李潛 張彩喬 侯麗媛 張衛(wèi)婷

·綜述·

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程控制對(duì)糖蛋白藥物糖基化影響的研究進(jìn)展

李潛 張彩喬 侯麗媛 張衛(wèi)婷

在生物制藥行業(yè), 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng), 尤其是主要是用于生產(chǎn)糖蛋白藥物的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛。蛋白質(zhì)糖基化可以影響工業(yè)化糖蛋白藥物的活性, 因此糖基化是重組糖蛋白藥物的重要質(zhì)量屬性。糖蛋白藥物糖基化水平的穩(wěn)定性尤其需要關(guān)注, 碳水化合物結(jié)構(gòu)將會(huì)決定的分子類(lèi)型。最佳的糖蛋白藥物就是擁有治療效果或者篩選出同類(lèi)的糖蛋白。通過(guò)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件, 如改變細(xì)胞株, 培養(yǎng)基成分和過(guò)程控制等影響因素。生產(chǎn)融合蛋白或者單克隆抗體的生物過(guò)程變量和糖蛋白藥物質(zhì)量有著錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系, 糖基化程度的優(yōu)化將會(huì)提高產(chǎn)品功效。本文重點(diǎn)討論在工業(yè)化生產(chǎn)中通過(guò)過(guò)程控制提升糖基化水平, 并依此了解如何控制糖蛋白藥物糖基化水平。

生物工藝；哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)；蛋白糖基化；糖蛋白藥物；蛋白質(zhì)量

蛋白糖基化對(duì)于蛋白療效及糖蛋白的生產(chǎn)至關(guān)重要。商業(yè)化生產(chǎn)糖蛋白藥物首選哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng), 因其具有天然蛋白加工機(jī)制, 包括蛋白糖基化, 這樣就與天然的蛋白十分接近, 并保證治療效果。蛋白質(zhì)糖基化的形成主要是由寡糖連接到天冬酰胺的側(cè)鏈(N-連接)或者連接到絲氨酸/蘇氨酸(O-連接)。多糖會(huì)影響糖蛋白藥物活性, 同時(shí)也會(huì)并決定該糖蛋白藥物在體內(nèi)的半衰期［1］。正是因?yàn)槠涮攸c(diǎn), 糖蛋白藥物糖型需要滿(mǎn)足藥品監(jiān)管部門(mén)的要求規(guī)范, 以確保其有效性和安全性。

1 蛋白糖基化控制

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程控制中會(huì)影響蛋白糖基化的變量匯總。見(jiàn)表1。本文重點(diǎn)對(duì)細(xì)胞系、培養(yǎng)模式、生產(chǎn)工藝、細(xì)胞培養(yǎng)基這幾方面對(duì)糖基化蛋白藥物的糖基化影響研究進(jìn)行總結(jié)。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程控制中會(huì)影響蛋白糖基化的變量匯總

1.1 細(xì)胞系 在設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)療法中, 了解一個(gè)細(xì)胞系可以影響糖基化水平十分關(guān)鍵。主要用于商業(yè)化生產(chǎn)糖基化治療蛋白的細(xì)胞系是CHO細(xì)胞, 還有少部分使用SP2/0, 人纖維肉瘤中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(亞系克隆)(HT-1080), 人類(lèi)淋巴母細(xì)胞, 小鼠骨髓瘤(NS0)細(xì)胞。有報(bào)道表明CHO懸浮細(xì)胞表達(dá)人β-干擾素與微載體貼壁CHO細(xì)胞表達(dá)的干擾素具有相同的糖型［2］。在同樣組織分離的細(xì)胞的表達(dá)功能性酶種類(lèi)也是多樣化的, 從而表達(dá)糖基化蛋白的能力也不同。CHO細(xì)胞中CHO-K1和DUKX-B11都含有未激活的α(1, 3) GalT基因同樣都有低水平的NGNA。CHO細(xì)胞生產(chǎn)糖蛋白藥物是最普遍, 其他細(xì)胞系, 如人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞(HEK), 小倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK), NS0和人類(lèi)視網(wǎng)膜衍生細(xì)胞(PERC 6)都是正在開(kāi)發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞株［3,4］。

1.2 培養(yǎng)模式 常見(jiàn)的三種細(xì)胞培養(yǎng)方式是批式, 分批補(bǔ)料培養(yǎng), 灌流培養(yǎng)。據(jù)報(bào)道不同的培養(yǎng)方式會(huì)明顯的影響糖基化類(lèi)型。CHO DG44細(xì)胞系產(chǎn)生的受體蛋白分泌堿性磷酸酶的糖基化蛋白特性與未擴(kuò)增的細(xì)胞系在不同的培養(yǎng)模式下進(jìn)行比較, 比較的培養(yǎng)模式包括批式培養(yǎng), 分批補(bǔ)料培養(yǎng),半連續(xù)灌流培養(yǎng)。在擴(kuò)大化生產(chǎn)的細(xì)胞系表達(dá)的糖基化蛋白糖型中甘露聚糖較少, 同時(shí)整體的唾液酸化也較少, 但兩者的差異≤10%。在灌流培養(yǎng)模式下糖基化總體水平較分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式下培養(yǎng)的唾液酸化有所增加?？傮w來(lái)說(shuō), 連續(xù)灌流培養(yǎng)模式糖基化程度較批式培養(yǎng)模式有所提高, 在與批式培養(yǎng)模式下細(xì)胞增長(zhǎng)速度快條件, 灌流培養(yǎng)模式下細(xì)胞生長(zhǎng)速度越慢糖基化程度越高。對(duì)于采用灌流培養(yǎng)或者批式培養(yǎng),哪種更經(jīng)濟(jì)還需要由糖基化蛋白自身的情況決定。

1.3 生產(chǎn)工藝 細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)的EPO-Fc糖基化蛋白的生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程的影響顯著［5］。在pH為7.0時(shí), 唾液酸比例最大可到13, 若pH升高或降低其比例會(huì)減小。同樣, 培養(yǎng)溫度從37℃降至30℃, 唾液酸比例也會(huì)由14%降至8%。生物反應(yīng)器培養(yǎng)pH對(duì)糖基化蛋白的影響已經(jīng)進(jìn)行了研究。雜交細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體培養(yǎng)基的pH對(duì)半乳糖苷化和唾液酸化作用有影響。在表達(dá)EPO時(shí)最優(yōu)的pH范圍為6.8～7.2時(shí), 降低培養(yǎng)基pH, EPO的酸性帶會(huì)增加［6］。

溶氧水平認(rèn)為是在哺乳細(xì)胞培養(yǎng)工藝中持續(xù)監(jiān)測(cè)的指標(biāo), 其會(huì)影響蛋白糖基化。在反應(yīng)器中氧不足會(huì)產(chǎn)生對(duì)蛋白糖基化產(chǎn)生復(fù)雜的影響。例如, 溶氧的變化對(duì)于在CHO細(xì)胞表達(dá)tPA糖基化蛋白影響較小, 但是溶氧很小的改變會(huì)對(duì)CHO產(chǎn)生促卵泡激素(FSH)糖基化作用產(chǎn)生明顯影響。

銨離子是細(xì)胞代謝廢物, 主要是因?yàn)楣劝滨０泛吞於０反x產(chǎn)生的銨離子, 其在培養(yǎng)基中積累一般會(huì)對(duì)細(xì)胞有毒性。氯化銨會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)pH降低, 導(dǎo)致最終糖基化發(fā)生在高爾基復(fù)合體的酸性區(qū)域, 增加細(xì)胞內(nèi)pH可能與最終唾液酸化作用的減少有關(guān)系。

降低溫度可以延長(zhǎng)細(xì)胞活力, 從而提高所有蛋白表達(dá),原則上也可以增加糖基化。細(xì)胞活力是十分重要的因素, 因?yàn)榘馓腔缚梢栽谂囵B(yǎng)基中積累逐步將單糖從聚糖上移除。在生物反應(yīng)器中溫度的改變可以提高單位體積表達(dá)蛋白的活性, 同時(shí)可維持糖型質(zhì)量［7］。相比之下, 當(dāng)溫度降低到33℃和30℃, EPO-Fc唾液酸化作用分別減少20%和40%［8］。降低溫度到30℃, 顯示了提高產(chǎn)量和降低唾液酸化作用的相關(guān)性。目前仍然無(wú)法解釋對(duì)高生產(chǎn)能力和高表達(dá)量是否正相關(guān)。高細(xì)胞活力(低唾液酸酶活性)與高細(xì)胞產(chǎn)量相關(guān)(更短的滯留時(shí)間)可能會(huì)降低整體唾液酸化作用影響。

生物反應(yīng)器剪切力是一個(gè)非常重要的工程學(xué)變量, 可影響糖型特征。通過(guò)改變攪拌速度和剪切力, 發(fā)現(xiàn)最大的破壞性剪切力水平必須要達(dá)到tPA 天冬酰胺184位點(diǎn)最小程度的占用, 原因是剪切力減少了tPA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的停留時(shí)間。在工藝放大或者現(xiàn)有工藝轉(zhuǎn)移過(guò)程中剪切力是需要重點(diǎn)考慮的, 監(jiān)測(cè)剪切力對(duì)蛋白糖基化不同表型的影響(例如從灌流培養(yǎng)到批式培養(yǎng)), 同樣是產(chǎn)品一致性非常重要的保證。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)基 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基基本上由50～100種化學(xué)限定性的物質(zhì)組成, 同時(shí)還有少數(shù)不確定物質(zhì)這些物質(zhì)有時(shí)作為補(bǔ)料。這些不確定的物質(zhì)包括蛋白胨、酵母抽提物、植物水解物和血清。已有文獻(xiàn)報(bào)道一些不確定物質(zhì)在糖基化蛋白中的影響。目前, 血清和動(dòng)物來(lái)源物質(zhì)因其不確定性和安全性風(fēng)險(xiǎn), 不推薦在生物制藥工業(yè)中使用。

已明確的培養(yǎng)基成分如葡萄糖, 谷氨酰胺, 半乳糖都在糖基化控制中起了擔(dān)任了十分重要角色。葡萄糖限量的CHO細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)表達(dá)無(wú)糖基化的IFN-γ是可以的。CHO批式培養(yǎng)生產(chǎn)IFN-γ發(fā)現(xiàn)在低于0.1 mmol/L的谷氨酰胺和0.7 mmol/L的葡萄糖條件下, 可以降低唾液酸化作用類(lèi)型和增加高甘露糖型的雜合聚糖。相比之下, 在低葡萄糖和谷氨酰胺濃度的條件下, 連續(xù)培養(yǎng)和非營(yíng)養(yǎng)限制性培養(yǎng)模式下對(duì)比, BHK-21細(xì)胞表達(dá)人IgG-IL2融合蛋白時(shí)顯示出在寡糖型的不同的。半乳糖的流加可以幫助促進(jìn)形成更多半乳糖化的N-聚糖型。

通常, 培養(yǎng)基中小分子會(huì)引起細(xì)胞行為改變, 例如高特異性的表達(dá)。研究表明丁酸鈉可以提高產(chǎn)量, 同時(shí)可以降低細(xì)胞生長(zhǎng)速度通過(guò)上調(diào)細(xì)胞凋亡作用和調(diào)節(jié)唾液酸化作用［9］。丁酸鈉在基因和蛋白表達(dá)水平方面的多效性影響, 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中已經(jīng)報(bào)道多次［10］。

氨基酸添加量對(duì)哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)和表達(dá)目的蛋白十分重要, 但是特定的濃度會(huì)導(dǎo)致糖基化類(lèi)型的改變。添加額外的氨基酸(半胱氨酸, 異亮氨酸, 亮氨酸, 色氨酸, 纈氨酸, 天冬酰胺, 天冬氨酸和谷氨酸)這些在早期培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)耗盡,導(dǎo)致rhEPO中低唾液酸化部分增加。

2 討論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺(tái), 在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起到了極為重要的作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊, 提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能, 因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。

本文重點(diǎn)對(duì)在細(xì)胞系、生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)模式和培養(yǎng)基對(duì)糖蛋白藥物糖基化的影響進(jìn)行討論并總結(jié), 目的為持續(xù)生產(chǎn)出穩(wěn)定、一致的糖蛋白藥物提供理論支持。糖基化的控制更多的是基于工藝控制和細(xì)胞生理代謝控制。通過(guò)總結(jié)過(guò)去的研究結(jié)果了解細(xì)胞代謝途徑, 希望最終可以控制蛋白糖基化。未來(lái)目標(biāo)是通過(guò)前期的基礎(chǔ)研究, 將新技術(shù)、新細(xì)胞系表達(dá)蛋白的糖基化水平做到可控并獲得滿(mǎn)足要求的糖蛋白, 真正的達(dá)到質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)的要求。

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2017-03-16］

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