劉美麗，羅硯曦，趙錚蓉，閻輝

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基于抗性恢復(fù)的高效克隆超短片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建

劉美麗，羅硯曦，趙錚蓉，閻輝

浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 浙江 杭州 310013

劉美麗, 羅硯曦, 趙錚蓉, 等. 基于抗性恢復(fù)的高效克隆超短片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1190–1197.Liu ML, Luo YX, Zhao ZR, et al. Cloning short gene fragment and constructing recombinant plasmid based on restoration of antibiotic resistance. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1190–1197.

分子克隆作為一種常規(guī)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于DNA及蛋白質(zhì)的研究。在傳統(tǒng)的分子克隆中，主要通過限制性內(nèi)切酶先分別消化目的DNA片段及載體，再純化回收，然后用DNA連接酶將二者連接。而對一些超短基因片段 (<300 bp)，通過酶切及切膠純化后，回收率極低，導(dǎo)致插入表達(dá)載體比較困難。文中介紹了一種新的利用質(zhì)粒抗性恢復(fù)進(jìn)行克隆的方法，大大提高了克隆效率，為短基因片段的分子克隆提供了一種高效的方法。

分子克隆，構(gòu)建，短基因片段

分子克隆技術(shù)是分子生物學(xué)和基因工程研究中的一種常用技術(shù)[1]。隨著基因工程的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新技術(shù)的應(yīng)用，如GATEWAY系統(tǒng)[2-4]、In-fusion系統(tǒng)[5-7]、尿嘧啶DNA糖基化酶 (Uracil-DNA glycosylase，UDG)[8-10]以及連接非依賴克隆 (Ligation-independent cloning，LIC)[11-13]等。但這些新技術(shù)要么所需酶類價(jià)格昂貴 (如GATEWAY系統(tǒng)，In-fusion系統(tǒng))，要么應(yīng)用條件苛刻 (如LIC，需要在重疊區(qū)段缺少某個(gè)特定核苷酸[11,14])，無法廣泛應(yīng)用，因而傳統(tǒng)的酶切、連接方法仍然是分子克隆中使用最廣泛的方法。

盡管傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)改進(jìn)了很多，有的已轉(zhuǎn)化為商品化的克隆試劑盒，如T載體克隆[15-16]、重組融合PCR[17-19]和TOPO克隆技術(shù)[20]等，但對于將超長或超短 (<300 bp) 目的基因片段插入表達(dá)載體仍然比較困難，尤其是后者。造成超短片段難以克隆的主要原因是，超短DNA片段經(jīng)過必需的末端酶切處理和切膠純化后，通常損失殆盡，難以回收足夠量的末端修飾的DNA片段與載體連接。并且，由于插入片段很短，故重組體與空載體“背景”分子量幾乎相同，導(dǎo)致重組體的鑒別很困難。

本研究在構(gòu)建人β-防御素-2 (human β-defensin 2，HBD2) 表達(dá)載體的過程中，探索出一種基于抗性恢復(fù)的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方法，比較圓滿地解決了上述難題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和宿主菌

真核載體pCB，宿主菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。T4 DNA連接酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司。實(shí)驗(yàn)中所使用的限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。DNA純化回收試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人β-防御素-2 (HBD2) 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)人β-防御素-2 (HBD2) 的基因序列(GenBank登錄號AF040153.1)，采用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)一對PCR引物 (表1)，由上海生工合成。以含人工合成HBD2基因片段的質(zhì)粒pMD-HBD2 (另文報(bào)告) 為模板，用上述引物及酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA純化回收試劑盒回收約200 bp的HBD2目的片段。

表1 PCR引物序列與預(yù)期產(chǎn)物長度

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將真核載體pCB用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，37 ℃反應(yīng)3 h后，取酶切產(chǎn)物電泳，在顯像儀下觀察，得兩條目的條帶，其中1.7 kb片段的兩端分別包含pCB質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因 (Ap-r) 的半側(cè)及多克隆位點(diǎn)，而3.2 kb片段則包含Ap-r抗性基因的另外半側(cè)及質(zhì)粒骨架 (圖6)，然后用DNA純化回收試劑盒分別回收上述DNA片段。

將HBD2與1.7 kb的純化產(chǎn)物等摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接。連接條件：25 ℃ 60 min，60 ℃ 10 min。

以上述連接產(chǎn)物為模板，用酶和引物Amp-Sc及HBD2-Bm (表1) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.9 kb的片段。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。

用Ⅰ酶將回收的1.9 kb片段及之前的3.2 kb片段分別進(jìn)行酶切，37 ℃反應(yīng)3 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。將二者回收的片段等摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接，連接條件：25 ℃ 60 min，60 ℃ 10 min。

將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，接種于含氨芐青霉素 (Amp) 的LB培養(yǎng)板，過夜后挑菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，選取其中1個(gè)陽性菌落提取質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒測序

構(gòu)建好的質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 PCB-HBD2轉(zhuǎn)染后的表達(dá)

重組質(zhì)粒根據(jù)說明書與脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后加入野生型痘苗病毒感染2 h，然后加入含2%新生牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，在–80 ℃/37 ℃反復(fù)凍融3次，離心取上清，得到重組病毒。載體質(zhì)粒作為陰性對照進(jìn)行相同處理。用病毒RNA抽提純化試劑盒提取病毒RNA，對其進(jìn)行RT-PCR鑒定。

根據(jù)TaKaRa公司PrimeScriptTMRT resgent Kit試劑盒操作說明書合成cDNA，以cDNA為模板，以HBD2-Bm和Spe-HBD2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 HBD2的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，可看到在200 bp附近有一特異性的DNA條帶，與預(yù)期目的條帶196 bp相符(圖1)。

2.2 酶切載體

將真核載體pCB用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，在約1.7 kb和3.2 kb處有特異性條帶 (圖2)。

圖1 HBD2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 pCB質(zhì)粒雙酶切凝膠電泳結(jié)果

2.3 構(gòu)建融合片段

將上述純化后的HBD2 PCR產(chǎn)物與pCB酶切后1.7 kb片段連接，并以連接產(chǎn)物為模板，以HBD2-Bm、Amp-Sc為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.9 kb片段 (圖3)。

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鑒定

用Ⅰ將回收的1.9 kb片段及之前的3.2 kb片段分別進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，接種于含Amp的LB培養(yǎng)板，過夜后挑菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果見圖4，有6個(gè)陽性菌落，選其中1個(gè)測序鑒定。

圖3 HBD2與1.7kb融合片段

圖4 菌液PCR鑒定結(jié)果

2.5 重組質(zhì)粒測序鑒定

重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)過比對，目的片段與人β-防御素-2 (HBD2,GenBank登錄號AF040153.1) 完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建 成功。

2.6 RT-PCR結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染感染后得到的產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR鑒定，在200 bp左右出現(xiàn)條帶 (圖5)，與預(yù)期相符。

圖5 RT-PCR鑒定結(jié)果

3 討論

本文介紹了一種新的利用質(zhì)?？剐曰謴?fù)進(jìn)行克隆的方法，實(shí)驗(yàn)流程如圖6所示。

真核載體PCB具有氨芐青霉素抗性基因 (Ap-r)，而Ap-r片段中包含Ⅰ單酶切位點(diǎn)，因此設(shè)計(jì)PCR引物Amp-Sc，涵蓋Ap-r的Ⅰ識別位點(diǎn)。再用Ⅰ和載體多克隆位點(diǎn) (MCS) 中的平端酶Ⅰ雙酶切載體，產(chǎn)生含載體骨架的3.2 kb大片段和另外一條約1.7 kb的小片段，二者分別帶有Ap-r基因的半側(cè)，將這兩個(gè)載體片段切膠純化備用。接著將1.7 kb的小片段與酶擴(kuò)增的HBD2用T4 DNA連接酶連接，然后以此連接產(chǎn)物為模板，用涵蓋Ap-r的Ⅰ識別位點(diǎn)的引物Amp-Sc和HBD2的上游引物HBD2-Bm進(jìn)行PCR，即可成功將短片段HBD2融合進(jìn)載體小片段。最后，將此融合片段用Ⅰ酶切后，與載體大片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，篩選Ap-r陽性菌落即可得到所需克隆。

圖6 基于質(zhì)粒抗性恢復(fù)的克隆方法圖解

由于Ⅰ和Ⅰ均為平端酶，用這兩個(gè)酶雙酶切處理的片段為平末端，所以兩個(gè)平末端片段連接后，理論上連接方向正確的幾率為50%，但在本方法中，不用擔(dān)心克隆連接方向錯(cuò)誤的另外50%可能性，因?yàn)檫B接方向錯(cuò)誤的克隆將導(dǎo)致Ap-r抗性基因的完整性缺損，致使連接產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化細(xì)菌后喪失Ap-r抗性，轉(zhuǎn)化菌在含Amp抗生素的LB平板上不能生長，藉此原理強(qiáng)力淘汰錯(cuò)誤克隆。從原理上說，本方法可達(dá)成“零背景”克隆的效率，但實(shí)驗(yàn)中仍發(fā)現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)化菌不含預(yù)期的重組體但在Amp抗生素的LB平板上也能生長 (圖4，泳道4和5)，其原因尚不明，但不排除酶切處理質(zhì)粒載體母體不完全導(dǎo)致Ap-r抗性基因“污染”的可能性。

將超長或超短基因片段插入表達(dá)載體是分子克隆技術(shù)中的難點(diǎn)，尤其是后者。楊艷等[21]曾利用抗性恢復(fù)的策略克隆染色體上大片段DNA (48 kb)，但對于超短片段的克隆卻鮮有報(bào)道。防御素是一類小分子抗菌多肽，廣泛存在于昆蟲、植物和動物體內(nèi)，其中人β-防御素-2 (Human β-defensin 2，HBD2) 是人體中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)性防御素，它具有抗微生物[22-23]、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)[24-25]等廣泛生物活性，在基因治療和重組疫苗等領(lǐng)域具有重要用途。

但是由于HBD2是僅有192 bp的短基因片段，用常規(guī)的“酶切處理后切膠純化”的方法，回收的目的片段量非常少，克隆效率極低。因此在本研究中我們采用了上述基于抗性恢復(fù)的克隆方法：由于載體的大、小片段各含有氨芐青霉素抗性基因 (Ap-r) 的半側(cè)，只有連接方向正確的質(zhì)粒，才能恢復(fù)Ap-r抗性。

和傳統(tǒng)方法相比，“基于抗性恢復(fù)”的克隆方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1) 高效性：短基因片段通過PCR與載體片段的一部分融合，大大提高了插入載體的效率；2) 通用性：任何克隆困難的短基因片段，都可用該方法克隆進(jìn)任何具有Amp篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，為短基因片段的克隆提供了一種有效方法；3) 價(jià)格低廉：不需要任何商品化的克隆試劑盒，也不需要價(jià)格昂貴的酶，在提高效率的前提下并未增加成本，具有良好的應(yīng)用前景。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Cloning short gene fragment and constructing recombinant plasmid based on restoration of antibiotic resistance

Meili Liu, Yanxi Luo, Zhengrong Zhao, and Hui Yan

Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, Zhejiang, China

Molecular cloning is one of the most important and widely used technologies in molecular biology research. Generally, the target DNA fragment and the vector are separately digested by restriction enzyme, then purified and recovered, and then ligated with DNA-ligase. For some very short gene fragments (<300 bp), the recovery efficiency of the purified fragment is very low after digestion and cleavage, leading to the difficulty in its inserting into the expression vector. To address this issue, we developed a cloning method based on restoration of antibiotic resistance in constructing recombinant plasmid, which proved highly efficient in cloning very short gene fragments.

molecular cloning,plasmid construction, short gene fragment

January 17, 2017; Accepted:May 10, 2017

Hui Yan. Tel: +86-571-88215439; E-mail: jipei2006@163.com

Supported by:Zhejiang Province medical and health research projects (No. 2014KYA041).

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目 (No. 2014KYA041) 資助。