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      改良試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗檢測羊布魯氏菌病結(jié)果比較

      2017-08-09 15:10:37馮華
      中國草食動物科學(xué) 2017年4期
      關(guān)鍵詞:布魯氏菌試管平板

      馮華

      (云蒙山合作示范牧場,四川 宣漢 636150)

      改良試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗檢測羊布魯氏菌病結(jié)果比較

      馮華

      (云蒙山合作示范牧場,四川 宣漢 636150)

      虎紅平板凝集試驗方便、快捷,目前已廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖場羊布魯氏菌病的普查,但其假陽性情況有待探究。利用改良試管凝集試驗對虎紅平板凝集試驗檢出的陽性個體進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)陽性率僅為88.8%。表明虎紅平板凝集試驗存在假陽性,可先用虎紅平板凝集試驗進(jìn)行大面積普查,陽性樣品再用改良試管凝集試驗復(fù)核。

      改良試管凝集試驗;虎紅平板凝集試驗;布魯氏菌病

      布魯氏菌病簡稱“布病”,有6個種,即馬耳他布魯氏菌(Brucellamelitensis)、流產(chǎn)布魯氏菌(Br.abortus)、豬布魯氏菌(Br.suis)、林鼠布魯氏菌(Br.neotomae)、綿羊布魯氏菌(Br.ovis)和狗布魯氏菌(Br.canis)[1]。習(xí)慣上稱馬耳他布魯氏菌為羊布魯氏菌,流產(chǎn)布魯氏菌為牛布魯氏菌[2]。各個種與生物型菌株之間、形態(tài)及染色特性等方面無明顯差別[3]。布魯氏菌的抵抗力和其他不能產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌相似,為細(xì)小的球桿菌、無鞭毛、有毒力的菌株[4]。流產(chǎn)布魯氏菌主要宿主是牛,而羊、猴、豚鼠有一定易感性;馬耳他布魯氏菌,主要宿主是山羊和綿羊[5],可以由羊傳入牛群,也可由牛傳播于牛,而其他動物對它的易感性則與流產(chǎn)布魯氏菌相同[6]。檢測羊布魯氏菌病血清抗體的方法有很多種類,本試驗用虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗對四川省宣漢縣一個規(guī)?;窖蝠B(yǎng)殖場和一個山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社的1 298份血清樣品進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(RBPT),將虎紅平板凝集試驗檢出陽性的358份樣品再用試管凝集試驗(SAT)檢測對比[7],以供廣大養(yǎng)殖場參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      待檢樣品1 298份采集于四川省宣漢縣李氏養(yǎng)殖場和專業(yè)合作社,待檢血清樣品放存于-20℃冰箱內(nèi)。

      1.2 診斷試劑

      布魯氏菌病陽性和陰性診斷血清由四川省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供,批號:川生藥字(2014)4017451。布魯菌虎紅平板凝集試驗抗原、布魯菌改進(jìn)試管凝集試驗抗原同樣由四川省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供,批號分別是20140812、川生藥字(2014)4017451。微量移液器,96孔U型底微量反應(yīng)板實驗室自購。

      1.3 方法

      1.3.1 血樣采集及血清制備 采血5mL,1 000 r/min離心5min,取上清液裝入5mL試管置-20℃的冰箱內(nèi)保存。以備檢測。

      1.3.2 虎紅平板凝集試驗(RBPT) 在潔凈滅菌的平板凝集玻璃板片上標(biāo)注樣品編號和陰陽對照組,用移液器吸取虎紅平板凝集抗原被檢血清30μL滴入相應(yīng)的檢測點內(nèi),再用移液器分別吸被檢樣品30 pμL混合均勻,每吸取一個樣品更換一次吸頭。在20℃時反應(yīng)3~5min,以陽、陰性血清對比觀察結(jié)果并記錄。若被檢血清有顆粒狀或絮狀物出現(xiàn)均判為陽性,相反則判為陰性。

      1.3.3 改良試管凝集試驗(MSAT) 血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)血清分別稀釋1∶200倍,各血清稀釋液和1∶20倍抗原稀釋液各60μL以100μL移液器加入96孔U型底微量反應(yīng)板中,于平板振蕩器上混勻后將反應(yīng)板以密封膜密封后放置37℃溫箱反應(yīng),22~24 h后取出觀察試驗結(jié)果。

      1.3.4 標(biāo)記原則 100%凝集即反應(yīng)孔底部無點狀白色沉淀,整個反應(yīng)孔呈片狀凝集,記做“#”;75%凝集即反應(yīng)孔底部凝集物中稍有點狀白色沉積,75°傾斜反應(yīng)板時不流,記做“+++”;50%凝集即反應(yīng)孔底部有明顯的凝集物和點狀白色沉積,75°傾斜反應(yīng)板時微流,即白色沉積物不全部下流,記做“++”;25%凝集即反應(yīng)孔底部有點狀白色沉積,點狀邊緣模糊發(fā)散,75°傾斜反應(yīng)板時白色沉積物幾乎全流,記做“+”;不凝集即反應(yīng)孔底部僅有點狀白色沉積,75°傾斜反應(yīng)板時白色沉積物全部下流,記做“-”。反應(yīng)結(jié)果為“++”的為陽性,反應(yīng)結(jié)果為“-”的為陰性。

      2 檢測結(jié)果

      所采集1 298份羊血清樣品,虎紅平板凝集試驗檢出陽性樣品358份,陽性率27.6%,其中李氏養(yǎng)殖場陽性率57.4%,專業(yè)合作社陽性率19.0%;利用改良試管凝集試驗(MSAT)復(fù)核358份陽性樣本,檢出陽性樣本318份,陽性率88.8%,其中李氏養(yǎng)殖場陽性率94.6%,專業(yè)合作社陽性率83.8%。檢測結(jié)果見表1。

      表1 虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測羊血清結(jié)果

      3 分析與討論

      通常情況下,RBPT使用方便、快捷,適用于大面積普查,但易出現(xiàn)假陽性[8]。MSAT是我國布魯氏菌病診斷的法定方法SAT的升級,既能定性,也能定量,判定容易、檢測更精準(zhǔn),也可作為布病早期診斷,但往往因感染動物的抗體滴度達(dá)不到檢測水平,不易檢測出陽性,從而易造成誤診和漏診。且MSAT特異性高,檢測比較準(zhǔn)確,但操作費工、費時[9],不利于鄉(xiāng)鎮(zhèn)大面積普查。本研究發(fā)現(xiàn),采用RBPT檢測羊布魯氏菌病陽性檢出率27.6%;采用MSAT檢測羊布魯氏菌病358份血清樣品,檢測出陽性樣品318份,可疑和陰性樣品共40份,陽性檢出率88.8%。本實驗證明了用RBPT檢測血清樣品可能存在假陽性樣品現(xiàn)象,說明RBPT可用于養(yǎng)殖場布魯氏菌病的大面積普查的初步篩選,但不能定性定量。因此,可先用RBPT普查,陽性樣品再用MSAT復(fù)核,以便作出準(zhǔn)確的判斷[10]。

      [1] 孟茹.布魯氏菌實時熒光定量PCR檢測方法與血清快速診斷試紙的初步研究[D].新疆石河子:石河子大學(xué),2010.

      [2] 劉鳳.豬疥螨病的科學(xué)防治[J].中國畜禽種業(yè),2015(10):117-118.

      [3] 姜玉嫻,孫雷.應(yīng)用RBPT監(jiān)測布魯氏菌病誤差原因分析[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2009(4):41.

      [4] 侯寶華,喬平平,黨志喜.奶牛布病防制主要技術(shù)措施[J].中國牛業(yè)科學(xué),2010(6):100-101.

      [5] 楊春華,邱昌慶,曹小安.流產(chǎn)布魯氏菌omp25基因的克隆與原核表達(dá)[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2007(6):465-468.

      [6] 王洪喆.動物布病及人間布病的預(yù)防[J].動物保健,2006(9):31-32.

      [7] 項愛紅.常規(guī)試管凝集試驗與虎紅平板凝集試驗檢測布病抗體結(jié)果對比分析[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2016(1):32-33.

      [8] 樊三忠,劉金彪,陳冬毅,等.虎紅平板凝集試驗與試管凝集試驗檢測奶牛布魯氏菌病的比較[J].中國動物檢疫,2009(9):52-53.

      [9] 李鋒,王莉,柴春彥,等.檢測牛乳中三聚氰胺的間接競爭ELISA方法的建立[J].中國動物檢疫,2009(9):47-48,53.

      [10]李智偉,馬秀敏,張躍新,等.布魯氏菌的分子生物學(xué)診斷技術(shù)[J].中國病原生物學(xué)雜志,2011(11):861-864,827.

      S826.7

      A

      2095-3887(2017)04-0069-02

      10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.020

      2017-04-26

      馮華(1978-),男,獸醫(yī)師,大專。研究方向:畜牧獸醫(yī)。

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