中包含 500 mmol/L咪唑的緩沖溶液洗脫的目的蛋白純度超過了98% (圖4B)。收集包含500 mmol/L咪唑的緩沖溶液洗脫的His6-BmAK蛋白，脫鹽濃縮后凍存于–80℃。

圖3 BmAK與其他物種同源蛋白的進(jìn)化分析

圖4 BmAK表達(dá)純化(A：BmAK表達(dá)分析；B：Ni-NTA親和層析純化BmAK)

2.5 BmAK蛋白溶液存在形式分析

將純化的BmAK蛋白通過凝膠過濾層析柱分析BmAK在溶液中的存在形式，結(jié)果如圖5A所示。BmAK流經(jīng)Superdex 200 10/300 GL凝膠層析柱，顯示為一個(gè)單一銳利的對(duì)稱峰形。SDS-PAGE結(jié)果顯示，該峰代表的為重組His6-BmAK蛋白 (圖5B)。根據(jù)圖5A的洗脫體積，可以推算出重組His6-BmAK在溶液中的分子量約為43 kDa，表明重組表達(dá)的His6-BmAK蛋白在溶液中主要以單體的形式存在。

圖5 BmAK在溶液中的存在形式分析(A：凝膠過濾層析分析；B：SDS-PAGE分析洗脫物)

2.6 BmAK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過圓二色光譜法分析BmAK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，BmAK蛋白的圓二色光譜在約208 nm和222 nm處具有兩個(gè)明顯的負(fù)峰，在約192 nm處具有一個(gè)明顯的正峰 (圖6A)，表明獲得的重組BmAK蛋白含有一定的α螺旋結(jié)構(gòu)，這與之前BmAK蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果基本一致。利用軟件Biokine v4.74可以計(jì)算出BmAK中α螺旋、β折疊鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量分別約為32%、8%和60%，因此BmAK的圓二色光譜圖顯示出α螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，β折疊鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的特征峰在圓二色光譜圖中表現(xiàn)不明顯。

利用圓二色光譜法進(jìn)一步分析不同pH的緩沖溶液對(duì)BmAK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖6B所示。從圖中可以看出，隨著pH值的改變，BmAK圓二色光譜圖中α螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰發(fā)生了顯著的改變。由于β折疊鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的特征峰在BmAK的圓二色光譜圖中表現(xiàn)不明顯，因此，直接利用圓二色光譜研究pH對(duì)BmAK蛋白中β折疊鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的影響較為困難，但這并非意味著pH值的改變不會(huì)影響β折疊鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。本文以222 nm處的橢圓度值222來表征BmAK的α螺旋結(jié)構(gòu)，以222對(duì)不同的pH作圖，從而反映pH對(duì)BmAK蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的影響 (圖6C)。結(jié)果顯示，222在pH 5–10的緩沖溶液中變化不大，表明在pH 5–10的緩沖溶液中，BmAK蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)含量相對(duì)穩(wěn)定，基本不受pH變化的影響。當(dāng)pH<5時(shí)，隨著pH的下降，222值升高，指示BmAK蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)受pH影響，逐漸減少；當(dāng)pH>10時(shí)，隨著pH的升高，222值快速升高，表明在堿性條件下，進(jìn)一步升高溶液pH，誘導(dǎo)了BmAK蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)迅速減少。

2.7 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

在不同的溫度下分別檢測BmAK活性，從而測定其最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖7A所示。結(jié)果顯示，大約30 ℃時(shí)BmAK的活性最高。當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，BmAK的活性快速升高，表明溫度促進(jìn)了BmAK催化反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，BmAK的活性逐漸下降，直至80 ℃時(shí)活性降低至最高活性的約5%左右。升高溫度一方面可以加速BmAK催化反應(yīng)的進(jìn)行，另一方面也可能引起B(yǎng)mAK構(gòu)象發(fā)生變化從而導(dǎo)致活性喪失。從30 ℃升高溫度到80 ℃的過程中，高溫導(dǎo)致的失活效應(yīng)要比其促進(jìn)效應(yīng)顯著，從而導(dǎo)致了BmAK催化活性的下降。因此，BmAK的最適反應(yīng)溫度約為30 ℃。

將BmAK在不同的溫度下孵育10 min，然后在最適溫度下檢測其活性，從而分析BmAK的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7B所示。25 ℃時(shí)BmAK的活性最高，其次是20 ℃和30 ℃，分別約為最高活性的99.52%和98.96%。15 ℃時(shí)BmAK的活性約為最高活性的98.32%，5 ℃時(shí)BmAK的活性約為最高活性的87.94%，35 ℃和40 ℃時(shí)BmAK的活性約為最高活性的95%。當(dāng)溫度升高到50 ℃時(shí)，BmAK的活性迅速降至其最高活性的70%左右。在5–25 ℃溫度范圍內(nèi)，BmAK蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，逐漸升高溫度可以促進(jìn)BmAK催化反應(yīng)的進(jìn)行，因此在25 ℃時(shí)BmAK的活性達(dá)到最大值；當(dāng)溫度超過25 ℃時(shí)，進(jìn)一步升高溫度會(huì)引起B(yǎng)mAK的結(jié)構(gòu)變化，從而導(dǎo)致其活性下降?？傮w來看，在15–30 ℃的范圍內(nèi)，BmAK的活性變化不大，表明其結(jié)構(gòu)在此溫度區(qū)間相對(duì)穩(wěn)定。

2.8 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

在不同pH的溶液中分別檢測BmAK的活性，從而測定BmAK的最適反應(yīng)pH，結(jié)果如圖8A所示。pH 7.5時(shí)，BmAK的活性最高；pH 6.5時(shí)，其活性僅為最高活性的約25%。隨著pH值逐漸從6.5升高到7.5，BmAK的活性逐漸升高；當(dāng)進(jìn)一步升高pH到8.0時(shí)，BmAK的活性降至最高活性的約65%。這些結(jié)果表明，BmAK的最適反應(yīng)pH為7.5。

將BmAK在不同pH的緩沖溶液中孵育 10 min，然后在pH 7.5和30 ℃下分別檢測其活性，從而分析BmAK在不同pH下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖8B所示。在pH 7.0，BmAK具有最高的活性；pH 6.0時(shí)其活性約為最高活性的30%；隨著pH從7.0升高到8.0，BmAK的活性快速下降至其最高活性的約50%，進(jìn)一步增加pH到11.0，BmAK的活性持續(xù)下降至其最高活性的約15%。這些結(jié)果表明，pH對(duì)BmAK的結(jié)構(gòu)具有一定的影響。在pH 7.0左右，BmAK的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。

圖7 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性分析(A：BmAK的最適反應(yīng)溫度分析；B：BmAK的熱穩(wěn)定性分析)

圖8 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性分析(A：BmAK的最適反應(yīng)pH分析；B：BmAK的pH穩(wěn)定性分析)

3 討論

精氨酸激酶是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)一類重要的磷酸原激酶，在能量代謝、貯藏和利用方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。AK在不同的組織中均有表達(dá)，但在能量需求較高的組織中表達(dá)尤其顯 著[10-14,31-32]。昆蟲是自然界種類和數(shù)量最多的無脊椎動(dòng)物，具有重要的經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究價(jià)值。AK是參與昆蟲能量代謝的關(guān)鍵酶。除參與昆蟲肌肉能量供應(yīng)，AK還與昆蟲的發(fā)育、繁殖、運(yùn)動(dòng)、免疫和抗性等密切有關(guān)。當(dāng)前，AK的研究主要集中在貝類、蝦、螃蟹、海參等動(dòng)物和錐體蟲、線蟲等寄生蟲。昆蟲AK的研究主要圍繞其cDNA序列特征[10]、時(shí)空表達(dá)特征[9-10,12-14,21-29,31]、生長發(fā)育調(diào)控[11]、免疫應(yīng)答[4,8,15]和環(huán)境適應(yīng)[33]等問題，關(guān)于其分子結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)則很少涉 及[24,34-35]。

本研究從5齡3天家蠶后部絲腺組織中克隆獲得了ORF序列，分析了基因的染色體定位、基因組DNA結(jié)構(gòu)、mRNA結(jié)構(gòu)及其蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。BmAK包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，ATP-胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶N末端結(jié)構(gòu)域和ATP-胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，其中N末端結(jié)構(gòu)域由6段短α螺旋結(jié)構(gòu)組成，ATP-胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域由多股α螺旋結(jié)構(gòu)包裹的β片層結(jié)構(gòu)組成。BmAK具有精氨酸激酶共有的活性中心序列CPTNLGT及關(guān)鍵的D61和R192殘基[36-37]，與其他昆蟲AK的氨基酸序列高度相似，與脊椎動(dòng)物肌酸激酶的序列也具有較高的同源性，暗示了它們?cè)隗w內(nèi)可能對(duì)能量代謝具有相似的調(diào)控功能。

原核表達(dá)分析顯示，BmAK主要在上清中以可溶性蛋白的形式表達(dá)，暗示了其可能折疊形成了正確的空間結(jié)構(gòu)。酶分子折疊形成正確的空間構(gòu)象對(duì)于其催化活性至關(guān)重要。酶學(xué)活性檢測顯示重組表達(dá)的BmAK具有良好的催化活性。凝膠過濾層析分析揭示了重組表達(dá)的BmAK在溶液中以單體結(jié)構(gòu)的形式存在，這與大多數(shù)昆蟲AK的結(jié)構(gòu)一致[38]。圓二色光譜分析表明，BmAK蛋白包含有α螺旋結(jié)構(gòu)，證實(shí)了之前生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果，同時(shí)也表明重組表達(dá)的BmAK可以折疊形成正確的空間構(gòu)象。BmAK酶活的最適溫度為30 ℃，最適pH為7.5，這與家蠶最適飼育溫度22–28 ℃基本一致。在15–30 ℃范圍內(nèi)，BmAK的活性變化不大 (圖7B)，表明在此溫度區(qū)間BmAK的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定；同時(shí)，作為家蠶體內(nèi)與能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶，BmAK的酶學(xué)活性可能不會(huì)影響家蠶在15–30 ℃范圍內(nèi)的生命活動(dòng)。對(duì)比pH對(duì)BmAK二級(jí)結(jié)構(gòu) (圖6B) 和酶學(xué)活性 (圖8B) 的影響，可以發(fā)現(xiàn)在pH 5–10范圍內(nèi)BmAK的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生顯著的改變，但BmAK的酶學(xué)活性則改變了很多，表明在酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變之前，其活性中心的構(gòu)象已經(jīng)發(fā)生了顯著的變化，這與鄒承魯先生之前提出的著名論斷“酶活性部位構(gòu)象變化發(fā)生在整體構(gòu)象變化之前”一致[39]。

根據(jù)蛋白分子量和結(jié)構(gòu)，精氨酸激酶一般被分為3類：單亞基、雙亞基和四亞基[22]。昆蟲AK多屬于單亞基精氨酸激酶，海參AK屬于雙亞基精氨酸激酶。海參AK的N末端序列和W218、W208殘基對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶學(xué)活性具有至關(guān)重要的作用[40]。金屬離子對(duì)AK的催化反應(yīng)非常關(guān)鍵，不同的離子種類對(duì)不同物種的AK作用機(jī)制也不相同。Mn2+和Mg2+對(duì)蝗蟲AK[16]和龍蝦AK[41]的酶活具有激活效應(yīng)，而Zn2+和Cu2+則對(duì)蝗蟲AK的酶活具有抑制作 用[16]。Mn2+和Cu2+可以完全抑制凡納濱對(duì)蝦AK的酶活。這些發(fā)現(xiàn)表明盡管精氨酸激酶在進(jìn)化過程中氨基酸序列高度保守，但不同的生活環(huán)境可能也對(duì)不同物種來源的AK蛋白結(jié)構(gòu)和酶學(xué)活性產(chǎn)生一定的影響。

本研究克隆了家蠶基因，并成功獲得了可溶的、具有酶學(xué)活性的BmAK蛋白，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)開展了初步的研究，為深入研究其活性位點(diǎn)構(gòu)象、關(guān)鍵氨基酸殘基、激活劑和抑制劑等建立了基礎(chǔ)。AK是無脊椎動(dòng)物包括鱗翅目昆蟲特有的能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶。多數(shù)的農(nóng)林害蟲屬于鱗翅目昆蟲。家蠶是鱗翅目昆蟲研究的模式動(dòng)物。因此，深入研究BmAK的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)，有助于揭示AK在鱗翅目昆蟲體內(nèi)的生理功能和調(diào)控機(jī)制，從而在此基礎(chǔ)上篩選AK酶活性抑制劑，開發(fā)以AK為害蟲防控分子靶標(biāo)的綠色安全環(huán)保的新型殺蟲劑。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Prokaryotic expression, purification and characterization of arginine kinase of

Huawei He1, Yejing Wang2, Minjian Zhao2, Shuguang Wei1, Peng Zhao1, Wenchao Jiang1, Li’na Liu1, and Ping Zhao1

1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China 2 College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Arginine kinase (AK) is a key enzyme in energy metabolism of invertebrates and plays an important regulatory role in the life activities such as growth and development, nutrition utilization, immune resistance and stress response. Arginine kinase of(BmAK) is related to the energy balance and anti-NPV process, but there is little research on its molecular structure and enzymatic properties. We cloned the ORF sequence ofgene, and analyzed chromosomal localization, genomic structure, mRNA structure, secondary and tertiary structure. Phylogenetic analysis indicated that AK was highly conserved in evolution. Soluble recombinant BmAK was obtained by prokaryotic expression, and purified by Ni-NTA affinity chromatography. The circular dichroism spectroscopy showed that BmAK contained α-helix structures, and its α-helix structures were relatively stable in the pH range between 5 and 10. Enzyme activity analysis showed that the optimum temperature of BmAK was 30 ℃ and the optimum pH of BmAK was 7.5. The optimal temperature of BmAK was 25 ℃. Between 15 ℃ and 30 ℃, the structure and activity of BmAK was relatively stable. The structure of BmAK was relatively stable at pH 7.0. Our findings reveal the structure and function of BmAK to develop novel green safe and environmentally friendly insecticides.

, arginine kinase, expression and purification, structure, activity

January 5, 2017; Accepted:April 27, 2017

Yejing Wang. Tel: +86-23-68251575; E-mail: yjwang@swu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402139, 31572465), State Key Program of National Natural Science of China (No. 31530071), Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2013A019), Start-up Grant from Southwest University (No. SWU112111).

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31402139, 31572465)，國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 31530071)，重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項(xiàng)(Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(No. XDJK2013A019)，西南大學(xué)博士基金(No. SWU112111) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-05-17

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170517.1450.002.html