易 蓓， 袁海汀， 許永會， 羅 綦， 曾沉思， 陳建斌

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，重慶 400016)

NF-κB抑制劑PDTC對人骨髓瘤U266細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

易 蓓， 袁海汀， 許永會， 羅 綦， 曾沉思， 陳建斌△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，重慶 400016)

目的： 探討NF-κB特異性抑制劑PDTC對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。方法: 采用不同濃度PDTC (25、50、100和200 μmol/L)處理U266細(xì)胞，CCK-8法和活細(xì)胞計數(shù)檢測U266細(xì)胞的增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期；RT-qPCR及Western blot檢測PDTC處理前后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1) mRNA和蛋白的表達(dá)；Western blot檢測NF-κB (P65)、DNMT1、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平。結(jié)果: PDTC處理U266細(xì)胞48 h后，NF-κB (P65)的蛋白水平被抑制；PDTC抑制U266細(xì)胞增殖，作用呈濃度及時間依賴性；PDTC作用48 h后，與對照組比較，細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性增高(P<0.05)，細(xì)胞被阻滯在G2期；DNMT1的mRNA及蛋白水平均降低；Western blot結(jié)果顯示PDTC可通過抑制NF-κB下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，使cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平增加。結(jié)論: PDTC抑制NF-κB信號通路，通過誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制DNMT1的表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期和啟動凋亡途徑有關(guān)。

NF-κB； PDTC； 多發(fā)性骨髓瘤； 細(xì)胞凋亡； DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞異常增殖的惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的13%，全世界每年大約86 000的新增病例[1]。近年由于新型藥物的應(yīng)用及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展使得該病得到極大緩解，但復(fù)發(fā)和耐藥問題仍未得到有效解決[2]，積極尋求新的藥物及治療手段仍是一項重大課題。

NF-κB是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控多種基因從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、參與炎癥反應(yīng)過程、調(diào)控細(xì)胞周期、參與腫瘤的發(fā)生及耐藥等[3]。研究顯示，NF-κB與血液系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)，在髄系白血病、淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤中均有高活性[4-7]。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一種金屬螯合物，分子量為164.29 kD，具有抗氧化作用，是NF-κB信號通路特異性抑制劑。本研究采用PDTC抑制NF-κB，觀察其對MM U266細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探究PDTC對U266細(xì)胞增殖的抑制作用及可能的相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

人骨髓瘤U266細(xì)胞由第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院侯建教授惠贈。將PDTC(Sigma)用PBS配成10 mmol/L的儲存液，使用前稀釋成不同濃度的工作液；RPMI-1640和二甲基亞砜(Sigma)；胎牛血清(Gibco)；細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑盒(凱基生物)；CCK-8試劑盒、蛋白提取試劑盒和BCA測蛋白濃度試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；引物合成、Trizol reagent和逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(TaKaRa)；抗β-actin抗體和抗DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)抗體(Santa Cruz)；抗Bcl-2和cyclin D1抗體(Abcam)；抗cleaved caspase-3和cleaved caspase-8抗體(上海生工)。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U266細(xì)胞于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，每1～2 d換液，2～4 d傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。

2.2 CCK-8法及活細(xì)胞計數(shù)檢測PDTC對U266細(xì)胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的U266細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103個，每孔總體積100 μL。分別加入10 μL不同濃度的PDTC，使終濃度分別為0、25、50、100和200 μmol/L，各組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48和72 h后，向每孔中避光加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長測其吸光度(A)值，細(xì)胞生長抑制率(inhibitory rate, IR)按如下公式計算。IR (%)=[1-(A實驗組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)]×100%。另取U266細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105個，每孔總體積4 mL，分別加入等體積不同濃度的PDTC，終濃度同上所述，培養(yǎng)24、48和72 h后，取適量細(xì)胞懸液與0.2%臺盼藍(lán)混合染色至計數(shù)板上計數(shù)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測U266細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化 取對數(shù)生長期的U266細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，將其接種于6孔板中，每孔總體積4 mL，往各孔中分別加入等體積不同濃度的PDTC，使終濃度為0、25、50、100和200 μmol/L，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去上清液，用PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院流式細(xì)胞檢測中心按Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。同樣的方法收集細(xì)胞，用70%冰乙醇4 ℃固定過夜，送流式細(xì)胞檢測中心進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

2.4 RT-qPCR法檢測目的基因的表達(dá) β-actin的上游引物序列為5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列為5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，產(chǎn)物長度132 bp； DNMT1的上游引物序列為5′-AGACTACGCGAGATTCGAGTC-3′，下游引物序列為5′-TTGGTGGCGTAGTAGTAGAGG-3′，產(chǎn)物長度171 bp?？俶RNA的提取按照氯仿-異丙醇法進(jìn)行。經(jīng)紫外光分光光度計檢測其濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明(TaKaRa)總體系20 μL逆轉(zhuǎn)錄，得到各組cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.5 Western blot法檢測NF-κB (P65)、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和DNMT1的蛋白水平 同樣的方法收集PDTC處理后的細(xì)胞，用核蛋白和總蛋白抽提試劑盒說明書，取上清液按BCA法測蛋白濃度說明書檢測蛋白濃度。沸水浴5 min使蛋白變性。每組按照30 μg 蛋白量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng) I 抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min、3次，加入相應(yīng) II 抗(1∶2 000)在37 ℃孵育1 h，接著用TBST洗膜10 min、3次。PVDF膜化學(xué)發(fā)光檢測，用FUSION凝膠成像分析軟件分析條帶。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較時采用Turkey 法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PDTC抑制NF-κB (P65)結(jié)果檢測

如圖1所示，50和100 μmol/L的PDTC作用于U266細(xì)胞48 h后，Western blot檢測細(xì)胞核中NF-κB(P65)蛋白水平與對照組相比明顯降低(P<0.01)。

2 PDTC對U266細(xì)胞增殖的影響

用終濃度為0、25、50、100和200 μmol/L的PDTC分別作用于U266細(xì)胞，培養(yǎng)24、48和72 h后加入CCK-8試劑，酶標(biāo)儀測吸光度值，結(jié)果表明：PDTC作用48 h和72 h的2個時間組中，在25～200 μmol/L的濃度梯度范圍內(nèi)，隨著PDTC濃度的增加，生長抑制率明顯升高(P<0.01)；作用24 h組，未能顯示濃度遞增與效應(yīng)的相關(guān)性，見圖2A。同時，細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，不同濃度PDTC作用24 h，細(xì)胞數(shù)無明顯減少；隨著作用時間延長至48 h或72 h，細(xì)胞數(shù)量隨PDTC濃度的增加逐漸減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2B。兩者表明，PDTC抑制U266細(xì)胞增殖，作用呈濃度及時間依賴性。

Figure 1.The protein level of NF-κB (P65) in the U266 cells treated with PDTC detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 Western blot 檢測PDTC作用于U266細(xì)胞后NF-κB(P65)的蛋白水平

Figure 2.The effect of PDTC on the proliferation of U266 cells. A: CCK-8 assay; B: cell counting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs25 μmol/L group;##P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 PDTC對U266細(xì)胞的增殖抑制的檢測結(jié)果

3 PDTC對U266細(xì)胞周期和凋亡的影響

采用不同濃度PDTC作用于U266細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果顯示與對照組相比，G2期的細(xì)胞所占比例相對增多(P<0.01)，但大多數(shù)細(xì)胞處在S期，見圖3、表1。總的凋亡率隨PDTC濃度的增加而上升，當(dāng)濃度達(dá)100 μmol/L后，細(xì)胞凋亡率近最大值，PDTC組均較對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

4 PDTC對U266細(xì)胞Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平的影響

PDTC處理U266細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞提取蛋白，Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，Bcl-2的蛋白水平明顯下降，其蛋白水平受抑制程度與PDTC濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平隨著PDTC濃度的增加而升高，在濃度為200 μmol/L時差異更加明顯(P<0.05)，見圖5。

5 PDTC對U266細(xì)胞DNMT1的mRNA和蛋白水平的影響

不同濃度的PDTC處理U266細(xì)胞48 h后，RT-qPCR測定DNMT1的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比，PDTC組DNMT1的mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。Western blot實驗結(jié)果顯示，PDTC處理后DNMT1蛋白水平明顯下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且隨著PDTC濃度的增加，DNMT1蛋白水平呈逐漸降低趨勢，在100 μmol/L時差異較顯著(P<0.01)，見圖6。

Figure 3.Influence of PDTC on the cell cycle of U266 cells.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測PDTC對U266細(xì)胞周期的影響

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度PDTC對U266細(xì)胞周期的影響

**P<0.01vs0 μmol/L group.

Figure 4.The apoptotic rate of U266 cells increased with the increasing concentrations of PDTC for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PDTC作用于U266細(xì)胞48 h的細(xì)胞凋亡率

Figure 5.The protein levels of cyclinD1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 in PDTC groups were higher than those in control group but Bcl-2 decreased. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖5 Western blot 檢測不同濃度PDTC對U266細(xì)胞cyclin D1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和Bcl-2的蛋白水平

Figure 6.The effect of PDTC on the expression of DNMT1 at mRNA (A) and protein (B) levels determined by RT-qPCR and Wes-tern blot, respectively. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖6 Western blot和RT-qPCR檢測PDTC作用于U266細(xì)胞后DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)情況

討 論

多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞異常增殖的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，主要累及老年人。目前，由于新型藥物如沙利度胺、硼替佐米和來那度胺的應(yīng)用，極大改善了病人的總體生存率，但復(fù)發(fā)和死亡率仍很高，該病仍是不可治愈的血液腫瘤[8]。因此，如何積極有效地抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖，探尋更加有效的藥物和治療手段是目前骨髓瘤治療的關(guān)鍵。

NF-κB 是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，由P50、P52、c-Rel、P65/RelA和RelB組成。NF-κB信號通路參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的病理過程，與血液腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡密切相關(guān)。研究表明，在部分情況下NF-κB有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但大多數(shù)情況下可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抗凋亡的作用[9]。抑制NF-κB的活性可以增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。文獻(xiàn)報道，在MM中，NF-κB持續(xù)激活參與了MM的發(fā)生發(fā)展[10]。但在MM中，NF-κB高活性的具體原因我們不得而知。PDTC是氨基甲酸鹽的一種，屬于抗氧化劑，也作為NF-κB特異性抑制劑。其主要通過抑制IκB降解或者抑制NF-κB (P65)，阻礙NF-κB的向核移位，從而達(dá)到抑制NF-κB活性的作用。體外實驗表明，PDTC可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[11-13]。本研究采用PDTC抑制NF-κB信號通路，觀察其對MM U266細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明，PDTC能呈濃度和時間依賴性抑制U266細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并且有G2期阻滯的作用。這些表明PDTC通過抑制NF-κB信號通路活化抑制了MM U266細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制NF-κB相關(guān)抗凋亡通路有關(guān)。

Bcl-2家族是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，包括抗凋亡基因和促凋亡基因，其中抗凋亡蛋白成員，比如Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w 是通過阻礙caspase活化或線粒體膜電位的降低和細(xì)胞色素C的釋放發(fā)揮作用[14]。caspase家族即半胱氨酸天冬氨酸水解酶，對于調(diào)控真核細(xì)胞凋亡過程起了重要作用，caspase的激活即代表細(xì)胞凋亡過程的進(jìn)行。Caspase的一步步激活，高選擇性切割一些蛋白質(zhì)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。在我們的研究中選擇具有代表性的Bcl-2、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8作為凋亡的觀測指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PDTC通過抑制NF-κB，使Bcl-2的蛋白水平降低，cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平升高，且隨著PDTC濃度的改變而相應(yīng)的變化。細(xì)胞凋亡受細(xì)胞內(nèi)外因子調(diào)控，NF-κB的激活能誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活，因此，NF-κB是調(diào)控細(xì)胞凋亡重要的轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中，我們用PDTC作用于U266細(xì)胞，抑制了NF-κB，并且可能通過降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，激活caspase-3等關(guān)鍵酶，作用于caspase-8和線粒體的上游從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑。這與Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果一致，但其具體誘導(dǎo)凋亡的途徑還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期時多次重復(fù)實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，PDTC作用后G2期細(xì)胞相對增多，Western blot 結(jié)果顯示細(xì)胞周期蛋白cyclin D1蛋白水平呈增高趨勢。Hwang等[17]在研究β-catenin 和NF-κB 信號通路與cyclin D1關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)cyclin D1的轉(zhuǎn)錄激活能被NF-κB(P65)抑制。我們的結(jié)果也顯示PDTC抑制NF-κB信號通路，反饋性引起cyclin D1的表達(dá)升高。Cyclin D1調(diào)控細(xì)胞周期由G1至S期發(fā)展，這可能解釋了我們的結(jié)果中S期細(xì)胞高比率的原因。而PDTC對cyclin D1的調(diào)控機(jī)制可能有待更深入的研究。

在MM中，我們前期的研究表明一種抑癌基因PCDH10由于甲基化而表達(dá)減少或缺失[18]，而甲基化過程與DNMTs (包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)的表達(dá)密切相關(guān)。國內(nèi)外研究證實DNMTs 在骨髓瘤中異常高表達(dá)[19]，我們前期也檢測了骨髓瘤病人與正常人骨髓中DNMTs 的mRNA表達(dá)情況，得到同樣的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。DNMT1是重要的甲基轉(zhuǎn)移酶，其在MM U266細(xì)胞中異常高表達(dá)。有文獻(xiàn)研究表明，在急性髓系白血病中，硼替佐米可以通過Sp1/NF-κB通路下調(diào)DNMT1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)基因組DNA低甲基化[20]。因此，我們猜測NF-κB與DNMT1的表達(dá)有關(guān)，在本實驗中，加入PDTC后，從RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果中我們觀察到DNMT1在基因和蛋白水平均受到明顯抑制。這表明PDTC可能通過抑制NF-κB參與了對DNMT1的間接調(diào)控，也表明在多發(fā)性骨髓瘤中，NF-κB與DNMT1存在一定的聯(lián)系。這一結(jié)果對于進(jìn)一步研究PDTC在骨髓瘤中的作用及與抑癌基因甲基化的關(guān)系提供了依據(jù)。

綜上所述，本實驗通過PDTC抑制NF-κB信號通路，發(fā)現(xiàn)PDTC可抑制MM U266細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制Bcl-2的表達(dá)，活化caspase-3和caspase-8的表達(dá)有關(guān)。并且PDTC通過抑制NF-κB從而抑制DNMT1的表達(dá)，為PDTC在MM中的進(jìn)一步研究應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation and apoptosis of human multiple myeloma U266 cells

YI Bei, YUAN Hai-ting, XU Yong-hui, LUO Qi, ZENG Chen-si, CHEN Jian-bin

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqchenjianbin2007@126.com)

AIM: To explore the effect of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), an NF-κB inhibitor, on the proliferation and apoptosis of human multiple myeloma U266 cells and its mechanisms. METHODS: The U266 cells were treated with PDTC at different concentrations (0, 25, 50, 100 and 200 μmol/L)invitro. The growth inhibitory rate of the U266 cells was detected by CCK-8 assay and cell counting. The cell cycle of the U266 cells was determined by flow cyto-metry, and the apoptosis was examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The effect of PDTC on the expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) at mRNA and protein levels was measured by RT-qPCR and Western blot, respectively. The effects of PDTC on the protein levels of NF-κB (P65), DNMT1, Bcl-2, cyclin D1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 were determined by Western blot. RESULTS: The protein level of NF-κB (P65) was decreased after treatment with PDTC for 48 h or 72 h. PDTC inhibited the proliferation of U266 cells in both dose- and time-dependent manners. After treatment with PDTC for 48 h, the percentage of U266 cells in G2phase increased compared with control group (P<0.05). PDTC induced the apoptosis of U266 cells in a dose-dependent manner. The expression of DNMT1 at mRNA and protein levels decreased (P<0.05). The results of Western blot showed that the expression of Bcl-2 in PDTC groups decreased, while the protein levels of cyclin D1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 were higher than those in control group (P<0.05). CONCLUSION: The NF-κB inhibitor PDTC inhibits the proliferation of U266 cells by inducing cell apoptosis. It may be related to the down-regulated expression of DNMT1, cell cycle arrest and activation of the apoptotic pathways.

NF-κB; PDTC; Multiple myeloma; Apoptosis; DNA methyltransferase 1

1000- 4718(2017)07- 1177- 07

2016- 11- 10

2017- 03- 09

重慶市衛(wèi)生計生委科研計劃項目(No. 2011-1-032)

R733.3； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.004

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