壺天宮鐘乳石變色原因的探究

肖樂天

研究背景

暑假，我到位于安徽省廣德縣的太極洞旅游。在參觀洞區(qū)代表性景觀之一壺天宮時，發(fā)現(xiàn)洞內(nèi)鐘乳石為黑褐色，十分突兀。詢問導(dǎo)游、景區(qū)工作人員，他們也覺得很蹊蹺，很可惜弄不清具體原因。景區(qū)已做了不少工作以清除這些污垢，但效果并不理想。不過，通過交流，我得知了一個事實：壺天宮內(nèi)鐘乳石早前也和其他溶洞內(nèi)鐘乳石一樣呈現(xiàn)乳白色，但壺天宮后來曾被當作酒窖貯存原酒。不知是不是巧合，在貯酒一段時間后鐘乳石表面開始出現(xiàn)一些黏稠的東西，顏色逐步加深，最終成為現(xiàn)在的樣子（圖1）。游覽結(jié)束后，我一直在想，原本漂亮的鐘乳石為什么會在窖酒后就變成黑褐色呢？這些黏稠黑褐色物質(zhì)是怎么產(chǎn)生的？這一系列的問號激發(fā)了我深入探究的濃厚興趣。

我首先在網(wǎng)上仔細搜索，發(fā)現(xiàn)與之有關(guān)的文獻記錄、研究資料都十分稀少。由于鐘乳石顏色改變是在貯藏白酒原酒后發(fā)生的，因此我判斷這可能是因貯藏白酒前后，洞內(nèi)生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變所致。通過實地采集樣品、顯微鏡初步觀察、微生物分離純化等實驗和分析，我初步判斷壺天宮鐘乳石變色是由溶洞生態(tài)環(huán)境改變引發(fā)微生物大量滋生導(dǎo)致的。

實驗過程

黑褐色物質(zhì)的采集

用無菌采樣棉簽挑取覆蓋在鐘乳石表面的黑褐色物質(zhì)適量，轉(zhuǎn)入無菌處理的采樣瓶中，密封后低溫保存于裝有冰袋的保溫盒內(nèi)，帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

黑褐色物質(zhì)的初步顯微觀察

將黑褐色物質(zhì)用無菌生理鹽水適當稀釋后，取100uL涂布在載玻片并置于載物臺上；調(diào)節(jié)顯微鏡直至視野內(nèi)看到清晰的物像，拍照記錄；更換油鏡，在要觀察的位置上滴加1滴香柏油，再反復(fù)調(diào)節(jié)至看清楚標本止，拍照記錄。

微生物的分離純化

Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基平板的制備

分別稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g，加蒸餾水定容至1L，于115℃高壓滅菌30min。冷卻至50℃左右后，在超凈臺上倒制平板，完成后存放于4℃冰箱備用。

微生物的分離培養(yǎng)及初步篩選

在超凈工作臺上稱取適量黑褐色物質(zhì)，加入1 mL無菌水，用移液器反復(fù)吹吸，直至樣品混合均勻。取1000uL加到盛有9000uL無菌水的離心管內(nèi)，稀釋10倍制成稀釋度為10的懸液。同法按每級稀釋10倍的次序得到10、10的稀釋液。用移液器分別吸取10、10、10倍稀釋液100uL涂布于LB平板上，25℃倒置培養(yǎng)。

分離微生物的純化

在超凈工作臺上，從涂布平板上選取大小和形態(tài)各不相同的單菌落，用接種環(huán)在其表面挑取少量菌體，在平板上劃線。將劃線后的LB平板放于25℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)。

分離微生物的革蘭氏染色及觀察

先用草酸銨結(jié)晶紫進行初染，再用盧革式碘液媒染，然后用95%乙醇脫色，最后用番紅溶液復(fù)染。用吸水紙吸掉載玻片上水膜，待染色標本干燥后置光學(xué)顯微鏡下觀察，方法同上。

分離微生物菌株的保藏

用無菌牙簽在分離良好的菌落表面挑取少許樣品，投入裝有LB培養(yǎng)液的試管中，蓋上管塞，于25℃、200rpm振蕩培養(yǎng)10h。用移液器吸取培養(yǎng)物850uL，加入盛有150uL無菌甘油的冷凍管中，混合均勻，置-70℃冷凍保藏。

分離菌株的透射電鏡觀察

取100uL培養(yǎng)24h后的菌液于無菌離心管中，滴加100uL2%磷酸鎢染色液于樣品中混勻。染色20min后，用銅網(wǎng)取樣后晾干，交給教師放置于電鏡樣品室內(nèi)進行觀察照相。

實驗結(jié)果

黑褐色物質(zhì)特征

黑褐色樣品外觀黏稠，手感滑膩，有腐臭味。光學(xué)顯微鏡觀察顯示其中含有類似微生物細胞的深色不規(guī)則顆粒物和桿狀物。

黑褐色物質(zhì)稀釋培養(yǎng)

在LB培養(yǎng)基中對黑褐色物質(zhì)中的微生物進行了分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基上沿劃線痕跡處形成了菌落，其分布由密集逐步稀疏，最后形成獨立的單菌落。根據(jù)菌落形態(tài)大小的差異，我們分離獲得了4株微生物，分別命名為H1、H2、H3和H4（見圖2）。

分離菌株初步染色觀察

對分離純化的菌株進行革蘭氏染色，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察顯示，4株菌株細胞形態(tài)各異，均顯示為紫色，表明分離獲得的菌株可能為來自不同種屬的革蘭氏陽性細菌。

透射電鏡觀察

與光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果一致，透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示4株細菌體外均被莢膜包裹（見圖3），且部分菌株有長鞭毛。

討論

太極洞景區(qū)的壺天宮曾被開發(fā)用于洞藏白酒原酒。然而，隨著貯酒年份的增加，洞內(nèi)鐘乳石表面逐漸生成一層黏稠物質(zhì)。隨著時間延長，該物質(zhì)的顏色發(fā)生變化，致使鐘乳石由原初的乳白色變?yōu)楹诤稚Ｈ绾涡迯?fù)受損的鐘乳石成為景區(qū)亟待解決的難題。因此，探索壺天宮貯酒后鐘乳石變黑成因，不僅可為該景點的修復(fù)提供理論依據(jù)，也可為其他溶洞資源的開發(fā)利用和保護管理提供科學(xué)指導(dǎo)。不同于相關(guān)溶洞中鐘乳石污染的報道，在壺天宮用于貯藏白酒原酒的2年問，洞內(nèi)鐘乳石表層逐漸被一層黑褐色的黏稠物質(zhì)包裹?？梢酝茢?，黑褐色物質(zhì)的形成與貯酒行為直接相關(guān)。對鐘乳石上黑褐色黏稠物質(zhì)的顯微鏡檢查結(jié)果顯示，黏稠物質(zhì)中包含少量細菌和疑似微生物細胞碎片物，提示黑褐色物質(zhì)可能來源于微生物。然而，實驗室培養(yǎng)條件下的微生物細胞及裂解物均為無色或其他顏色，并非目前所見的黑褐色黏稠物質(zhì)。如果黑褐色物質(zhì)來源于微生物，它們是怎樣形成的呢？

結(jié)合溶洞的生態(tài)環(huán)境和觀察的實驗結(jié)果，推測黑褐色物質(zhì)的形成過程如下：溶洞內(nèi)環(huán)境相對封閉，經(jīng)過長時間的自然修飾和適應(yīng)，形成了穩(wěn)定、獨特的微生態(tài)環(huán)境，各種生物特別是微生物之間相互制約，處于平衡狀態(tài)。在寡營養(yǎng)、高濕度、低氣溫條件下，溶洞內(nèi)微生物生長緩慢，總量處于較低水平，覆蓋在鐘乳石表面的微生物及其裂解產(chǎn)物可被溶洞環(huán)境及時有效轉(zhuǎn)化，或（和）被新形成的鐘乳石覆蓋，雖經(jīng)幾萬甚至幾十萬年時間，鐘乳石表面依舊呈現(xiàn)天然乳白色。

然而，當白酒原酒貯藏于相對封閉的溶洞后，酒壇內(nèi)易揮發(fā)的酒精等物質(zhì)就會逐漸擴散積累，濃度不斷增大，加之高濕環(huán)境，大量的揮發(fā)物質(zhì)隨水蒸氣凝結(jié)在洞內(nèi)石山、石乳、石罩等之上，為微生物的生長提供了充足營養(yǎng)，導(dǎo)致某些類群的微生物大量過度繁殖；而另一些類群的微生物則逐漸處于劣勢，甚至死亡，從而改變了原有微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物之間及微生物與環(huán)境之間的平衡遭到破壞。最終，由于過量繁殖的微生物及其裂解產(chǎn)物無法完全被環(huán)境轉(zhuǎn)化，于是不斷積累在鐘乳石表面，其中含有的脂肪、碳水化合物等物質(zhì)，在空氣中氧的作用下，逐漸變黑，并與水混合，形成黑褐色黏稠物質(zhì)。

該項目獲得第30屆全國青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競賽項目中學(xué)組微生物學(xué)一等獎。

專家評語

該項目從開始的好奇探究到思考，符合中學(xué)生的思維和知識水平。研究內(nèi)容合理，技術(shù)方法規(guī)范，有地方特色。建議利用分離的菌株進一步侵染鐘乳石，模擬洞中的條件，以驗證本項目分離鑒定出的微生物是否為鐘乳石變色的原因。