丁曉亞，鄒建中，王 琦，文 靜，馬大釗

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

包覆全氟戊烷的介孔氧化硅微球增效高強度聚焦超聲表面消融離體牛肝

丁曉亞，鄒建中*，王 琦，文 靜，馬大釗

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

目的 探討包覆全氟戊烷的介孔氧化硅微球(MSNC-PFP)對HIFU表面消融離體牛肝的影響。方法 根據(jù)MSNC-PFP的濃度將50塊離體牛肝平均分為5組：對照組(MSNC-PFP濃度為0)、0.25 mg/ml組、0.50 mg/ml組、1.00 mg/ml組、2.00 mg/ml組。超聲引導(dǎo)沿消融線路徑多點注射增效劑(即MSNC-PFP)。通過HIFU線性掃描，以凝固性壞死束組合成面，6個面組合成體，對體腔內(nèi)區(qū)域不直接消融。觀察消融中聲像圖的改變。以TTC染色肉眼觀察壞死范圍，HE染色光鏡下觀察壞死程度。測量各組消融體積并評價消融效果，評價指標(biāo)包括靶區(qū)覆蓋指數(shù)(CI)、靶外體積指數(shù)(EI)、能效因子(EEF)。結(jié)果 當(dāng)MSNC-PFP濃度在1.00 mg/ml以上時，聲像上為團狀強回聲，3～5 min后消退；MSNC-PFP濃度越高，HIFU輻照區(qū)域的灰度值改變越大。0.50、1.00、2.00 mg/ml組總消融體積高于對照組，EEF值低于對照組(P均<0.01)。1.00、2.00 mg/ml組的CI及EI值均高于其余各組(P均<0.05)。肉眼觀察凝固性壞死區(qū)表現(xiàn)為灰白色，未壞死區(qū)則表現(xiàn)為紅色。光鏡下見當(dāng)MSNC-PFP濃度≥0.50 mg/ml時，形成的凝固性壞死帶完整。結(jié)論 采用MSNC-PFP可增大HIFU表面消融離體牛肝的消融體積，減低EEF，從而提高輻照效率。

全氟戊烷的介孔氧化硅微球；高強度聚焦超聲消融術(shù)；離體；牛；肝

由于高強度聚焦超聲(high-intensity focused ultrasound， HIFU)消融時間長、投放能量高，引發(fā)并發(fā)癥的風(fēng)險較大等諸多因素的影響，在肝臟較大腫瘤消融中的應(yīng)用受到一定限制[1]。HIFU為表面消融方式，即在靶區(qū)的周邊進行適形消融，形成完整的凝固性壞死帶包裹消融區(qū)，阻斷內(nèi)部血供使其自然壞死，達到降低消融劑量和縮減消融時間的目的[2]。為形成完整且有足夠厚度的壞死帶，在消融中形成和促進內(nèi)部組織的直接壞死[3-4]。本研究利用包覆全氟戊烷的介孔氧化硅微球(permeating perfluoropentane drops-encapsulated mesoporous silica nanocapsules, MSNC-PFP)對HIFU的增效作用[5-6]，將增效劑與表面消融方法相結(jié)合進行離體牛肝實驗，以評價消融效果。

1 材料與方法

1.1實驗材料與分組 新鮮離體牛肝，切為 100 mm×100 mm×70 mm的長方塊，以真空旋片脫氣泵脫氣40 min后復(fù)溫，備用。50塊離體牛肝隨機分為5組，每組各10塊。MSNC-PFP由上海硅酸鹽研究所配制，直徑200 nm，沸點29℃。

1.2方法 HIFU消融及超聲監(jiān)測均采用海扶刀?JC200型聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)(重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司)，治療頭直徑220 mm，焦距 140 mm，工作頻率1.0 MHz；系統(tǒng)自帶灰度測量軟件及不規(guī)則物體體積測量軟件。HIFU消融后，進行肉眼及光鏡下組織學(xué)觀察。

1.2.1 增效劑注射 在超聲監(jiān)測及引導(dǎo)下，選定消融區(qū)域。沿HIFU線性消融路徑，逐一位點注射MSNC-PFP，位點間距10 mm，每個位點注射劑量為20 μl。對5組離體牛肝其中1組(對照組)MSNC-PFP濃度為0，其余4組注射MSNC-PFP濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml。

1.2.2 消融方法 增效劑注射結(jié)束后即刻進行HIFU消融。選定深度為40、35、29、22、14 mm的5個層面，以遞減(240、220、200、160、140 W)的功率逐層消融。線性掃描速度為5 mm/s，計劃消融范圍為 41 mm×41 mm×32 mm，頂層和底層為11條消融線組成的面，相鄰兩條線間隔4 mm，中間層面以4條線狀壞死束組成消融框，消融間隔時間為10 s，相鄰層面間隔時間為6 min，以防止持續(xù)HIFU輻照造成消融區(qū)溫度過高而引起大面積熱壞死。

1.2.3 消融體積測量及評價指標(biāo) HIFU輻照后，沿z軸方向薄層切開靶體，每層厚約3 mm。行TTC染色，肉眼觀察剖面凝固性壞死情況。如壞死形態(tài)規(guī)則，則采用游標(biāo)卡尺測量并計算各組薄層切開后每一層離體牛肝的消融面積，計算該層面的消融體積：消融體積=消融面積×層厚，各層面消融體積相加獲得總消融體積；如發(fā)現(xiàn)壞死體積不規(guī)則，則采用HIFU消融系統(tǒng)自帶的不規(guī)則物體體積測量軟件進行壞死區(qū)域勾畫及體積測量，獲得總消融體積。計算消融框外體積：消融框外體積=總消融體積-計劃消融體積。

評價指標(biāo)包括：靶區(qū)覆蓋指數(shù)(coverage index, CI)[7]，CI=總消融體積/計劃消融體積×100%，用于判斷總體消融率；靶外體積指數(shù)(external volume index, EI)[8]，EI=消融框外體積/計劃消融體積×100%，用于評價消融的適形性；能效因子(energy efficiency factor, EEF)[9]，EEF(J/mm3)=P×T/V，其中P表示聲功率(W)，T表示治療時間(s)，V表示總消融體積(mm3)，用于判斷應(yīng)用增效劑對HIFU消融離體牛肝組織難易程度的影響，EEF越低則越易于消融。

1.2.4 組織學(xué)觀察 對沿z軸方向薄層(層厚3 mm)切開的離體肝組織分別取輻照區(qū)中心及輻照區(qū)邊界組織切片，HE染色后于光鏡下觀察壞死程度。

圖1 超聲引導(dǎo)下多點注射MSNC-PFP聲像圖 A～D.依次為注射進離體牛肝內(nèi)即刻(A)、1 min(B)、2 min(C)、3 min(D)超聲表現(xiàn)

組別總凝固性壞死體積(cm3)EEF值CI值EI值2.00mg/ml組44.59±1.511.27±0.0374.26±2.1517.25±2.311.00mg/ml組37.39±0.941.64±0.0965.88±1.3612.62±2.670.50mg/ml組32.59±1.312.02±0.0860.55±1.815.08±1.260.25mg/ml組29.73±0.442.28±0.0557.98±2.53-1.26±2.73對照組28.41±0.892.56±0.0857.11±1.59-2.86±0.37F值103.48240.9967.4187.10P值<0.001<0.001<0.001<0.001

2 結(jié)果

2.1聲像圖表現(xiàn) 新鮮離體牛肝脫氣后為均勻等回聲，當(dāng)MSNC-PFP濃度在1.00 mg/ml以上時，表現(xiàn)為強回聲團，3～5 min回聲消退，見圖1。HIFU線性消融時，焦點處出現(xiàn)條狀強回聲帶，MSNC-PFP濃度越高，灰度值變化越大，見圖2。

圖2 不同濃度MSNC-PFP對HIFU表面消融模式中灰度值的影響

2.2消融體積及評價指標(biāo)比較 各組總消融體積、CI、EI及EEF值見表1。表面消融模式下，以濃度為0.50、1.00、2.00 mg/ml的MSNC-PFP協(xié)同HIFU

線性掃描，可增大凝固性壞死體積，減小所需的EEF值，0.50、1.00、2.00 mg/ml組與對照組間總消融體積、EEF值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。MSNC-PFP濃度0.25 mg/ml組的EEF值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MSNC-PFP濃度1.00、2.00 mg/ml組，其CI及EI值均高于其余各組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3肉眼觀察 各組均可見凝固性壞死帶(圖3)，凝固性壞死區(qū)為灰白色，未壞死區(qū)牛肝則表現(xiàn)為紅色。對照組及MSNC-PFP濃度0.25 mg/ml組的凝固性壞死帶融合較差，其余各組凝固性壞死帶均融合，壞死帶間無組織殘留。MSNC-PFP濃度1.00 mg/ml組及2.00 mg/ml組可見內(nèi)部未消融區(qū)及框外熱損傷，牛肝失去正常的紅色，其中以2.00 mg/ml組熱損傷最為嚴(yán)重。

2.4鏡下觀察 各組消融區(qū)凝固性壞死均表現(xiàn)為細胞形態(tài)消失，核溶解，呈碎片狀紅染物；對照組、MSNC-PFP濃度0.25 mg/ml組及0.50 mg/ml組消融區(qū)與周邊組織分界清晰(圖4A)，對照組及 0.25 mg/ml組未融合凝固性壞死帶間細胞連續(xù)性消失，染色質(zhì)邊集，部分核固縮、溶解(圖4B)， 0.50 mg/ml組凝固性壞死帶連續(xù)。MSNC-PFP濃度 1.00 mg/ml組及2.00 mg/ml組消融區(qū)邊界分界不清，周邊未消融區(qū)組織受熱損傷，細胞核固縮，細胞溶解，胞內(nèi)可見空泡(圖4C)。

圖3 大體標(biāo)本 A～E.分別為對照組(A)、MSNC-PFP濃度0.25 mg/ml組(B)、0.50 mg/ml組(C)、1.00 mg/ml組(D)、2.00 mg/ml組(E)牛肝組織頂層凝固性壞死帶; F～J.分別為對照組(F)、MSNC-PFP濃度0.25 mg/ml組(G)、0.50 mg/ml組(H)、1.00 mg/ml組(I)、2.00 mg/ml組(J)中間層面凝固性壞死框

圖4 HE染色組織學(xué)檢查(HE，×200) A.0.50 mg/ml組凝固性壞死帶與周邊分界清晰； B.對照組凝固性壞死帶間可見殘留細胞； C.2.00 mg/ml組內(nèi)部未消融區(qū)組織熱損傷，細胞核固縮、溶解，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡

3 討論

目前可用于HIFU增效的納米材料主要為有機、無機及有機無機雜化體系。有機材料主要通過脂質(zhì)體、微乳液、高分子材料等包覆液態(tài)氟碳化合物制成納米乳劑，在HIFU激發(fā)下產(chǎn)生微泡，可提高HIFU熱消融腫瘤的體積[10]。但有機材料穩(wěn)定性差，HIFU輻照中結(jié)構(gòu)易塌陷，難以實現(xiàn)持續(xù)增效的效果[11]。無機材料主要以介孔氧化硅為載體，其穩(wěn)定性好，以真空裝載液態(tài)氟碳類化合物，在HIFU焦點區(qū)形成穩(wěn)定的氣泡以進行超聲診療[12]。本實驗將MSNC-PFP多點注射入消融區(qū)域，發(fā)現(xiàn)濃度達1.00 mg/ml以上時，超聲回聲增強，可持續(xù)3～5 min，彌散的MSNC-PFP仍具有增效HIFU消融的效果，輻照區(qū)出現(xiàn)明顯的回聲信號，提示介孔硅類HIFU增效劑在長時間的輻照過程中響應(yīng)時間更長。

本實驗發(fā)現(xiàn)MSNC-PFP的濃度可影響HIFU表面消融結(jié)果，濃度越高，凝固性壞死體積越大、壞死越徹底，輻照區(qū)周邊熱損傷越嚴(yán)重。分析其原因可能為：①MSNC-PFP濃度越高，對聲吸收能力越強，在總能量相同的HIFU輻照下，可產(chǎn)生更強的生物學(xué)效應(yīng)；②MSNC-PFP增強了HIFU的熱效應(yīng)[13]；③消融線的先后排列可引起熱擴散和聲學(xué)特性的改變，有助于聲能沉積。本實驗中，為避免持續(xù)輻照產(chǎn)生的持續(xù)溫度升高，在消融中給予層間隔6 min的散熱時間以控制消融結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對照組形成的凝固性壞死帶融合欠佳，而給予增效劑的各組其融合較完整，可形成完整的凝固性壞死帶。分析原因為增效劑改變組織固有聲學(xué)性質(zhì)后，可產(chǎn)生更強的熱效應(yīng)，促進線性壞死帶的融合，最終形成完整的殼式壞死帶包裹內(nèi)部未消融區(qū)，從而提高HIFU表面消融的有效性。

HIFU表面消融的關(guān)鍵是形成完整且有足夠厚度的凝固性壞死帶，促進腫瘤內(nèi)部的自然消亡轉(zhuǎn)歸。消融層間隔時間是影響消融效果的主要因素：如間隔時間過短，消融中累積的熱會向內(nèi)部未消融區(qū)和外周擴散，造成損傷形態(tài)不規(guī)則，降低安全性。因此本實驗采用6 min作為安全的間隔時間，降低功率后，可見對照組及0.25 mg/ml組的凝固性壞死帶分界清晰，內(nèi)部未消融區(qū)組織結(jié)構(gòu)完好，提高MSNC-PFP濃度后，凝固性壞死帶連續(xù)，與周邊組織分界不清，內(nèi)部未輻照區(qū)組織出現(xiàn)熱損傷，核固縮，部分溶解消失，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡等。肝臟是富含血供的臟器，HIFU能量沉積較困難，如消融區(qū)貫穿血管，血流直接帶走大部分熱量，難以形成凝固性壞死。因此，為確保該模式的有效性，對血供豐富、能量較難沉積的消融靶區(qū)仍需使用增效劑以達到消融效果。

本實驗通過多點注射MSNC-PFP的方式探討其濃度對HIFU表面消融的影響。但離體組織中增效劑的分散較局限，而活體中增效劑分布范圍更復(fù)雜，還有待進一步探討。

[1] Yu T, Luo J. Adverse events of extracorporeal ultrasound-guided high intensity focused ultrasound therapy. Plos One, 2010,6(12):2053-2056.

[2] 卜銳,鄒建中,銀麗,等.應(yīng)用高強度聚焦超聲表面層三維消融模式消融離體牛肝組織.中國介入影像與治療學(xué),2012,9(12):881-884.

[3] Bu R, Yin L, Yang H, et al. Tissue ablation accelerated by peripheral scanning mode with high-intensity focused ultrasound: A study on isolated porcine liver perfusion. Ultrasound Med Biol, 2013,39(8):1410-1419.

[4] 銀麗,鄒建中,伍烽,等.高強度聚焦超聲殼式輻照的不同線間隔時間對離體牛肝組織的影響.中國介入影像與治療學(xué),2012,9(10):748-751.

[5] 易良波,王琦,王智彪,等.對比觀察SonoVue與包裹全氟戊烷的介孔二氧化硅納米微球在蛋清體模中的高強度聚焦超聲增效作用.中國介入影像與治療學(xué),2014，11(2):103-106.

[6] Chen Y, Chen HR, Shi JL. Construction of homogenous/heterogeneous hollow mesoporous silica nanostructures by silica-etching chemistry: Principles, synthesis, and applications. Acc Chem Res, 2013,47(1):125-137.

[7] Puri A. Leibel and Phillips textbook of radiation oncology. 3rd ed. Int J Radiat Oncol Biol Physic, 2011,79(4):1276.

[8] Liu HL, Lin WL, Chen YY. A fast and conformal heating scheme for producing large thermal lesions using a 2D ultrasound phased array. Int J Hyperthermia, 2007,23(1):69-82.

[9] 李發(fā)琪,杜永洪,王智彪,等.HIFU體外塊“切除”動物肝臟、腎臟和肌肉的劑量研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(4):252-255.

[10] Zhou Y, Wang Z, Chen Y, et al. Microbubbles from gas-generating perfluorohexane nanoemulsions for targeted temperature-sensitive ultrasonography and synergistic HIFU ablation of tumors. Adv Mater, 2013,25(30):4123.

[11] 王志剛,冉海濤,鄭元義,等.超聲分子影像學(xué).北京:科學(xué)出版社,2016:596-600.

[12] Wang X, Chen H, Zheng Y, et al. Au-nanoparticle coated mesoporous silica nanocapsule-based multifunctional platform for ultrasound mediated imaging, cytoclasis and tumor ablation. Biomaterials, 2013,34(8):2057-2068.

[13] 錢祖文.高強聚焦超聲(HIFU)加熱活體組織中的溫度分布.應(yīng)用聲學(xué),2010,29(4):269-272.

Permeating perfluoropentane drops-encapsulated mesoporous silica nanocapsules collaborative high-intensity focused ultrasound surface ablation of bovine liver in vitro

DINGXiaoya，ZOUJianzhong*,WANGQi,WENJing,MADazhao

(StateKeyLaboratoryofUltrasoundEngineeringinMedicineCo-FoundedbyChongqingandtheMinistryofScienceandTechnology,ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundinMedicalandBiomedicalEngineering,ChongqingCollaborativeInnovationCenterforMinimally-InvasiveandNoninvasiveMedicine,CollegeofBiomedicalEngineering,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To discusse the influence of permeating perfluoropentane drops-encapsulated mesoporous silica nanocapsules (MSNC-PFP) on HIFU surface ablation in vitro bovine liver. Methods Fifity bovine-liver tissues were divided into 5 groups: Control group, 0.25 mg/ml group, 0.50 mg/ml group, 1.00 mg/ml group, 2.00 mg/ml group according to the concentration of MSNC-PFP. The synergistic agent was injected along the ablation line path under the guiding of ultrasound. The surface ablation model was structured by 6 coagulation necrosis side by using HIFU linear scanning, inner region without melting, and the ultrasonographic changes were observed in the melt area. The coagulation necrosis range was assessed by TTC staining, and necrosis degree was observed by HE staining. The coagulation necrosis volume was measured, the coverage index (CI), external volume index (EI), energy efficiency factor (EEF) were used to evaluate the ablation effect in each group. Results The MSNC-PFP more than 1.00 mg/ml was shown as strong echo in ultrasonic image, fade after 3—5 min. The grey value was changed in HIFU ablation area related to the concentration of MSNC-PFP. The total ablation volume of 0.50 mg/ml group, 1.00 mg/ml group, 2.00 mg/ml group were more than control group, the EEF was lower than that of the control group (allP<0.01). The CI and EI of 1.00 mg/ml group and 2.00 mg/ml group were higher than those of the other group (allP<0.01). The coagulation necrosis became complete when the concentration of MSNC-PFP above 0.50 mg/ml. Conclusion MSNC-PFP can increase the volume of coagulation necrosis, decrease the EEF and increase the efficiency of HIFU surface ablation of bovine liver in vitro.

Perfluoropentane drops-encapsulated mesoporous silica nanocapsules; High-intensity focused ultrasound ablation; In vitro; Bovine; Liver

國家自然科學(xué)基金(11574039、11274404)、國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2011CB707900)、國家重大科學(xué)儀器設(shè)備研制專項(2013YQ03062906)、重慶市研究生科研創(chuàng)新項目(CYS14106)。

丁曉亞(1991—)，男，重慶人，在讀碩士。研究方向：超聲醫(yī)學(xué)。E-mail: 569629602@qq.com

鄒建中，重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，400016。E-mail: zoujzh@cqmu.edu.cn

2016-11-29

2017-04-20

R-332; R445.1

A

1672-8475(2017)07-0439-05

10.13929/j.1672-8475.201611033