田洪磊 詹 萍 顏海燕 談思維,2 毛曉英

(石河子大學(xué)食品學(xué)院1，石河子 832000) (杭州職業(yè)病防治院2，杭州 310006)

基于大鼠血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)小白杏杏仁油免疫調(diào)節(jié)作用研究

田洪磊1詹 萍1顏海燕1談思維1,2毛曉英1

(石河子大學(xué)食品學(xué)院1，石河子 832000) (杭州職業(yè)病防治院2，杭州 310006)

采用iTRAQ標(biāo)記及高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)技術(shù)對小白杏杏仁油干預(yù)試驗大鼠血清差異表達(dá)蛋白進(jìn)行定量鑒定，并通過表達(dá)模式及代謝通路聚類對鑒定獲得的差異蛋白進(jìn)行生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析。結(jié)果表明，小白杏杏仁油可能通過調(diào)節(jié)血清中結(jié)合珠蛋白(HP)、角蛋白(KRT10、KRT42)、微管蛋白α-8鏈(TUBA8)、免疫球蛋白重(k)鏈VⅢ區(qū)(VH26、MOPC63)、α-1-抗蛋白酶(SERPINA1)及T-激肽原(KNG1)等蛋白的表達(dá)水平，作用于金黃色葡萄球菌感染、吞噬體、致病性大腸桿菌感染、原發(fā)性免疫缺陷、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)5條先天性免疫通路而展現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)作用。

小白杏杏仁油 蛋白質(zhì)組學(xué) 免疫調(diào)節(jié) 代謝通路

現(xiàn)代分析技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方法可為天然產(chǎn)物生物學(xué)功能評價提供有力借鑒，其中串聯(lián)質(zhì)譜或多維液相色譜聯(lián)用技術(shù)與同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)融合手段已成為蛋白質(zhì)定性和定量研究的主要工具，該技術(shù)可對血清、細(xì)胞裂解液等絕大多數(shù)復(fù)雜樣本進(jìn)行相對和絕對定量研究[1]。與雙向電泳(2-DE)、差異凝膠電泳(DIGE)及同位素親和標(biāo)簽(ICAT)等傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)中常用的蛋白分離鑒定技術(shù)相比，雖然相關(guān)方法結(jié)合質(zhì)譜聯(lián)用亦可實現(xiàn)微量蛋白的分析鑒定，然而在精確定量差異蛋白方面存在缺陷[2]，iTRAQ技術(shù)對8種以內(nèi)的不同蛋白質(zhì)樣品中個體蛋白氨基及側(cè)鏈氨基酸進(jìn)行分別標(biāo)記，可實現(xiàn)差異蛋白(P<0.05)的準(zhǔn)確分析。血清作為機(jī)體疾病表征或功能物質(zhì)干預(yù)作用的標(biāo)志物直接載體，依托實驗動物或志愿人群血清樣本資源，通過血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行疾病發(fā)生機(jī)制及中藥或功能食品生物學(xué)功能研究引起了國內(nèi)外相關(guān)研究領(lǐng)域的關(guān)注[3-4]，將現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)與生物信息統(tǒng)計方法相結(jié)合可實現(xiàn)天然產(chǎn)物生物學(xué)功能的深入解析。

本研究建立免疫力低下大鼠模型，通過空白對照組(BS)、模型組(MC)、模型小白杏杏仁油樣品組(SF)實施免疫調(diào)節(jié)作用研究的基礎(chǔ)上，采用iTRAQ標(biāo)記及高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)技術(shù)對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行定量鑒定，并通過表達(dá)模式聚類(EPC)及代謝通路(Pathway)等分析對鑒定獲得的差異蛋白進(jìn)行功能詮釋，確定其參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過共性差異蛋白作用通路及機(jī)制解析再次驗證小白杏杏仁油的抗氧化與免疫調(diào)節(jié)效果，并推測其他生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

小白杏杏仁油：石河子大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點實驗室自制；四乙基溴化銨(TEAB) ：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)；胰蛋白酶(250 U/mg) ：Promega公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(97、66、43、31、20、14 KDa)：美國Sigma公司；其他試劑(均為分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5430R冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；VCX130超聲波細(xì)胞破碎儀：美國Sonics公司；iMark酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；LC-2AD納升流速高效液相色譜在線檢測儀、LC-20AB高效液相色譜脫機(jī)檢測儀：日本島津公司；Triple TOF 5600質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 操作流程

操作流程圖見1。

圖1 試驗操作流程

1.2.2 免疫動物模型建立與血清采集

實驗大鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供(動物生產(chǎn)許可證號：SCXY(新)2011-0004)，動物飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心動物飼養(yǎng)房(許可證號：SYXK(新)2010-0003) 內(nèi)進(jìn)行。采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的方法建立免疫力低下大鼠模型，具體方法參見文獻(xiàn)[5]。將實驗大鼠隨機(jī)分成3組(正常大鼠空白對照組BS、大鼠模型對照組MC及大鼠模型樣品喂養(yǎng)組SF)，其中樣品喂養(yǎng)組每日按5 mL/100g灌胃，其他2組按相同體積生理鹽水灌胃對照，喂養(yǎng)28 d后采集檢測樣本。采用心臟取血—抗凝儲存的方法制備各組血漿樣品，在0 ℃條件下離心分離(3 000 r/min) 10 min，獲得待檢血清。

1.2.3 大鼠血清樣本的制備

稱取適量各組血清樣品，加入500 μL蛋白裂解液對蛋白進(jìn)行溶解，然后分別添加濃度為1 mmol/L的PMSF溶液及2 mmol/L的EDTA溶液，旋渦反應(yīng)5 min后添加濃度為10 mmol/L的DTT溶液，超聲處理15 min混勻后，經(jīng)過25 000×g離心分離20 min后取上清液；在56 ℃條件下將制備上清液中加入終濃度為10 mmol/L的DTT溶液處理1 h，還原打開二硫鍵，而后加入終濃度為55 mmol/L的IAM溶液，暗室靜置45 min進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉，進(jìn)而加入適量冷丙酮在-20 ℃條件下靜置2 h，隨后經(jīng)過25 000×g離心分離20min丟棄上清液，將沉淀物在200 μL的TEAB(0.5 mol/L)中超聲溶解15 min，離心(25 000×g)分離20 min后取上清液，用于后期定量分析。采用ProteoMiner蛋白富集試劑盒法去除高豐度蛋白，蛋白質(zhì)濃度測量方法參見文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 大鼠血清樣本的酶解

配制12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，各血清蛋白樣品分別與2×上樣緩沖液混合，95 ℃條件下加熱5 min。設(shè)置每個樣品上樣量為30 μg，Marker上樣量為10 μg，120 V穩(wěn)壓電泳120 min，電泳結(jié)束后通過考馬斯亮藍(lán)染液染色2 h，并經(jīng)脫色液脫色3～5次，每次脫色時間為30 min；各樣品精確取出100 μg蛋白，設(shè)置適宜的酶解體系(蛋白:酶=2∶1)，在37 ℃條件下加入胰蛋白酶酶解4 h，后期再次按照預(yù)設(shè)比例補(bǔ)加胰蛋白酶1次，37 ℃條件下繼續(xù)酶解8 h。

1.2.5 iTRAQ標(biāo)記及SCX分離

將胰蛋白酶消化后的體系分別用真空離心泵抽干肽段，并用0.5 mol/L的TEAB對制備肽段進(jìn)行復(fù)溶。按照實驗手冊和相關(guān)報道進(jìn)行不同肽段樣本的iTRAQ標(biāo)記[7-8]，模型組(MC)、模型小白杏杏仁油樣品組(SF) 及空白對照組(BS)酶解肽段分別采用115、117及119 iTRAQ標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，室溫培養(yǎng)2 h后將標(biāo)記后的各肽段樣品進(jìn)行等量混合。

采用LC-20AB液相系統(tǒng)對樣品進(jìn)行分離。分離柱選用SCX分離柱(Ultremex SCX，4.6×250 mm)；洗脫條件如下：首先用4 mL buffer A (25%乙腈中NaH2PO4濃度為25 mmol/L，pH=2.7)將標(biāo)記后抽干的混合肽段進(jìn)行復(fù)溶，以1 mL/min的速率進(jìn)行入柱梯度洗脫，再次采用buffer A洗脫10 min，然后循序混入5%～35%的buffer B (25%乙腈中NaH2PO4濃度為25 mmol/L，KCl濃度為1 mol/L，pH=2.7) 進(jìn)而洗脫11 min，最終循序混入35%～80%的buffer B洗脫1 min，在214 nm吸光度條件下對整個洗脫過程進(jìn)行監(jiān)測，經(jīng)過篩選可獲得12個組分，各組分分別用StrataX除鹽柱進(jìn)行除鹽處理，冷凍抽干備用。

1.2.6 基于高分辨率阱質(zhì)譜儀 (LTQ Orbitrap HCD) 的LC-ESI-MS/MS分析

采用buffer A (2% 乙腈，0.1% 蟻酸) 將抽干備用的各組分分別復(fù)溶至0.5 μg/μL，20 000×g離心10 min去除不溶物質(zhì)，通過LC-20AD納升液相色譜儀進(jìn)行分析。

分析條件：C18反相柱 (進(jìn)樣部分：200 μm內(nèi)徑×2 cm長度，洗提分離部分：75 μm內(nèi)徑×10 cm長度)對各上樣 (10 μL，約5 μg) 組分實施反相分離。分離程序依次為：15 μL/min流速進(jìn)樣4 min，采用洗滌梯度為2%～35% 的buffer B (98%乙腈，0.1%蟻酸) 以400 nL/min流速梯度洗滌44 min，相同設(shè)置洗滌梯度為35%～80% 進(jìn)行線性洗提2 min，最終依次采用80% 的buffer B與buffer A分別洗柱4、1 min。

液相分離的肽段樣本進(jìn)入高分辨率阱質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，結(jié)合高能量碰撞裂解模式對肽段進(jìn)行篩選。離子源電壓設(shè)置為1.5 kV進(jìn)行離子阱信號檢測，對離子阱內(nèi)控制聚集量約為1×104個離子進(jìn)行掃描(質(zhì)荷比范圍為350～2 000 u) 鑒定。

1.2.7 數(shù)據(jù)庫選擇與檢索

基于蛋白質(zhì)質(zhì)譜屬性選擇合適數(shù)據(jù)庫，若檢測樣本來源于已測序生物，即直接選擇該物種數(shù)據(jù)庫；若為非測序生物樣本，則選擇與待測樣本最為相近的物種蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，試驗大鼠血清來源于已測序大鼠物種，選擇IPI.RAT.v3.87 (39 925 sequences)作為本研究數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合蛋白質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)軟件Mascot2.3.02進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣本蛋白質(zhì)電泳膠圖

正常大鼠空白對照組、大鼠模型對照組及大鼠模型樣品喂養(yǎng)組血清樣本蛋白質(zhì)電泳膠圖見圖2。

注：聚丙烯酰胺濃度12%；Marker(M)：97、66、43、31、20和14 KDa，裝載量12 μg；每個樣品上樣量30 μg；11～14分別為去除高豐度蛋白前的MC試驗組、及其去除高豐度蛋白后的E1、E2、E3儲備樣；21～24分別為去除高豐度蛋白前的SF試驗組、及其去除高豐度蛋白后的E1、E2、E3儲備樣；31～34分別為去除高豐度蛋白前的BS試驗組、及其去除高豐度蛋白后的E1、E2、E3儲備樣。圖2 血清樣本蛋白質(zhì)電泳膠圖

2.2 肽段匹配誤差評估

通過提高肽段母離子質(zhì)量檢測的精確度能大幅度減少假陽性鑒定結(jié)果出現(xiàn)的概率，雖然通過LTQ-Orbitrap-Velos質(zhì)譜儀所獲得的一級、二級質(zhì)譜的質(zhì)量精確度均小于3×10-6，但是為了防止鑒定結(jié)果遺漏等問題的出現(xiàn)，將數(shù)據(jù)庫檢索策略的肽段誤差控制在±10×10-6以內(nèi)，通過圖3顯示的所有匹配肽段的相對分子量真實值與理論值之間的誤差分布情況分析，譜圖匹配質(zhì)量誤差符合研究要求。

注：縱坐標(biāo)表示肽段匹配偏差在一定范圍內(nèi)的mascot 離子豐度(數(shù)量)；橫坐標(biāo)表示匹配到的肽段的檢測值和理論值之間的誤差。圖3 譜圖匹配質(zhì)量誤差分布情況

2.3 對照組血清差異表達(dá)蛋白鑒定

在對各組血清樣本的低豐度蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記、強(qiáng)陽離子交換色譜柱及反相色譜柱分離的基礎(chǔ)上，通過LC-ESI-MS/MS分析共檢測到1 651個肽段，根據(jù)不同iTRAQ標(biāo)簽組分的相對豐度實施對照組各肽段的相對定量，其定量結(jié)果采用其中一組相對于另一組的比值表示。在此基礎(chǔ)上，利用所得肽段進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索與分析，獲得系列蛋白質(zhì)豐度比不同的差異蛋白，對于豐度比接近于1的同一蛋白可視為此種蛋白在兩兩對比的兩組間沒有顯著變化，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的豐度比(即差異倍數(shù))達(dá)到1.2倍以上時，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗P<0.05，該蛋白可視為不同樣品對照組的差異蛋白質(zhì)，依照此方案分析共得到251個差異蛋白質(zhì)。通過免疫力低下模型組(MC)、模型小白杏杏仁油樣品組(SF)及空白對照喂養(yǎng)組(BS)3組試驗組中血清差異蛋白的兩兩比對，并對以上不同對照組所得的差異蛋白進(jìn)行初步統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)生物功能蛋白均產(chǎn)生了較為明顯的差異，復(fù)雜血清蛋白體系多樣性改變的同時，存在共性變化的差異蛋白，其中3組對比組(MC/SF、MC/BS及SF/BS)中均有差異的共有14個差異蛋白(表1、圖4)，共同差異蛋白的篩選與統(tǒng)計為后期Pathway及表達(dá)模式聚類分析等提供了先決條件，亦可為小白杏杏仁油免疫功能明晰提供充實的數(shù)據(jù)庫。

共性差異蛋白比較值對照分析看出，在對試驗大鼠進(jìn)行免疫力低下模型處理后，相對于基礎(chǔ)喂養(yǎng)空白對照組，相關(guān)功能蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)趨勢，或由于機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生，導(dǎo)致結(jié)合珠蛋白(HP)、角蛋白(KRT)及免疫球蛋白重鏈V-Ⅲ區(qū)(VH26)等免疫力低下誘導(dǎo)急性期時相反應(yīng)蛋白的明顯上調(diào)；在小白杏杏仁油對照干預(yù)作用條件下，相關(guān)共性差異蛋白指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的調(diào)整。

表1 各對照組中共性差異蛋白種類及其比值

注：BS為正常大鼠空白對照組，MC為大鼠模型對照組，SF為大鼠模型樣品喂養(yǎng)組。

注：共性差異表達(dá)蛋白采用國際通用的蛋白編碼名稱表示。圖4 各比較組共性差異表達(dá)蛋白

2.4 對照組血清差異表達(dá)蛋白Pathway富集分析

為了深入解析小白杏杏仁油對實驗大鼠的生物學(xué)功能，本研究采用KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對所獲得的14種共性差異蛋白進(jìn)行參與生化代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析，預(yù)期通過Pathway富集，明晰其主導(dǎo)作用機(jī)制或協(xié)同作用效果。

通過KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫進(jìn)行共性差異蛋白pathway檢索，獲得了V-Ⅲ區(qū)(VH26)、角蛋白(KRT10、KRT42)、結(jié)合珠蛋白(HP)、Ras相關(guān)蛋白(RAP1B)、原肌球蛋白α-3鏈(TPM3)、α-1-抗蛋白酶(SERPINA1)、微管蛋白α-8鏈(TUBA8)及T-激肽原(KNG1)、免疫球蛋白k鏈V-Ⅲ區(qū)(MOPC63)10種蛋白的相關(guān)作用通路，通路分析表明小白杏杏仁油對金黃色葡萄球菌感染通路、吞噬體通路、致病性大腸桿菌感染通路、原發(fā)性免疫缺陷通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)5條先天性免疫通路作用最為頻繁(各通路包含共性差異蛋白數(shù)N>3)，其他4種共性差異蛋白尚未有確定的作用通路。

結(jié)合比較組共性差異表達(dá)蛋白比較值分析，可能由于模型處理所造成的機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)，以及后期相關(guān)炎癥反應(yīng)、易感染等現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展，免疫球蛋白重鏈V-III區(qū)(VH26)、I型角蛋白(KRT I)、結(jié)合珠蛋白(HP)、Ras相關(guān)蛋白(RAP1B)、原肌球蛋白α-3鏈(TPM3)等相關(guān)急性期時相反應(yīng)蛋白在MC試驗組血液中的表達(dá)明顯增高，通過小白杏杏仁油平行干預(yù)作用后，相關(guān)急性期時相反應(yīng)蛋白表達(dá)或免疫炎癥誘導(dǎo)重鏈突變區(qū)重排現(xiàn)象在SF試驗組中顯著下降，可以說明小白杏杏仁油對相關(guān)微生物感染及原發(fā)性免疫缺陷等通路具有一定的抑制與調(diào)控作用，但是與BS對照組相比，大部分相關(guān)差異蛋白表達(dá)水平仍略顯偏高。本次研究所涉及血清RAP1B蛋白在MC組中表達(dá)相對較高，但通過其在SF組中下調(diào)的表現(xiàn)可以預(yù)測小白杏杏仁油對機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)逆轉(zhuǎn)的輔助作用；同樣，平行對照組中原肌球蛋白α-3鏈(TPM3)的差異性表達(dá)亦引起了廣大學(xué)者的普遍關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)粥樣動脈硬化[9]、毒性視網(wǎng)膜損傷[10]等病理現(xiàn)象都伴隨著TPM3表達(dá)水平的提升，通過目前相關(guān)研究成果推斷，在被動免疫力低下大鼠模型(MC)構(gòu)建后是否由于類似繼發(fā)性疾病的產(chǎn)生，而導(dǎo)致MC組血清TPM3的特異性表達(dá)，繼而可能基于小白杏杏仁油的干預(yù)作用趨于下調(diào)[11-12]。同時還發(fā)現(xiàn)可能由于小白杏杏仁油的干預(yù)而激發(fā)了α-1-抗蛋白酶(SERPINA1)、微管蛋白α-8鏈(TUBA8)及T-激肽原(KNG1)等差異蛋白的表達(dá)，從而輔助調(diào)控了與其相關(guān)的補(bǔ)體和凝血級聯(lián)等富集通路。共性差異蛋白的獲得與表達(dá)途徑解析為功能脂質(zhì)體生物學(xué)功能構(gòu)效關(guān)系深入研究奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

小白杏杏仁油免疫調(diào)控作用與血清蛋白表達(dá)中金黃色葡萄球菌感染、吞噬體、致病性大腸桿菌感染、原發(fā)性免疫缺陷、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)5條先天性免疫通路具有緊密相關(guān)性。

小白杏杏仁油可能通過調(diào)控血清免疫球蛋白重(k)鏈V-III區(qū)(VH26 、MOPC63)、結(jié)合珠蛋白(HP)、角蛋白(KRT10、KRT42)、微管蛋白α-8鏈(TUBA8)、α-1-抗蛋白酶(SERPINA1)及T-激肽原(KNG1)等共性差異蛋白，而展現(xiàn)其免疫調(diào)控作用。

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Immune Regulatory Activities of Small White Apricot Almond
Oil by Differentially Expressed Proteomics-Based Approach

Tian Honglei1Zhan Ping1Yan Haiyan1Tan Siwei1,2Mao Xiaoying1
(College of Food Science, Shihezi University1, Shihezi 832000)
(Hangzhou Hospital for the Prevention and Treatment of Occupational Diseases2, Hangzhou 310006)

Differentially expressed proteins of serum were quantitatively identified through iTRAQ labeling and high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The biochemical metabolic and signal transduction pathways of the differentially expressed proteins identified were conducted with expression pattern and metabolic pathway analysis. The results showed that small white apricot almond oil could demonstrate the immune regulatory activities with 5 innate immune pathways, including interactions with staphylococcus aureus infection, phagosome, pathogenic E. coli infection, primary immunodeficiency, complement and blood coagulation. The proteins expression levels, such as haptoglobin protein (HP), keratin (KRT10, KRT42), tubulin α-8 chain (TUBA8), V-III section of immunoglobulin heavy(k) chain (VH26,MOPC63), α-1-antiprotease (SERPINA1) and T-prokinin (KNG1), were closely related those innate immune pathways.

small white apricot almond oil (WAAO), proteomics, immunomodulatory, pathway

國家自然科學(xué)基金(31000766、31260374)

2015-07-05

田洪磊，男，1979年出生，副教授，食品科學(xué)

詹萍，女，1981年出生，副教授，食品風(fēng)味化學(xué)、食品營養(yǎng)學(xué) 顏海燕，女，1974年出生，高級實驗師，食品營養(yǎng)學(xué)

R151.1

A

1003-0174(2017)02-0062-06