杜 飛 賀 剛 陳代剛 楊華軍

(貴州省遵義市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

燈盞花素對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道重塑的影響※

杜 飛 賀 剛 陳代剛 楊華軍

(貴州省遵義市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

目的 觀察燈盞花素對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠氣道重塑的影響，探討燈盞花素防治COPD模型大鼠氣道重塑的機制。方法 將48只雄性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、燈盞花素組，每組16只，模型組、燈盞花素組采用熏煙加氣管內(nèi)滴入內(nèi)毒素脂多糖的方法建立大鼠COPD模型，燈盞花素組予燈盞花素灌胃，空白組及模型組給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。3組分別于給藥第7、28 d各處死8只大鼠，行肺組織病理學觀察，測定支氣管厚度及支氣管膠原纖維厚度，用免疫組化法測定肺組織中基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、轉化生長因子β(TGF-β)蛋白陽性表達面積比率，用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法測定肺組織中Smad 3和Smad 7 mRNA水平。結果 與空白組比較，模型組及燈盞花素組第7、28 d大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，燈盞花素組第7、28 d大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度均下降(P<0.05，P<0.01)。燈盞花素組內(nèi)7 d與28 d比較，支氣管壁厚度無明顯差異，28 d時支氣管膠原纖維厚度下降(P<0.05)。與空白組比較，模型組第7、28 d大鼠肺組織MMP-9、TGF-β表達增強，Smad 3 mRNA水平升高(P<0.01)，Smad 7 mRNA水平降低(P<0.01)；燈盞花素組第7 d肺組織MMP-9、TGF-β表達增強(P<0.05)，Smad 3 mRNA水平升高(P<0.01)，Smad 7 mRNA水平降低(P<0.01)。與模型組比較，燈盞花素組第28 d大鼠肺組織MMP-9、TGF-β表達減少(P<0.01，P<0.05)，Smad 3 mRNA水平降低(P<0.01)，Smad 7 mRNA水平升高(P<0.01)。燈盞花素組內(nèi)7 d與28 d比較，28 d時大鼠肺組織MMP-9、TGF-β及Smad 3 mRNA水平降低(P<0.05)，Smad 7 mRNA水平升高(P<0.05)。結論 燈盞花素可抑制COPD模型大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度的增加，降低COPD大鼠肺組織中的MMP-9、TGF-β及Smad 3 mRNA水平，升高Smad 7 mRNA水平，從而可以延緩或改善COPD氣道重塑的疾病進程。

燈盞細辛；肺疾病,阻塞性；氣管；大鼠,Wistar；模型,動物

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，嚴重影響患者的生命質量，病死率較高，給患者及其家庭以及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。我國對7個地區(qū)20 245名成年人進行調查，結果顯示40歲以上人群中COPD的患病率高達8.2%[1]，預計2030年COPD將成為全球第3位主要死亡原因[2]。對COPD目前尚無根治的措施，臨床上以對癥治療、改善癥狀和延長生存期為主，但其療效并不滿意，且不能阻止最終的氣道重塑。只有控制或逆轉其氣道重塑，才可能得到真正意義上的控制。燈盞花素在治療COPD方面的作用尤其引人注目。本研究探討燈盞花素對COPD模型大鼠氣道重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48只健康雄性Wistar大鼠，SPF級，標準飼養(yǎng)，自由飲水，日常光照。

1.2 試劑與儀器 燈盞花素購于昆明龍津藥業(yè)股份有限公司(國藥準字Z53020667，批號20050701)；脂多糖(美國Sigma)用0.9%氯化鈉注射液配制成200 μg/200 μL的溶液；香煙(焦油量15 mg，煙氣煙堿量1.5 mg)；轉化生長因子β1(TGF-β1)檢測試劑盒(美國GIBCO公司)；LightCycler 2.0實時熒光定量PCR儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；Trizol RNA提取試劑(Invitmgen公司)；M-MLV逆轉錄酶(Promega公司)；SYBR Green I RT-PCR試劑盒(Roche公司)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組及造模 將48只健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組，正常對照組(空白組)、COPD模型組(模型組)、COPD模型燈盞花素治療組(燈盞花素組)，每組16只。其中模型組、燈盞花素組采用顧延會等[3]熏煙加氣管內(nèi)滴入內(nèi)毒素脂多糖的方法復制建立大鼠COPD模型。第1、15 d氣管內(nèi)注入0.2 mL脂多糖溶液，第2～28 d(第15 d除外)關在自制熏煙箱內(nèi)被動吸煙2次，每次30 min×12支煙，中間間隔2 h呼吸正常空氣。空白組及造模后模型組大鼠正常喂養(yǎng)，燈盞花素組造模后予燈盞花素[10 mg/(kg·d)]灌胃，空白組、模型組每日予等容積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.3.2 制備病理切片 分別于第7、28 d每組取8只大鼠處死，迅速開胸摘取肺臟，洗凈稱質量，其后于10%甲醛固定液內(nèi)清洗，浸泡30 min，投入40%甲醛溶液中固定備用。病理切片制備由遵義醫(yī)學院病理教研室提供技術支持，取固定好的組織，選取大鼠肺臟左葉，在最大橫徑處切2 mm厚的組織塊，常規(guī)脫水，二甲苯透明，用自動石蠟包埋機包埋，切成5 μm厚的切片，做蘇木精-伊紅(HE)染色、Van Gieson染色。

1.3.3 檢測指標

1.3.3.1 支氣管壁厚度及膠原纖維厚度 每張切片隨機選取3個視野，用光學顯微鏡觀察，以SPOT Ⅱ數(shù)碼相機(美國DIAGNGSTIC公司)攝像，采用Img-Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)分析支氣管肺組織結構的形態(tài)學的變化，測量支氣管壁厚度及支氣管壁膠原纖維厚度。

1.3.3.2 肺組織基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、轉化生長因子β(TGF-β)表達 用免疫組織化法(SP)測定(按試劑盒說明操作)。每例在光學顯微鏡下隨機選擇3個視野，用圖像分析軟件系統(tǒng)(美國Universallmagtng Corporation)計算陽性細胞面積比率。

1.3.3.3 肺組織Smad 3 mRNA與Smad 7 mRNA的表達 采用實時熒光定量PCR法檢測(嚴格按試劑盒說明書操作)?？俁NA的提?。喝∮曳谓M織100 mg，按照Trizol試劑說明，紫外分光光度計檢測所提RNA含量和純度?；パa脫氧核糖核酸(cDNA)的合成：分別另取3 μg總RNA為模板，在加入逆轉錄酶后以25 μL體系下，在42 ℃條件下反應1 h合成cDNA第一鏈，再在94 ℃下加熱3 min以滅活逆轉錄酶。實時定量PCR擴增：采用熒光染料技術，在20 μL反應體系中，加入cDNA 2 μL，ddH2O 13 μL，RT-PCR Mix 4 μL，引物1 μL。Smad 3上游引物5′-AAATGACAGCAGCAGGGACAC-3′，下游引物5′-GAGGTAGGACCCACAGTAGAGC-3′，擴增產(chǎn)物172 bp；Smad 7上游引物5′-TGGTGCGTGGTGGCATACT-3′，下游引物5′-CAGCCGATCTTGCTCCTCA-3′，擴增產(chǎn)物176 bp。用β-actin基因作為內(nèi)參，β-actin上游引物5′-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，下游引物5′-CTCTGTGTGGATTGGTGGCTCTAT-3′，擴增產(chǎn)物170 bp。擴增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認是否符合設計片段長度。PCR反應及數(shù)據(jù)采集在LightCycler 2.2系統(tǒng)上進行，記錄其循環(huán)閾值(Ct)，每個樣品中靶基因的相對mRNA表達采用相對定量公式2-△Ct計算，其中△Ct值=靶基因Ct值-β-actin Ct值。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況的觀察 空白組大鼠毛發(fā)光亮，活潑好動，呼吸平穩(wěn)，進食良好，無特殊不良表現(xiàn)。模型組、燈盞花素組大鼠造模開始的第1 d可見明顯的咳嗽，撓鼻現(xiàn)象，少動，在造模煙熏過程中可見拱背蜷臥、頻繁咳嗽、呼吸急促、口鼻潮濕等表現(xiàn)，在不吸煙時可見毛發(fā)光澤較差，飲水量明顯增加，咳嗽頻率減少，部分大鼠可見反應遲鈍、行動遲緩，可聞及哮鳴音。燈盞花素組大鼠經(jīng)燈盞花素治療后，咳嗽、呼吸急促、行動遲緩及哮鳴音等癥狀明顯減輕。

2.2 各組大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度比較見表1。各組大鼠肺組織光鏡下病理改變見圖1。

A 空白組第28 d B 模型組第28 d C 燈盞花素組第28 d
圖1 各組大鼠肺組織光鏡下病理改變(HE，×400)

由圖1可見，空白組第28 d，肺組織無明顯病理學改變；模型組第28 d，肺組織出現(xiàn)肺泡炎癥，大量膠原纖維形成，肺泡結構紊亂；燈盞花素組第28 d，肺泡炎癥明顯減輕，膠原纖維明顯減少，肺泡結構紊亂較模型組明顯好轉。

表1 各組大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度比較 像素

與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與本組第7 d比較，#P<0.05

由表1可見，與空白組比較，模型組及燈盞花素組第7、28 d大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，燈盞花素組第7、28 d大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度均下降(P<0.05，P<0.01)。燈盞花素組內(nèi)7 d與28 d比較，支氣管壁厚度無明顯差異，28 d時支氣管膠原纖維厚度下降(P<0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織MMP-9、TGF-β、Smad 3 mRNA及Smad 7 mRNA表達比較 見表2。

表2 各組大鼠肺組織MMP-9、TGF-β、Smad 3 mRNA及Smad 7 mRNA表達比較

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與本組第7 d比較，#P<0.05

由表2可見，與空白組比較，模型組第7、28 d大鼠肺組織MMP-9、TGF-β表達增強，Smad 3 mRNA水平升高(P<0.01)，Smad 7 mRNA水平降低(P<0.01)；燈盞花素組第7 d肺組織MMP-9、TGF-β表達增強(P<0.05)，Smad 3 mRNA水平升高(P<0.01)，Smad 7 mRNA水平降低(P<0.01)。與模型組比較，燈盞花素組第28 d大鼠肺組織MMP-9、TGF-β表達減少(P<0.01，P<0.05)，Smad 3 mRNA水平降低(P<0.01)，Smad 7 mRNA水平升高(P<0.01)。燈盞花素組內(nèi)7 d與28 d比較，28 d時大鼠肺組織MMP-9、TGF-β及Smad 3 mRNA水平降低(P<0.05)，Smad 7 mRNA水平升高(P<0.05)。

3 討 論

COPD是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，其氣流受限多呈進行性發(fā)展，與氣管和肺組織對煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎癥反應增強有關[1]。COPD主要病理特點之一是氣道重塑。采用中醫(yī)中藥的方法，是我國在COPD治療上獨特的優(yōu)勢。燈盞花素是從彝族藥燈盞花(又名燈盞細辛)中提取的主要成分，其有效成分為二咖啡?？鼘幩?、焦炔康酸、原二茶酸等黃酮類化合物。近年來許多學者研究證實燈盞花素對COPD有一定的治療作用。田川等[4]研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素能在一定程度上抑制大鼠氣道黏液高分泌，其作用是通過抑制蛋白激酶C活性而實現(xiàn)。柴文戍等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素能減慢肺間質纖維化的進程，可降低TGF-β1和透明質酸含量，對肺間質纖維化有一定的保護作用。彭志文等[7]研究發(fā)現(xiàn)應用燈盞花素注射液治療COPD急性加重期(AECOPD)并發(fā)呼吸衰竭的患者，發(fā)現(xiàn)其對病情的控制及轉歸起重要作用，其可改善患者血液流變學和肺功能，提高AECOPD的治療效果。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素治療AECOPD有較好的臨床療效[8]。細胞外基質(ECM)過度沉積是氣道重塑的主要原因，活化的成纖維細胞促進膠原沉積可導致以膠原為主的ECM過度沉積，繼而其基底膜增厚、氣道平滑肌增生和肥厚，管腔纖維化，而這種變化導致小氣道的纖維化[9]。TGF-β1可促進細胞外基質的合成與沉積[10]，也是促進纖維細胞激活向肌成纖維細胞轉化的關鍵因子[11]。研究表明TGF-β1通過誘導纖維母細胞增生、膠原纖維及細胞外基質合成增多等多種機制參與氣道重塑和不可逆的阻塞[12]，據(jù)此說明肺組織結構破壞與TGF-β1表達有一定的相關性，所以抑制TGF可改善ECM的沉積。COPD氣道重塑機制中，MMP-9是引起COPD的相關蛋白水解酶，TGF-β是對肺纖維化起關鍵作用的生長調節(jié)細胞因子，而TGF-β信號轉導通路中的主要信號蛋白Smad 3的mRNA及其抑制性信號蛋白Smad 7的mRNA的水平變化決定著TGF-β的生物效應。MMP-9是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中的重要成員，主要生理功能是降解ECM成分。MMPs增多可促使肺泡壁基底膜降解及肺氣腫形成，其通過自分泌又可促進成纖維細胞和平滑肌增殖。有研究通過將COPD患者與健康吸煙者進行比較，發(fā)現(xiàn)COPD患者肺泡巨噬細胞釋放大量活性增高的MMP-9，促使氣道破壞及重塑增加，并引起第1 s用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)進行性下降，尤以AECOPD患者更明顯[13-14]。

本研究通過燈盞花素對COPD模型大鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)燈盞花素可抑制COPD大鼠支氣管壁厚度及膠原纖維厚度的增加，降低COPD大鼠肺組織中的MMP-9、TGF-β及Smad 3 mRNA水平，升高Smad 7 mRNA水平，從而可以延緩或改善COPD氣道重塑的疾病進程。說明應用燈盞花素可抑制COPD氣道重塑，延緩或改善疾病進程。

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(本文編輯：李珊珊)

Effects of Breviscapine on airway remodeling in rats with chronic obstructive pulmonary disease model

DUFei,HEGang,CHENDaigang,etal.

DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstPeople'sHospitalinZunYiCity,GuizhouProvince,GuiZhou,ZunYi563000

Objective To observe the effects of breviscapine on airway remodeling in rat with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) model, and to explore the mechanism of breviscapine on preventing airway remodeling in rats with COPD model. Methods 48 male Wistar rats were randomly divided into blank group, model group and breviscapine group, 16 rats in each group.The rat model of COPD was established by cigarette smoking combined with intratracheal instillation of lipopolysaccharide(LPS) in model group and breviscapine group. Breviscapine group was treated by breviscapine for gavage, and the blank group was treated by equal volume of 0.9% sodium chloride injection. 8 rats were executed at the 7thd and 28thd after administration in each group. The pathology observation in lung tissue was conducted, and the thickness of bronchi and bronchial collagen fibers were measured. The positive expression area ratio of matrix metalloproteinases 9 (MMP-9) and transforming growth factor β (TGF-β) in lung tissue were detected by immunohistochemical method, and the Smad 3 mRNA and Smad 7 mRNA were detected by real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR). Results Compared with blank group, the thickness of bronchi wall and bronchial collagen fibers at the 7thd and 28thd significantly increased in model group and breviscapine group (P<0.01). Compared with model group, the thickness of bronchi wall and bronchial collagen fibers at the 7thd and 28thd reduced in breviscapine group (P<0.05,P<0.01). There was no statistical difference on the thickness of bronchi wall between the 7thd and 28thd in breviscapine group, and the thickness of bronchial collagen fibers at 28thd reduced (P<0.05). Compared with blank group, the expression of MMP-9 and TGF-β in lung tissue at the 7thd and 28thd increased in model group,and Smad 3 mRNA increased (P<0.01), Smad 7 mRNA decreased (P<0.01), and the expression of MMP-9 and TGF-β of lung tissue at the 7thd increased in breviscapine group(P<0.05), Smad 3 mRNA increased (P<0.01), Smad 7 mRNA decreased (P<0.01). Compared with model group, the expression of MMP-9 and TGF-β in lung tissue at the 28thd decreased in breviscapine group (P<0.01,P<0.05), Smad 3 mRNA decreased (P<0.01), Smad 7 mRNA increased (P<0.01). The expression of MMP-9 and TGF-β in lung tissue and Smad 3 mRNA at the 28thd were lower than that at the 7thd in breviscapine group (P<0.05), and Smad 7 mRNA higher (P<0.05). Conclusion Breviscapine can inhibit the increase of the thickness of bronchial wall and collagen fibers in COPD model rats, decrease the MMP-9, TGF-β and Smad 3 mRNA in lung tissue, and increase Smad 7 mRNA, thus can delay or improve the disease process of COPD airway remodeling.

Erigeron breviscapus; Lung disease; Obstructive; Trachea; Rat, Wistar; Model; Animal

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.07.027

※ 項目來源：貴州省遵義市科技計劃課題(編號：遵市科合社字(2014)11號)

杜飛(1980—)，男，副主任醫(yī)師，碩士。從事慢性阻塞性肺疾病的基礎與臨床研究。

R563；R285.5

A

1002-2619(2017)07-1069-05

2017-01-10)