鄭 覃,李建穎,楊 璐,王青霞,王 佳,李孟璇(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

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超聲輔助提取黑果枸杞花色苷的工藝優(yōu)化

鄭 覃,李建穎*,楊 璐,王青霞,王 佳,李孟璇
(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

利用響應(yīng)面分析法對黑果枸杞花色苷的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以總花色苷含量為指標(biāo),選取液料比、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間和乙醇濃度為主要因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),并通過響應(yīng)面分析法進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn),對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:液料比20.4∶1 mL/g,超聲提取溫度48 ℃,超聲提取時(shí)間24.8 min,乙醇濃度79%為最佳提取條件,該條件下花色苷提取量可達(dá)(14.999±0.014)mg/g。各因素對花色苷提取量的影響程度依次為:超聲提取溫度>乙醇濃度>超聲提取時(shí)間>液料比。

黑果枸杞,響應(yīng)面分析,提取,花色苷,工藝優(yōu)化

黑果枸杞為茄科枸杞屬的植物,其果微甜,性平,清熱,擁有很好的藥用和食用價(jià)值。黑枸杞中富含豐富的花色苷類成分[1],是一種天然的抗氧化劑[2],抗氧化活性遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素C、維生素E等[3-4],其結(jié)構(gòu)上含有的眾多酚羥基能夠阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),從而有效清除活性氧簇(ROS)[5-6]。

花色苷的提取受多種因素的影響,主要因素有原料比表面積、提取溶劑的種類、濃度、液料比、pH、提取溫度、時(shí)間以及提取次數(shù)等[7]。目前,花色苷的提取方法有水提取、有機(jī)溶劑提取、超臨界流體萃取、超聲波提取和酶解輔助提取等方法[8],普遍存在提取率低、有機(jī)溶劑易污染環(huán)境等缺點(diǎn)。根據(jù)提取花色苷目的的不同,可選取不同的溶劑進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。例如,若是為了對提取的花色苷進(jìn)行定性定量分析,常選取三氟乙酸甲醇溶液，因?yàn)椴捎么朔N溶液提取不會破壞花色苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu),且不易將大分子的蛋白質(zhì)、糖類帶入;若是為了將提取的花色苷用于食品添加,則常采用酸性乙醇溶液，因?yàn)榇朔杀３肿畲笊氐寐?保持色素穩(wěn)定性及提取物安全[9]。研究表明,花色苷類物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,光照、溫度、pH等理化性質(zhì)都會影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;提取時(shí)應(yīng)避免光照,溫度不宜太高,提取時(shí)間也不宜過長,避免花色苷類成分發(fā)生降解[10-13]。同時(shí),溶劑提取法雖然操作相對簡單,對設(shè)備要求較低,但是也存在提取效率低,雜質(zhì)含量高,提取時(shí)間較長與熱不穩(wěn)定等缺點(diǎn),故實(shí)際操作時(shí),常采用超聲、震蕩或微波等輔助提取[14-16]。本實(shí)驗(yàn)將超聲波提取法與有機(jī)溶劑提取法相結(jié)合,研究不同因素條件下對黑果枸杞花色苷提取的影響,通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝條件,為黑果枸杞花色苷的綜合開發(fā)與利用提供理論及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞干果 甘肅省民勤縣購買;乙醇 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;鹽酸 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;冰乙醇 分析純，天津大學(xué)科威公司;醋酸鈉 分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;氯化鉀 分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司;錦葵色素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司。

DK-8AS電熱恒溫水浴鍋 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AUY220電子分析天平 日本島津公司;RV10DIGITAL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA;UV-2600紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;XO-SM50超聲波微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司;DH-101電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LWF6-BI低溫粉碎機(jī) 福建莆田電宏強(qiáng)有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科技工貿(mào)有限有限公司;Bante210 pH計(jì) 上海般特儀器有限公司;SW-CJ-1FB超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將黑果枸杞置于35 ℃恒溫條件下,烘干至恒重,粉碎,過60目篩,即得黑果枸杞干粉[17]。

1.2.2 總花色苷提取工藝 準(zhǔn)確稱取2.000 g黑果枸杞干粉,置于100 mL圓底燒瓶中;加入1%鹽酸酸化乙醇(體積比1∶99),避光恒溫超聲輔助提取(超聲頻率40 kHz);4000 r/min離心5 min收集上清液;酸性乙醇定容至100 mL,即得提取液。

1.2.3 總花色苷含量測定 采用pH試差法測定總花色苷的含量[18-20],以錦葵色素-3-葡萄糖苷為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn),測定總花色苷的含量[21]。

將得到的提取液分別用pH1.0(0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67,v/v)和pH4.5(0.2 mol/L NaAc·3H2O:0.2 mol/L HAc=1∶1,v/v)緩沖液稀釋10倍,混合均勻后,放入恒溫水浴鍋中平衡30 min,作為實(shí)驗(yàn)組。采用1%酸性乙醇代替提取液,同樣條件下處理,平衡30 min,作為空白組。待平衡結(jié)束后,分別測其在530 nm和700 nm下的吸光度。按下式計(jì)算總花色苷含量[22-23]:

花色苷含量(mg/g)=[(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5×Mw×DF×V]/ε×L×m

式中:Mw-錦葵色素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量,493200 mg/mol;DF-稀釋因子;V-提取液的體積,0.1 L;ε-摩爾消光系數(shù),29600 L/(mol·cm);L-光程厘米數(shù),1 cm;m-原料的質(zhì)量,2.000 g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,以酸化的80%乙醇為提取溶劑,分別在30、40、50、60、70 ℃的水浴中提取黑果枸杞花色苷,液料比為20∶1 mL/g,提取25 min。

1.2.4.2 超聲提取時(shí)間對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,以酸化的80%乙醇為提取溶劑,提取溫度50 ℃,提取液料比為20∶1 mL/g,設(shè)定不同的提取時(shí)間(15、20、25、30、35 min)提取黑果枸杞花色苷。

1.2.4.3 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,設(shè)定不同濃度(50%、60%、70%、80%、90%)的酸化乙醇為提取溶劑,提取溫度50 ℃,提取液料比為20∶1 mL/g,提取黑果枸杞花色苷,提取25 min。

1.2.4.4 液料比對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,以酸化的80%乙醇為提取溶劑,提取溫度50 ℃,設(shè)定不同液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)提取黑果枸杞花色苷,提取25 min。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選擇超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、乙醇濃度和液料比四個(gè)因素,以黑果枸杞中花色苷含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[24-26]。因素水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本文在單因素實(shí)驗(yàn)分析的基礎(chǔ)上,采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案,借助Design-Expert 8.0軟件并結(jié)合方差分析法,得出最優(yōu)的黑果枸杞花色苷的提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響

超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響如圖1所示。由圖1可見,隨著溫度的升高,花色苷的含量也在逐漸上升。由分子運(yùn)動(dòng)論可知,溫度升高會使分子運(yùn)動(dòng)加快,溶解和擴(kuò)散的速度也隨之加快,溫度較高可能會使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,更易使花色苷被釋放到溶劑中,從而使其花色苷的含量逐漸上升[27]。但溫度到達(dá)50 ℃以后,花色苷的提取效果明顯下降，是由于溫度過高使部分花色苷的結(jié)構(gòu)遭到破壞,最終使得提取效果降低,所以50 ℃為最佳超聲提取溫度。

圖1 超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the anthocyanins extraction

2.2 超聲提取時(shí)間對花色苷提取效果的影響

超聲提取時(shí)間對黑果枸杞花色苷提取的影響如圖2所示。由圖2可見,隨著超聲提取時(shí)間的延長,花色苷的含量逐漸增加。但當(dāng)時(shí)間超過25 min后,花色苷的含量呈明顯下降的趨勢,一方面是由于超聲時(shí)間過長,氧化或光照反應(yīng)會導(dǎo)致花色苷發(fā)生分解,使其含量降低;另一方面是由于超聲提取時(shí)間過長導(dǎo)致其他非花色苷成分大量溶出,從而使得提取率降低。所以最佳超聲提取時(shí)間為25 min。

圖2 超聲提取時(shí)間對花色苷提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the anthocyanins extraction

2.3 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響

乙醇濃度對黑果枸杞花色苷提取的影響如圖3所示。由圖3可知,隨著乙醇濃度的不斷增高,黑果枸杞提取物中的花色苷的含量逐漸上升,說明在一定范圍內(nèi),隨著乙醇濃度的增加,溶劑的滲透力也隨之增加,從而有利于花色苷的溶出,但當(dāng)乙醇濃度過高時(shí),溶液的極性降低不利于弱極性的花色苷的溶出。所以80%的乙醇為最佳提取溶劑。

圖3 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the anthocyanins extraction

2.4 液料比對花色苷提取效果的影響

液料比對黑果枸杞提取效果的影響如圖4所示。由圖4可以看出,隨著液料比的逐漸增加,花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先上升后下降,原因是溶劑在一定范圍內(nèi)能充分提取花色苷,若進(jìn)一步增加液料比,花色苷不再溶出，而其他成分溶出，會使花色苷的濃度降低,且成本會增大,所以最佳液料比為20∶1 mL/g。

圖4 液料比對花色苷提取效果的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the anthocyanins extraction

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化花色苷提取條件

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以花色苷含量Y為響應(yīng)值,利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of response surface test

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:**表示在0.01水平顯著;* 表示在0.05水平顯著。

2.5.2 方差分析 使用Design-Expert 8.0軟件對29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行方差分析,由于交互項(xiàng)C×D極不顯著,因此采用手動(dòng)優(yōu)化的方法對得到的回歸模型進(jìn)一步優(yōu)化,分析結(jié)果見表3。

經(jīng)回歸擬合后,得到黑果枸杞花色苷提取率對各實(shí)驗(yàn)因子的二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y=14.99+0.021A-0.15B-0.025C-0.075D+0.022AB+0.028AC-0.035AD+0.067BC-0.12BD-0.24A2-0.32B2-0.39C2-0.28D2

該方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應(yīng)值的影響程度,系數(shù)的正、負(fù)反映了影響的方向。由于該方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值,可以推斷方程代表的拋物面開口向下,因而具有極大值點(diǎn),可以進(jìn)行優(yōu)化分析。由方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以得出,影響黑果枸杞花色苷提取率因素的主次順序?yàn)?B(提取溫度)>D(乙醇濃度)>C(提取時(shí)間)>A(液料比)。

由表3可知,整個(gè)回歸模型極顯著(p<0.0001),說明模型是有意義的;校正R2=0.9488說明該模型能解釋94.88%響應(yīng)值的變化;失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),表明模型與實(shí)際情況擬合較好,使用該方程代替真實(shí)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析是可行的。一次項(xiàng)B、D顯著,A、C不顯著,BC、BD交互項(xiàng)影響顯著,其他交互項(xiàng)影響不顯著,二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著。

2.5.3 交互作用分析 為進(jìn)一步研究因素間的交互作用,通過Design-Expert繪制響應(yīng)曲面圖進(jìn)行直觀分析,結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 溫度與乙醇濃度對花色苷含量的交互作用Fig.5 Effect of interaction between temperatureand ethanol concentrationon the anthocyanin content

圖6 溫度與時(shí)間對花色苷含量的交互作用Fig.6 Effect of interaction between temperature and time on the anthocyanin content

由圖5可知:在一定范圍內(nèi),花色苷含量隨提取溫度及提取劑的濃度的增大都是先增加后降低,這一點(diǎn)與單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)整體趨勢相符;通過方差分析可知,提取溫度與乙醇濃度交互項(xiàng)對提取的花色苷含量影響顯著(p<0.05)。由圖6可知:在一定范圍內(nèi),隨著提取溫度的增大,提取的花色苷的含量平緩增加,到達(dá)一定值后,隨著提取溫度的增大而迅速降低;隨著提取時(shí)間的增加,提取的花色苷的含量先增加后降低,整體趨勢與單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)基本相符;由方差分析結(jié)果可知,提取溫度與提取時(shí)間交互項(xiàng)對提取的花色苷含量影響顯著(p<0.05)。

2.5.4 最佳提取工藝的預(yù)測及驗(yàn)證 對優(yōu)化后的回歸方程求解,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)提取花色苷的最佳工藝條件為:液料比20.37∶1 mL/g,提取溫度47.77 ℃,提取時(shí)間24.75 min,乙醇濃度79.08%,此條件下提取的花色苷含量理論上可達(dá)15.01 mg/g?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件,將其校正為液料比20.4∶1 mL/g,提取溫度48 ℃,提取時(shí)間24.8 min,乙醇濃度79%,在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),提取得到的花色苷的含量為(14.999±0.014)mg/g,結(jié)果與預(yù)測值基本相符,證明了該模型的有效性。

3 結(jié)論與討論

超聲輔助提取黑果枸杞花色苷的過程中,各因素對花色苷提取效果的影響大小依次為提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間>液料比。采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最終確定最佳工藝條件為20.4∶1 mL/g,提取溫度48 ℃,提取時(shí)間24.8 min,乙醇濃度79%,此條件下提取得到的黑果枸杞花色苷含量為(14.999±0.014)mg/g。與潘自皓[5]等采用靜置法,提取溶劑1%甲酸,提取溫度75 ℃,料液比30∶1 mL/g,每次提取時(shí)間1 h和提取次數(shù)3次,提取得到黑果枸杞花色苷含量為(4.51±0.06)mg/g相比,采用超聲輔助酸性乙醇作提取劑提取黑果枸杞花色苷,極大程度上節(jié)約了時(shí)間,且提取率明顯提高。

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Process optimization for ultrasonic-assisted extraction of anthocyanins fromLyciumruthenicumMurray

ZHENG Tan,LI Jian-ying*,YANG Lu,WANG Qing-xia,WANG Jia,LI Meng-xuan

(College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,Tianjin 300134,China)

The ultrasonic-assisted extraction process of anthocyanins fromLyciumruthenicumMurray was optimized by response surface methodology in this paper. Total anthocyanins content as index,the liquid to solid ratio,extraction temperature,extraction time and ethanol concentration were selected as the main factors through the single factor experiment. Thus the Box-Behnken experimental design was carried out with four factors and three levels and the response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions.The results indicated that the optimal extraction conditions were determined as follows:the liquid to solid ratio of 20.4∶1 (mL/g),extraction temperature of 48 ℃,extraction time of 24.8 min and ethanol concentration of 79%. Under the above conditions,the extraction content of anthocyanins could reach(14.999±0.014)mg/g. The primary and secondary order of the factors affecting the extraction content of anthocyanins was extraction temperature,alcohol concentration,extraction time,and liquid to solid ratio.

LyciumruthenicumMurray;response surface methodology;extraction;anthocyanins;process optimization

2016-11-30

鄭覃(1994-)，男，碩士研究生，研究方向：食品加工與貯藏，E-mail:m18222069272_1@163.com。

*通訊作者:李建穎(1961-)，女，碩士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的提取、分離與純化，E-mail:ljying@tjcu.edu.cn。

天津商業(yè)大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化獎(jiǎng)勵(lì)項(xiàng)目(60207-2015CGZH0202)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510069047)；天津市大學(xué)生創(chuàng)業(yè)實(shí)踐計(jì)劃項(xiàng)目(201610069044)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)14-0227-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.044